Cultura e Imagem de Cortes Extraviais de Tumor Organotípico de Pseudomixoma Peritonei Ex Vivo de Espécimes Tumorais Humanos Ressecados
Summary
Descrevemos um protocolo para produção, cultura e visualização de cânceres humanos com metástase para as superfícies peritoneais. Os espécimes tumorais ressecados são cortados com vibratótomo e cultivados em insertos permeáveis para aumento da oxigenação e viabilidade, seguidos de análises de imagem e a jusante usando microscopia confocal e citometria de fluxo.
Abstract
O pseudomixoma peritoneal (PMP) é uma condição rara que resulta da disseminação de um tumor primário mucinoso e do consequente acúmulo de células tumorais secretoras de mucina na cavidade peritoneal. A PMF pode surgir de vários tipos de cânceres, incluindo apendicular, ovariano e colorretal, embora as neoplasias do apêndice sejam de longe a etiologia mais comum. O PMP é desafiador de estudar devido à sua (1) raridade, (2) modelos murinos limitados e (3) histologia mucinosa e acelular. O método aqui apresentado permite a visualização e interrogação em tempo real desses tipos tumorais utilizando cortes organotípicos ex vivo derivados do paciente em uma preparação onde o microambiente tumoral (TME) permanece intacto. Neste protocolo, primeiramente descrevemos o preparo de fatias tumorais utilizando um vibratomo e posterior cultura a longo prazo. Em segundo lugar, descrevemos imagens confocais de cortes tumorais e como monitorar leituras funcionais de viabilidade, imagens de cálcio e proliferação local. Em suma, as fatias são carregadas com corantes de imagem e são colocadas em uma câmara de imagem que pode ser montada em um microscópio confocal. Vídeos com lapso de tempo e imagens confocais são usados para avaliar a viabilidade inicial e a funcionalidade celular. Este procedimento também explora o movimento celular translacional e as interações de sinalização parácrina na EMT. Por fim, descrevemos um protocolo de dissociação de cortes tumorais a serem utilizados para análise por citometria de fluxo. A análise quantitativa por citometria de fluxo pode ser usada para testes terapêuticos de bancada para leito para determinar as mudanças que ocorrem na paisagem imune e no conteúdo das células epiteliais.
Introduction
O pseudomixoma peritoneal (PMP) é uma síndrome rara, com incidência de 1 por milhão de pessoas porano1. A maioria dos casos de PMF é causada por metástases de neoplasias do apêndice. Dado que os ratos não têm um apêndice semelhante ao humano, modelar este tipo de cancro continua a ser extremamente desafiante. Embora a doença primária seja frequentemente curável por ressecção cirúrgica, as opções de tratamento para doença metastática são limitadas. Portanto, a justificativa para o desenvolvimento deste novo modelo de fatiamento organotípico é estudar a patobiologia da PMP. Até o momento, não existem modelos organoides apendiculares que possam ser perpetuamente cultivados; entretanto, um modelo recente mostrou-se útil para o teste farmacológico de agentes terapêuticos eimunoterapia2. Para tanto, adaptamos um sistema de cultura organotípica de fatias que tem sido utilizado em outros tipos de cânceres humanos, como cérebro, mama, pâncreas, pulmão, ovário, entre outros3,4,5,6.
Além das neoplasias do apêndice, a PMF ocasionalmente resulta de outros tipos de tumores, incluindo cânceres ovarianos7 e, em raras circunstâncias, neoplasias mucinosas papilares intraductais8 e câncer de cólon9. Além disso, esses tumores tendem a crescer lentamente, com baixas taxas de enxerto em modelos de xenoenxerto derivado do paciente (PDX)10,11. Diante desses desafios, há uma necessidade não atendida de desenvolver modelos para estudar essa doença para começar a entender a fisiopatologia da PMP e como essas células cancerígenas são recrutadas para as superfícies peritoneais, proliferam e escapam da vigilância imunológica.
