Summary
Hier presenteren we een protocol om geïsoleerde individuele nematoden op vaste media te kweken voor levenslange fysiologische parametertracking en fluorescentiekwantificering. Dit kweeksysteem omvat een palmitinezuurbarrière rond putten met één worm om te voorkomen dat dieren vluchten, waardoor aversieve interventies mogelijk zijn, waaronder pathogene bacteriën en chemische stressoren.
Abstract
Caenorhabditis elegans worden veel gebruikt om verouderingsbiologie te bestuderen. De standaardpraktijk in C. elegans verouderingsstudies is het kweken van groepen wormen op vaste nematodengroeimedia (NGM), waardoor de efficiënte verzameling van gegevens op populatieniveau voor overleving en andere fysiologische fenotypen mogelijk is, en periodieke bemonstering van subpopulaties voor fluorescerende biomarkerkwantificering. Beperkingen van deze aanpak zijn het onvermogen om (1) individuele wormen in de loop van de tijd te volgen om leeftijdstrajecten te ontwikkelen voor fenotypes van belang en (2) fluorescerende biomarkers direct in de context van de kweekomgeving te monitoren. Alternatieve kweekbenaderingen gebruiken vloeibare cultuur of microfluïdica om individuele dieren in de loop van de tijd te volgen, in sommige gevallen inclusief fluorescentiekwantificering, met de afweging dat de kweekomgeving contextueel verschilt van vaste NGM. De WorMotel is een eerder beschreven microfabricated multi-well apparaat voor het kweken van geïsoleerde wormen op vaste NGM. Elke worm wordt bewaard in een put met vaste NGM omgeven door een gracht gevuld met kopersulfaat, een contactafweermiddel voor C. elegans, waardoor longitudinale monitoring van individuele dieren mogelijk is. We vinden kopersulfaat onvoldoende om te voorkomen dat wormen vluchten wanneer ze worden blootgesteld aan aversieve interventies die vaak voorkomen in verouderingsonderzoek, waaronder dieetbeperking, pathogene bacteriën en chemische agentia die cellulaire stress veroorzaken. De multi-well apparaten zijn ook gegoten uit polydimethylsiloxaan, dat hoge achtergrondartefacten produceert in fluorescentiebeeldvorming. Dit protocol beschrijft een nieuwe aanpak voor het kweken van geïsoleerde rondwormen op vaste NGM met behulp van in de handel verkrijgbare polystyreenmicrotrays, oorspronkelijk ontworpen voor humane leukocytenantigeenantigeen (HLA) typering, waardoor de overleving, fysiologische fenotypen en fluorescentie gedurende de levensduur kunnen worden gemeten. Een palmitinezuurbarrière voorkomt dat wormen vluchten, zelfs in de aanwezigheid van aversieve omstandigheden. Elke plaat kan tot 96 dieren kweken en past zich gemakkelijk aan verschillende omstandigheden aan, waaronder dieetbeperkingen, RNAi en chemische additieven, en is compatibel met geautomatiseerde systemen voor het verzamelen van levensduur- en activiteitsgegevens.
Introduction
C. elegans zijn een krachtig modelorganisme voor onderzoek in de genetica, cellulaire biologie en moleculaire biologie, omdat ze gemakkelijk in het laboratorium kunnen worden gekweekt, een korte generatietijd en levensduur hebben, een hoge mate van eiwit homologie delen met zoogdieren en een transparante lichaamsstructuur hebben die in vivo visualisatie van fluorescerende eiwitten en kleurstoffen mogelijk maakt1. Als gevolg van het langdurige gebruik van C. elegans als een belangrijk modelsysteem op een reeks gebieden, waaronder ontwikkelingsbiologie en veroudering, zijn hun groei en ontwikkeling goed begrepen, is hun genoom volledig gesequenced en zijn er een groot aantal krachtige genetische hulpmiddelen gecreëerd, waaronder genoombrede RNAi-voedingsbibliotheken en duizenden mutante en transgene stammen. Historisch gezien worden C. elegans gekweekt als populaties op vaste agarnematodengroeimedia (NGM) en fenotypen worden handmatig geëvalueerd door directe observatie of door beeldvorming en downstream-analyse. Fluorescerende microscopie wordt gebruikt om een verscheidenheid aan moleculaire fenotypes vast te leggen met behulp van kleurstoffen of transgeen tot expressie gebrachte fluorescerende tags in individuele C. elegans. Fluorescerende beeldvorming omvat meestal het fixeren of verlammen van een dier op dia's met dunne agarose-pads, wat invasief en vaak dodelijk is. Het omvat ook het gebruik van chemicaliën, zoals levamisol of natriumazide, die mogelijk het moleculaire proces van belang kunnen verstoren 2,3. Samen maken deze benaderingen het mogelijk om cross-sectionele gegevens op populatieniveau te verzamelen over een breed scala aan fenotypen, maar maken ze het niet mogelijk om individuele dieren in de loop van de tijd te volgen.
In de afgelopen jaren zijn er verschillende benaderingen ontstaan om geïsoleerde C. elegans te cultiveren, waardoor onderzoekers dynamische veranderingen in fysiologische en moleculaire fenotypen van dieren in de loop van de tijd kunnen vastleggen met behulp van nieuwe beeldvormingstechnologieën. Een categorie van C. elegans cultuurbenadering is microfluïdica-apparaten, waaronder WormFarm4, de Nemalife-chip5 en de 'gedrags'-chip van Chronis et al.6, naast verschillende andere 7,8,9. Hieraan gerelateerd zijn op vloeistof gebaseerde kweekmethoden, die multi-well platen gebruiken om individuele wormen of kleine populaties in de loop van de tijd te karakteriseren10,11. Microfluïdica en microplaatsystemen bieden uitstekende kwantitatieve metingen van fenotypische reacties in C. elegans tot een enkel dier, maar de kweekomgeving vertoont een belangrijke beperking. De overgrote meerderheid van het eerdere onderzoek naar C. elegans, met name op het gebied van veroudering, is voltooid op vaste agar-gebaseerde media. Vloeibare cultuur zorgt ervoor dat C. elegans continu zwemmen en vertegenwoordigt een verschillende omgevingscontext die de onderliggende biologie kan veranderen. Dieren gekweekt in vloeibare media hebben bijvoorbeeld het vetgehalte en de genexpressie drastisch veranderd - met name voor genen die betrokken zijn bij de stressrespons - ten opzichte van dieren gekweekt op agar-gebaseerde vaste stof NGM12,13. Een alternatieve categorie van beeldvormingsmethoden voor één dier omvat polydimethylsiloxaan (PDMS) -apparaten die individuele dieren isoleren op vaste media, in een poging om de standaardomgeving die wordt ervaren door wormen gekweekt op vaste NGM in groepscultuur op petrischolen beter na te bootsen. De WorMotel is een 240-well PDMS-apparaat dat is ontworpen om individuele dieren op vaste media te kweken. Elke put is gevuld met een gemodificeerde NGM met behulp van laagsmeltende agarose in plaats van agar en bezaaid met bacterieel voedsel, waardoor een solide mediaomgeving ontstaat die vergelijkbaar is met het meest voorkomende kweeksysteem met petriplaten. De wanden van de put zijn rond, waardoor elk dier kan worden afgebeeld, ongeacht de locatie in de put (waardoor de visuele verduistering wordt vermeden die wordt veroorzaakt door een dier in de buurt van een muur in een plaat met meerdere putten). Kopersulfaat in een smalle gracht rond elke put wordt gebruikt als afschrikmiddel om dieren in hun putten te houden14,15. Een beperking van deze aanpak is dat het kopersulfaat niet effectief is in het voorkomen dat wormen vluchten wanneer aversieve omgevingsomstandigheden aanwezig zijn, waaronder dieetbeperking, pathogene bacteriën of chemicaliën die cellulaire stress veroorzaken (bijv. Paraquat).
Een tweede systeem dat vaste media gebruikt, is de Worm Corral, die een hydrogel gebruikt om een kleine afgesloten omgeving te creëren voor elke worm op een dia, waardoor langdurige monitoring van individueel geïsoleerde dieren mogelijk is16. Een belangrijke beperking is dat dieren als eieren in het milieu moeten worden verzegeld, waardoor het gebruik van steriele dieren vereist is om voortplanting te voorkomen en medicamenteuze behandelingen worden beperkt tot één enkele toepassing. Multi-dosis medicijnproeven kunnen worden bereikt in het WorMotel, hetzij door meerdere blootstellingsrondes uit te voeren voorafgaand aan het overbrengen van wormen naar het apparaat of door tijdens het experiment topisch extra geneesmiddelen aan de putten toe te voegen; In het laatste geval is de werkelijke blootstellingsdosis na het toevoegen van een extra medicijn aan een bestaande put echter moeilijk precies te kwantificeren en hangt het af van hoe snel het medicijn afbreekt. Zowel het WorMotel als de Worm Corral zijn uitstekend geschikt voor brightfield- of darkfield-beeldvorming om informatie vast te leggen met betrekking tot activiteit en dierfysiologie (bijv. Groei en ontwikkeling). Hoewel deze systemen kunnen worden gebruikt om fluorescentie te monitoren, is onze ervaring dat het PDMS dat wordt gebruikt om de andere beeldvormingstechnologieën met één worm te maken, gevoelig voor het vormen van microbubbels, het vastleggen van deeltjes en andere kleine afwijkingen die onregelmatige fluorescerende artefacten genereren die interfereren met consistente fluorescentievisualisatie en kwantificering, vooral in het emissiebereik voor GFP, de meest voorkomende fluorofoor die wordt gebruikt in C. elegans-onderzoek. Tot op heden is live fluorescentiebeeldvorming van C. elegans individuele dieren op een longitudinale manier voornamelijk afhankelijk van microfluïdica-apparaten17.