Embora cortados da circulação vascular sistêmica, os cortes tumorais contêm componentes celulares e acelulares, incluindo a matriz extracelular, células estromais, células imunes, células cancerosas, células endoteliais e nervos. Esse microambiente semi-intacto permite a investigação funcional desses tipos celulares, o que é excepcionalmente vantajoso em relação às culturas organoides 3D, que consistem apenas de célulascancerígenas12. Embora as culturas organotípicas de corte sejam vantajosas em alguns aspectos, elas também são inerentemente uma abordagem baseada em baixo rendimento, em comparação com organoides 3D, que podem ser expandidos e são adequados para triagem de drogas terapêuticas investigativas multiplexadas13,14,15. No caso da PMP, não há relatos documentando o estabelecimento confiável e a passagem perpétua de organoides derivados da PMP16. Isso provavelmente se deve à natureza de crescimento lento das células tumorais derivadas do PMP, bem como ao baixo número de células epiteliais malignas encontradas dentro desses tumores mucinosos. Dada a necessidade de desenvolver modelos para estudar PMF, fatias organotípicas são especialmente adequadas para estudar esta doença. Apresentamos um protocolo para preparação, aquisição de imagens e análise de PMP de espécimes humanos.
Protocol
Representative Results
Discussion
Este manuscrito descreve uma técnica que pode ser usada para cultura, interrogação e análise de espécimes tumorais de pseudomixoma peritoneal humano (PMP). Utilizamos numerosos ensaios funcionais a jusante para interrogar o microambiente imune do tumor e uma plataforma para testes de bancada para leito.
Embora o método seja altamente eficiente em nossas mãos, será necessária alguma prática para cortar espécimes tumorais usando um vibratome. Ou seja, encontramos problemas que foram d…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Os autores gostariam de agradecer a Kersi Pestonjamasp da instalação do núcleo de imagem do Moores Cancer Center pela ajuda com os microscópios UCSD Specialized Cancer Support Center P30 grant 2P30CA023100. Este trabalho foi adicionalmente apoiado por uma bolsa de publicação JoVE (JRW), bem como generosos presentes do espólio de Elisabeth e Ad Creemers, da Euske Family Foundation, do Gastrointestinal Cancer Research Fund e do Peritoneal Metastasis Research Fund (AML).
Materials
| 1 M CaCl2 solution | Sigma | 21115 | |
| 1 M HEPES solution | Sigma | H0887 | |
| 1 M MgCl2 solution | Sigma | M1028 | |
| 100 micron filter | ThermoFisher | 22-363-549 | |
| 22 x 40 glass coverslips | Daiggerbrand | G15972H | |
| 3 M KCl solution | Sigma | 60135 | |
| 5 M NaCl solution | Sigma | S5150 | |
| ATPγS | Tocris | 4080 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma | A2153 | |
| Calcein-AM | Invitrogen | L3224 | |
| CD11b | Biolegend | 101228 | |
| CD206 | Biolegend | 321140 | |
| CD3 | Biolegend | 555333 | |
| CD4 | Biolegend | 357410 | |
| CD45 | Biolegend | 304006 | |
| CD8 | Biolegend | 344721 | |
| CellTiter-Glo | Promega | G9681 | |
| DMEM | Thermo Fisher | 11965084 | |
| DPBS | Sigma Aldrich | D8537 | |
| FBS, heat inactivated | ThermoFisher | 16140071 | |
| Fc-block | BD Biosciences | 564220 | |
| Fluo-4 | Thermo Fisher | F14201 | |
| Gentle Collagenase/Hyaluronidase | Stem Cell | 7912 | |
| Imaging Chamber | Warner Instruments | RC-26 | |
| Imaging Chamber Platform | Warner Instruments | PH-1 | |
| LD-Blue | Biolegend | L23105 | |
| L-Glutamine 200 mM | ThermoFisher | 25030081 | |
| LIVE/DEAD imaging dyes | Thermofisher | R37601 | |
| Nikon Ti microscope | Nikon | Includes: A1R hybrid confocal scanner including a high-resolution (4096×4096) scanner, LU4 four-laser AOTF unit with 405, 488, 561, and 647 lasers, Plan Apo 10 (NA 0.8), 20X (NA 0.9) dry objectives. | |
| Peristaltic pump | Isamtec | ISM832C | |
| Propidium Iodide | Invitrogen | L3224 | |
| Vacuum silicone grease | Sigma | Z273554-1EA |
References
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