Hier beschrijven we een nieuwe methode voor het kweken van individuele C. elegans op vaste media die compatibel is met zowel aversieve interventies als directe fluorescerende beeldvorming. Deze aanpak is qua concept vergelijkbaar met andere beeldvormingstechnologieën met één worm, behalve dat de op maat gemaakte PDMS-chip wordt vervangen door in de handel verkrijgbare polystyreenmicrotrays die oorspronkelijk zijn ontwikkeld voor microcytotoxiciteitstests (ook vaak Terasaki-trays genoemd)18. Deze microtrays zijn voorzien van putten die kunnen worden gevuld met vaste media en bezaaid met bacterieel voedsel, waarbij de omgeving die dieren ervaren nauw wordt nagebootst volgens de standaard vaste NGM-cultuurmethodologie. Elke put is omgeven door een aversieve barrière van palmitinezuur in plaats van kopersulfaat. Palmitinezuur wordt vaak gebruikt om te voorkomen dat wormen vaste media ontvluchten, met behulp van standaard groepscultuur op petrischlaten in experimenten waarbij wormen worden uitgedaagd met een aversieve omgeving zoals dieetbeperking of blootstelling aan een chemische stressor. De microtrays produceren ook een minimale en consistente fluorescerende achtergrond, waardoor fluorescerende beeldvorming van dieren direct in hun kweekomgeving mogelijk is. Dit nieuwe op vaste agar gebaseerde kweeksysteem voor één dier maakt het niet alleen mogelijk om individuele dieren gedurende het hele leven te volgen en groei, ontwikkeling, activiteit en levensduur te volgen, maar is ook compatibel met directe fluorescerende microscopie. Omdat de wormen kunnen worden afgebeeld zonder verlamming of fixatie, kunnen in vivo fluorescentiebiomarkers longitudinaal worden gekwantificeerd in individuele dieren die op hun kweekmedia blijven, waardoor dynamische veranderingen gedurende de levensduur van elk dier kunnen worden waargenomen. Dit cultuursysteem is ook compatibel met de huidige generatie geautomatiseerde systemen voor het bijhouden van de levensduur en andere gezondheidsstatistieken14,19. We bieden een gedetailleerd protocol voor het kweken van individuele C. elegans in dit op microtrays gebaseerde systeem, bespreken mogelijke valkuilen en probleemoplossing en bespreken de voordelen en beperkingen ten opzichte van andere systemen, en in het bijzonder een bijgewerkt en geoptimaliseerd WorMotel-protocol15.
Elke kweekomgeving met één worm bestaat uit een microtray die in een standaard lade met één put is gemonteerd met behulp van een aangepaste 3D-geprinte adapter (figuur 1A). De putten zijn gevuld met laagsmeltende agarose-nematodengroeimedia (lmNGM), bezaaid met geconcentreerde bacteriën als voedselbron en omgeven door een palmitinezuurcoating om te voorkomen dat wormen vluchten (figuur 1B). De ruimte tussen de microtray en de wanden van de single-well plaat is gevuld met verzadigde waterkristallen om de luchtvochtigheid te handhaven (figuur 1B). Op het deksel van de tray wordt een reinigingscoating aangebracht om condensatie te voorkomen. Aan elke put wordt een enkele worm toegevoegd en de lade met één put wordt afgesloten met Parafilm om vocht te behouden en zuurstofuitwisseling mogelijk te maken. Tot zes microtrays kunnen redelijkerwijs parallel worden bereid door een enkele geoefende onderzoeker.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Recepten
OPMERKING: Bereid voorraadoplossingen voor voordat u begint met de voorbereiding van microtrayplaten.
- Voorraadoplossingen voor laagsmeltende agarose-nematodengroeimedia (lmNGM)
- Bereid 1 MK2 HPO4 door 174,18 g K2HPO4 op te lossen in 1 L steriel gedeïoniseerd water in een fles van 1 L. Autoclaaf de oplossing bij 121 °C, 15 psi, gedurende 30 minuten en bewaar deze bij kamertemperatuur (RT).
- Bereid 1 M KPi (pH 6,0) door 136,09 g KH2HPO4 op te lossen in 1 L steriel gedeïoniseerd water in een fles van 1 L. Titreer de oplossing met 1 M K2HPO4 om een pH van 6,0 te bereiken. Autoclaaf de oplossing bij 121 °C, 15 psig, gedurende 30 minuten en bewaar deze bij RT.
- Bereid 1 M CaCl 2 door 73,5 g CaCl2 op te lossen in 500 ml steriel gedeïoniseerd water in een fles van 500 ml. Autoclaaf de oplossing bij 121 °C, 15 psig, gedurende 30 min en bewaar deze bij RT
- Bereid 1 M MgSO 4 door 123,25 g MgSO4 op te lossen in 500 ml steriel gedeïoniseerd water in een fles van 500 ml. Autoclaaf de oplossing bij 121 °C, 15 psig, gedurende 30 minuten en bewaar deze bij RT.
- Bereid 3 M NaCl voor lmNGM: Combineer in een schone fles van 100 ml 100 ml ultrapuur water en 18,20 g NaCl. Autoclaaf bij 121 °C, 15 psig, gedurende 30 min.
- Bereid 5 mg / ml cholesterol door 2,5 g cholesterol, 275 ml 100% ethanol en 25 ml steriel gedeïoniseerd water in een amberkleurige fles van 500 ml te combineren. Autoclaaf de oplossing bij 121 °C, 15 psig, gedurende 30 minuten en bewaar deze bij RT.
- Bereid 50 mM fluorodeoxyuridine (FUdR) door 0,1231 g FUdR op te lossen in 10 ml steriel gedeïoniseerd water in een conische buis van 15 ml. Gebruik een spuit van 10 ml en een filter van 0,22 μm om de oplossing te steriliseren. Aliquoteer 1 ml van de oplossing elk in 10 microcentrifugebuizen en bewaar deze bij -20 °C.
- Bereid 50 mg/ml carbenicilline door 500 mg carbenicilline op te lossen in 10 ml steriel gedeïoniseerd water in een conische buis van 15 ml. Gebruik een spuit van 10 ml en een filter van 0,22 μm om de oplossing te steriliseren. Aliquoteer 1 ml van de oplossing elk in 10 microcentrifugebuizen en bewaar deze bij -20 °C.
- Bereid 1 mM isopropyl ß-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) door 2,38 g IPTG op te lossen in 10 ml steriel gedeïoniseerd water in een conische buis van 15 ml. Gebruik een spuit van 10 ml en een filter van 0,22 μm om de oplossing te steriliseren. Aliquoteer 1 ml van de oplossing elk in 10 microcentrifugebuizen en bewaar deze bij -20 °C.
- Bereid 100 mg/ml ampicilline door 1 g ampicilline op te lossen in 10 ml steriel gedeïoniseerd water in een conische buis van 15 ml. Gebruik een spuit van 10 ml en een filter van 0,22 μm om de oplossing te steriliseren. Aliquot 1 ml van de 100 mg/ml ampicilline-oplossing elk in 10 microcentrifugebuizen en bewaar de buisjes bij -20 °C.
- Voorbereiding van nematodengroeimedia (NGM) voor algemeen onderhoud van C. elegans
- Om 50 platen te maken, lost u 10 g Bacto-agar, 1,5 g NaCl en 1,25 g Bacto-pepton op in 486 ml ultrapuur water in een kolf van 1 L. Steriliseer het medium door het te autoclaveren op een vloeistofcyclus bij 121 °C, 15 psig, gedurende ten minste 30 minuten.
- Laat het medium na de autoclaaf afkoelen tot 55 °C. Voeg vervolgens 12,5 ml 1 M KPi, 500 μl 1 M MgSO4, 500 μl 1 M CaCl2 en 500 μl 5 mg/ml cholesterol toe aan de oplossing.
- Giet met behulp van een steriele techniek 10 ml van het in stap 1.2.2 bereide medium in elke plaat van 60 mm (50 in totaal). Laat de platen met media minstens 30 minuten stollen. Pipetteer 300 μL van de 's nachts gekweekte bacteriecultuur op het midden van de plaat en laat de plaat op de bank liggen. Laat de cultuur drogen en dikker worden gedurende 1-2 dagen. Bewaar deze NGM-platen met bacteriën bij 4 °C.
- Bereiding van lmNGM-voormengsel
- Combineer in een erlenmeyer van 250 ml 2 g smeltarme agarose, 0,25 g pepton, 1 ml 3 M NaCl en 99 ml ultrapuur water. Autoclaaf de oplossing bij 121 °C, 15 psig, gedurende 30 min.
- Aliquot 10 ml lmNGM in reageerbuizen en dek af met Parafilm om verlies van vloeistof te voorkomen. Sluit de buizen af en laat ze afkoelen en stollen.
- Bereid 85 mM NaCl voor bacterieel voedsel: Combineer in een fles van 100 ml 515,61 mg NaCl en vul tot 100 ml met ultrapuur water. Autoclaaf bij 121 °C, 15 psig, gedurende 30 min.
- Bereid waterabsorberende polyacrylamidekristallen door 1 g type S superabsorberend polymeer op te lossen in 150 ml ultrapuur water in een autoclaveerbare knijpfles. Knip de punt om een voldoende doseermaat te garanderen. Autoclaaf bij 121 °C, 15 psig, gedurende 30 min, dop met tinfoil en schud om de kristallen te mengen.
- Bereid een reinigingsmiddeloplossing door 3 ml 100% Tween-20 te combineren met 7 ml ultrapuur water in een conische injectieflacon van 15 ml.
- Bereid 5 mg / ml cholesterol door 2,5 g cholesterol, 275 ml 100% EtOH en 25 ml ultrapuur water in een fles van 500 ml te combineren.
- Bereid palmitinezuur werkoplossing
- Maal 500 mg vast palmitinezuur in een vijzel en stamper en combineer het met 15 ml Tween-20 in een conische injectieflacon van 50 ml. Meng door vortexing, waarbij zoveel mogelijk van de kristallen worden opgelost.
- Voeg 17,5 ml 100% ethanol toe en vortex de oplossing om zoveel mogelijk palmitinezuur op te lossen.
- Voeg 17,5 ml ultrapuur water en vortex rigoureus toe. Verwarm de oplossing voorzichtig in een kralenbad op 80 °C totdat het palmitinezuur volledig is opgelost. Sommige palmitinezuur kan neerslaan tijdens het afkoelen.
- Bereid lysogene bouillon (LB) door 20 g LB-poeder te mengen in 1 L gedeïoniseerd water in een bekerglas van 1 L of groter. Aliquot 500 ml van de bouillon in twee bekers van 500 ml. Autoclaaf de bouillon bij 121 °C, 15 psig, gedurende 30 min. Bewaar de bereide bouillon bij RT.
- Bereiding van lysogenie bouillon (LB) agar platen
- Meng 10 g LB-poeder en 7,5 g Bacto-agar in 500 μL gedeïoniseerd water in een kolf van 1 L. Autoclaaf de oplossing op een vloeistofcyclus bij 121 °C, 15 psig, gedurende 30 minuten.
- Voeg indien gewenst optionele antibiotica (500 μL of 100 μg/ml ampicilline) toe nadat de geautoclaveerde media zijn afgekoeld tot 55 °C. Maak met behulp van een steriele techniek LB-agarplaten door 20 ml media in elke plaat van 100 mm te gieten (25 in totaal). Bewaar de borden bij 4 °C.
2. Het voorbereiden van een populatie van leeftijdsgesynchroniseerde wormen
- Bereid een populatie van leeftijdsgesynchroniseerde wormen voor die klaar zijn om toe te voegen aan de microtray in larvale stadium 4 (L4). Als alternatief kunnen wormen in elke levensfase worden toegevoegd (FUdR moet worden uitgesloten van de microtraymedia als wormen worden toegevoegd in een ontwikkelingsstadium eerder dan L4 om ontwikkelingsstilstand te voorkomen).
OPMERKING: Deze stap moet 2 dagen voordat de wormen aan de microtray worden toegevoegd worden voltooid als de beoogde levensfase aan het begin van het experiment L4 is. De synchronisatietiming kan worden aangepast om de wormen de gewenste levensfase te laten bereiken. - Temperatuur kan van invloed zijn op de levensduur. Gebruik voor consistente resultaten standaard NGM-platen (zie rubriek 1) om C. elegans op 20 °C te houden en breng wormen over op verse platen als ze weinig bacterieel voedsel bevatten.
- Gebruik van de stamplaten met veel jongvolwassen wormen een standaardbenadering om een leeftijdsgesynchroniseerde populatie te genereren, meestal20 bleken of getimede eieren leggen21.
- Isoleer de eieren en voeg ze toe aan een met bacteriën gevlekte NGM-plaat. Bij gebruik van wild-type C. elegans, zullen de eieren uitkomen en wormen vormen, waardoor het L4-larvale stadium in 2 dagen wordt bereikt.
3. Bereiding van bacteriecultuur
- De dag voor het begin van het experiment, ent u de gewenste bacteriële voedselbron. Bereid ~ 5 ml bacteriecultuur per plaat.
OPMERKING: De bacteriële streep kan tot 1 maand van tevoren worden bereid en bij 4 °C worden bewaard voor E. coli-voedselbron.- Streep bacteriën voor enkele kolonies op de LB-agarplaat van een bevroren glycerolvoorraad.
- Kweek de cultuur een nacht op 37 °C.
- Ent vloeibare LB-bouillon met een enkele kolonie per inenting.
- Schud bij ~250 rpm bij 37 °C gedurende 12-16 uur.
4. Palmitinezuurcoating aanbrengen op microtray
OPMERKING: Palmitinezuur dient als een aversieve barrière om het vluchten van dieren uit de individuele putten te voorkomen. De coating wordt aangebracht op het gehele bodemoppervlak van de microtray, met uitzondering van de binnenoppervlakken van de putten. Nystatine wordt toegevoegd aan het palmitinezuur om schimmelbesmetting te verminderen. Deze stap kan indien gewenst 1 dag voor de start van het experiment worden voltooid.
- Stel het kralenbad in op 80 °C om de tijd te geven om voor te verwarmen.
- Onmiddellijk voor gebruik, aliquoteer 1 ml van de palmitinezuurwerkoplossing per microtray in een afzonderlijke steriele container (meestal een conische injectieflacon van 15 ml) en voeg 4 μL van 10.000 eenheden / ml nystatine per 1 ml palmitinezuuroplossing toe vóór verhitting.
- Spuit binnen en buiten de microtray met ethanol (70% of meer) tot verzadiging en schud de overtollige ethanol af.
OPMERKING: Resterende ethanol moet verdampen tijdens de behandeling in UV-crosslinking (stap 4.4). - Gebruik een UV-crosslinker om de microtray te steriliseren (de volgende instructies zijn voor de UV-crosslinker die in dit onderzoek wordt gebruikt):
- Plaats de microtray en het deksel afzonderlijk in de UV-crosslinker (d.w.z. plaats de deksels niet op de platen, omdat UV niet in het plastic doordringt).
- Sluit de deur en zet de UV-crosslinker aan.
- Druk op Tijd, voer 20 minuten in en druk op Start.
- Draai na 20 minuten de plaat en het deksel om en herhaal stap 4.2.2-4.2.3.
- Plaats tijdens het dragen van handschoenen de deksels op de microtray om besmetting na sterilisatie te voorkomen.
- Meng de palmitinezuur werkoplossing grondig door vortexing en inverting.
- Plaats de conische injectieflacon van 15 ml met de palmitinezuurwerkoplossing in het kralenbad en laat eventuele zichtbare kristallen volledig oplossen voor gebruik.
- Plaats de microtray op de richel rond het kralenbad met de deksels erop gedurende ~ 2 minuten om op te warmen.
- Verwijder het deksel van de microtray. Voeg langzaam 200 μL palmitinezuur werkoplossing toe over de achterwand (lange zijde) van de microtray. Vervang de deksels en laat de microtray 2-3 minuten op het kralenbad zitten om de palmitinezuuroplossing over de bodem van de microtray te laten bezinken.
OPMERKING: Hoewel de volledige bodem van de microtray pas in stap 4.10 volledig wordt gecoat, moet de oplossing zich gelijkmatig over meer dan de helft van het bodemoppervlak verspreiden. Als de palmitinezuuroplossing zich niet gelijkmatig verspreidt, schakelt u een vortex of trilmotor in de buurt van de microtray in. Dit zorgt voor een kleine hoeveelheid trillingen die kan helpen om de palmitinezuuroplossing gemakkelijker te verspreiden. Houd de deksels van de microtray op hun plaats om vervuiling te beperken. - Herhaal stap 4.8.
OPMERKING: Ongeveer de helft of meer van de bodem van de microtray moet zichtbaar bedekt zijn met het vloeibare palmitinezuur. - Draai de microtray 180° en herhaal stap 4.8 en 4.9 aan de andere kant van de lade.
OPMERKING: De bodem van de Terasaki-lade wordt pas bedekt met een dunne laag palmitinezuuroplossing nadat het volledige gecombineerde volume aan beide zijden is toegevoegd (stappen 4.9 en 4.10). Meer of minder palmitinezuurmengsel kan nodig zijn, afhankelijk van de bereiding van het mengsel, de temperatuur en andere factoren. Over het algemeen is tussen 400 en 800 μL van het palmitinezuurmengsel voldoende om de hele bodem van de microtray te bedekken. Zodra de bodem van de microtray zichtbaar bedekt is, mag er geen extra palmitinezuur worden toegevoegd, omdat dit de putten kan verontreinigen. - Droog de tray in een steriele droogbox of laminaire flowkap gedurende ten minste 1 uur onbedekt. U kunt deze stap ook de dag voor het laden van de platen voltooien (sectie 5), waarbij u de microtray met het deksel erop bij RT gedurende ten minste 16 uur droogt.
5. Het laden van de microtray met laagsmeltende nematodengroeimedia (lmNGM)
OPMERKING: Deze methode gebruikt standaard NGM gemengd met laagsmeltende agarose in plaats van de gebruikelijke agar. Agar kan beginnen te gelen bij 45 °C. Bij het werken met de kleine volumes die nodig zijn om de microtrayputten te vullen, verstopt de op agar gebaseerde NGM vaak de pipetpunt en / of produceert ongelijke putoppervlakken als gevolg van snelle geleer. NGM met behulp van laagsmeltende agarose begint te gelen bij ~ 28 ° C, waardoor de gesmolten media gemakkelijk kunnen worden gepipetteerd en consequent platte putoppervlakken vormen. Bereid lmNGM voor op dezelfde dag dat de wormen op de microtray moeten worden geplaatst. Als u de microtray met lmNGM bereidt, met bacteriën zaait en de C. elegans allemaal binnen dezelfde dag laadt, zorg er dan voor dat de dieren op of in de buurt van de gewenste leeftijd zijn voordat u met deze reeks stappen begint.
- Plaats een pipetbak in een kralenbad van 80 °C om op te warmen.
- Smelt één 10 ml lmNGM-voormengsel per te bereiden microtray (stap 1.1) in de magnetron gedurende ~ 30-45 s.
- Plaats lmNGM voormengsel reageerbuizen in een bekerglas van 200 ml, onbedekt zodat ze niet omvallen.
- Na ~ 10-15 s, of wanneer het lmNGM-voormengsel net begint te borrelen, pauzeert u de magnetron, giet u het lmNGM-voormengsel in een steriele beker van 200 ml en hervat u het magnetrongebruik.
- Pauzeer indien nodig om te voorkomen dat het overkookt en draai om te mengen.
- Stop met microwaving zodra alle lmNGM is veranderd in vloeistof zonder brokken.
OPMERKING: Een enkele aliquot van 10 ml is voldoende om in totaal 192 putjes (twee microtrays) te vullen.
- Bereid lmNGM door de volgende componenten in de vermelde volgorde toe te voegen aan de warme laagsmeltende agarose (volumes zijn per 10 ml agarose met lage smelt): 250 μL van 25 mM KPi (pH 6), 10 μL van 1 M CaCl2, 10 μL van 1 M MgSO4 en 10 μL van 5 mg / ml cholesterol
- Als de onderzoeker van plan is om volwassen dieren in de loop van de tijd te onderzoeken en reproductie moet voorkomen, voeg dan ook 10 μL van 50 mM FUdR toe.
- Als u een RNAi-voedingsexperiment uitvoert met behulp van de gemeenschappelijke HT115 RNAi E. coli-stam en bijbehorende RNAi-plasmiden, voeg dan ook 5 μL van 50 mg / ml carbenicilline toe (om het RNAi-plasmide te selecteren) en 12 μL van 1 mM IPTG (om expressie van het dubbelstrengs RNA uit het RNAi-plasmide te induceren).
OPMERKING: Extra additieven kunnen worden opgenomen, afhankelijk van de selectieve antibiotica en andere chemicaliën die nodig zijn voor de gewenste voedselbron. Geneesmiddelen of chemische stressoren kunnen in dit stadium ook aan lmNGM worden toegevoegd. NGM en lmNGM bevatten dezelfde eindconcentratie NaCl, maar verschillen in de manier waarop de NaCl aan de media wordt toegevoegd. Voor NGM wordt alle NaCl toegevoegd tijdens de mediavoorbereiding (stap 1.2). Voor lmNGM wordt een deel van de NaCl toegevoegd tijdens de mediabereiding (stap 5.3) en een deel met het bacteriële voedsel (rubriek 6). De reden voor deze verandering komt voort uit het kleine mediavolume in elke microtrayput. Het toevoegen van 5 μL geconcentreerde bacteriën gesuspendeerd in LB aan een put met 20 μL media zal de voedingssamenstelling van de media aanzienlijk veranderen (door de componenten van LB met een vergelijkbaar volume toe te voegen). Om dit te voorkomen, wordt de bacterie in plaats daarvan geresuspendeerd in een oplossing van NaCl om de LB-componenten te verwijderen en osmotische stress op de bacteriën te voorkomen. De NaCl die aan de media wordt toegevoegd, wordt dienovereenkomstig gereduceerd om rekening te houden met het zout dat aan de bacteriën wordt toegevoegd.
- Giet lmNGM in het verwarmde pipetbassin.
- Met de microtray op een benchtop, pipetteer 20 μL lmNGM in elke microtray. Bedek de microtray bij het bijvullen van de pipet om verontreiniging tot een minimum te beperken.
OPMERKING: Deze stap is eenvoudiger met een elektronische herhalende pipet.
6. De microtrayputten zaaien met bacterieel voedsel
OPMERKING: 5 μL 10x geconcentreerd voedsel uit een 's nachts geënte cultuur is voldoende om een enkele C. elegans gedurende de gehele levensduur te voeden.
- Breng de bacteriën over van de nachtcultuur naar een conische injectieflacon van 50 ml.
- Centrifugeer op ~3.500 x g gedurende 20 min.
- Verwijder het supernatant. Resuspendie van de bacteriecultuur in een concentratie van 10x (1/10 volume van de oorspronkelijke cultuur) met 85 mM NaCl-oplossing.
- Voordat u bacteriën aan de putten toevoegt, inspecteert u de microtray visueel om ervoor te zorgen dat de vaste lmNGM volledig in elke put zit. Als er lmNGM aan de zijkant van een put hangt, schraap dan het overtollige lmNGM eraf met een pipetpunt. Deze overtollige media kunnen ervoor zorgen dat het voedsel in palmitinezuur terechtkomt als het niet wordt opgeruimd.
- Pipetteer voorzichtig 5 μL van 10x geconcentreerde bacteriecultuur op het oppervlak van de lmNGM in elk putje. Probeer te voorkomen dat de bacteriecultuur over de zijkant van de put en in het palmitinezuur loopt, omdat dit wormen zal aantrekken om de put te verlaten.
- Laat de microtrays gedurende ~35 minuten drogen in een steriele droogdoos of laminaire flowkap. Controleer elke ~ 5 minuten en zorg ervoor dat u niet te droog bent. Verwijder wanneer een paar putjes zichtbaar licht nat zijn, omdat de putjes verder zullen drogen terwijl de aaltjes worden toegevoegd.
7. Elke microtray omsluiten in een plaat met één put
OPMERKING: In deze sectie wordt de microtray gemonteerd in een standaard single-well plaat met behulp van een aangepaste 3D-geprinte insert en omgeven door waterabsorberende kristallen. De single-well plaat wordt vervolgens gesloten en verzegeld met Parafilm. Dit maakt zuurstofuitwisseling mogelijk, terwijl verontreiniging wordt voorkomen en voldoende vochtigheid wordt gehandhaafd om te voorkomen dat de lmNGM uitdroogt in de loop van experimenten van meerdere weken (wormlevensduurexperimenten kunnen 6-8 weken duren als levensduurverlengende mutaties of omgevingsomstandigheden worden onderzocht). Zorg er tijdens de bereiding voor dat u de plaat bedekt wanneer er niet actief iets wordt toegevoegd om bacteriële of schimmelbesmetting te minimaliseren.
- Steriliseer een single-well plaat en 3D-geprinte adapter en deksel door elk in een 10% bleekoplossing te dompelen. Spoel grondig af met steriel DI-water. Veeg droog met een taakveeg.
- Spuit de single-well plaat en 3D-geprinte adapter en het deksel met 70% of meer ethanoloplossing en veeg schoon met een taakdoekje. Laat eventueel achtergebleven ethanol aan de lucht drogen.
OPMERKING: UV-straling kan ook worden gebruikt na bleekmiddel en ethanol met dezelfde parameters als de microtray, zoals hierboven beschreven in stap 4.4. - Plaats het steriele 3D-geprinte inzetstuk in een steriele plaat met één put.
- Steriliseer de buitenkant van de bereide microtray door deze te besproeien met 70% ethanol.
- Plaats de microtray in de 3D-geprinte adapter in de single-well plaat.
- Gooi het deksel van de microtray weg.
- Doseer royaal waterkristallen bovenop het 3D-geprinte inzetstuk tussen de buitenwand van de microtray en de binnenwand van de single-well plaat.
- Voeg onmiddellijk de wormen toe (rubriek 8) of sluit de microtray af om de volgende dag te gebruiken. Sluit het deksel van de lade en gebruik een enkel stuk Parafilm om alle vier de zijden te wikkelen om de microtray af te sluiten. Herhaal de afdichtingsstap met Parafilm nog twee keer voor een totaal van drie lagen.
- Na het verzegelen van de microtray, laat u deze maximaal 4 dagen op de bank bij RT liggen voordat u de wormen toevoegt (sectie 8).
8. Wormen toevoegen aan de microtray
OPMERKING: Eén worm kan handmatig aan elke put worden toegevoegd door dieren uit de leeftijdsgesynchroniseerde wormpopulaties (sectie 2) over te brengen met behulp van een platina pick. Breng dieren alleen over in de gewenste levensfase. Als het overdrachtsproces meer dan 1 uur duurt, kan de lmNGM in de microtrayputten uitdrogen. Het overbrengen van groepen van 10 tot 20 wormen tegelijk kan deze stap versnellen, maar het vergt enige oefening om consequent slechts één dier per put vrij te geven.
- Voeg één nematode per put toe zodra ze de gewenste levensfase hebben bereikt.
- Plaats het deksel terug over de microtray bij het plukken van wormen van de bronplaat om besmetting te minimaliseren.
9. Afwerking van de cultuuromgeving voor langdurig gebruik
OPMERKING: De onderstaande stappen worden uitgevoerd om ervoor te zorgen dat de media en wormen in de microtray gehydrateerd blijven gedurende de duur van het experiment.
- Voeg ~ 40 μL van de reinigingsmiddeloplossing toe aan het deksel van een plaat met één put en gebruik een taakdoekje om het deksel gelijkmatig te bedekken. Deze coating voorkomt condensatie na verloop van tijd zodra de plaat is afgedicht. Gebruik extra taakdoekjes om de reinigingsmiddeloplossing te verspreiden totdat het zicht door het deksel niet wordt vervormd (dit duurt meestal ongeveer twee taakdoekjes).
- Onderzoek de waterkristallen om er zeker van te zijn dat ze beide op gelijke hoogte staan met de bovenrand van de microtray en niet overlopen. Voeg indien nodig waterkristallen toe aan of verwijder ze op de plaat.
- Gebruik de volgende aanpak en wikkel de tray met Parafilm (drie stuks in totaal) om ervoor te zorgen dat de Parafilm-afdichting langdurig meegaat.
- Rek het eerste stuk Parafilm iets uit om twee zijden van de lade te bedekken.
- Rek het tweede stuk Parafilm iets uit en bedek de overige zijden van de lade.
- Rek het laatste stuk Parafilm uit en wikkel alle vier de zijden van de lade volledig in, waarbij het eerste en tweede stuk Parafilm worden bedekt. Een goed afgesloten microtray kan ~ 2 maanden gehydrateerd blijven.
OPMERKING: Controleer de integriteit van Parafilm elke 1-2 weken gedurende het experiment en vervang deze indien nodig. - Veeg de bovenkant van de lade schoon met een taakdoekje, vochtig met 70% ethanol, om eventuele vingerafdrukken te verwijderen.
- Label de single-well plaat met tape. De microtray is nu klaar voor beeldvorming en langdurige opslag om wormen in de loop van de tijd te volgen. Houd de lade tussen de beeldsessies door op 20 °C. De microtray kan meerdere keren worden geopend en opnieuw worden verzegeld voor medicijndosering of andere procedures, maar moet worden geminimaliseerd om verontreiniging en vochtverlies te voorkomen.
10. Beeldvorming van individuele wormen in microtrayputten
OPMERKING: Het doel van dit protocol is om een gedetailleerde beschrijving te geven van hoe de microtraycultuuromgeving moet worden voorbereid. Eenmaal bereid en gevuld met wormen, kunnen de microtray single-worm kweekomgevingen worden gebruikt om vele fenotypen longitudinaal te monitoren met behulp van technieken die zijn vastgesteld voor standaardkweek op petrischolen. De volgende sectie bevat basisinstructies voor het meten van enkele veelvoorkomende fenotypen. Fluorescerende beeldvorming moet worden uitgevoerd in een rechtopstaande microscoop. Breking van licht door de Terasaki-lade wordt geminimaliseerd in een donkere kamer.
- Levensduur: Meet de levensduur door zachtjes op de zijkant of bovenkant van de plaat te tikken of een felblauw licht op de plaat te schijnen en elk dier te observeren. Scoor een dier "dood" als het niet binnen een paar seconden beweegt. Herhaal deze taak elke 1-3 dagen totdat alle wormen zijn gestorven.
OPMERKING: De microtray-cultuuromgeving is compatibel met systemen die het verzamelen en analyseren van afbeeldingen automatiseren voor een schatting van de levensduur14,19. - Standaard microscopie: Voer brightfield (of darkfield) beelden uit op individuele putjes of op de hele lade met een camera of scanner met hoge resolutie. Deze beeldvormingsgegevens kunnen worden gebruikt voor een verscheidenheid aan fenotypen, waaronder diergrootte 22,23,24, ontwikkeling 25, activiteit 14,19 en levensduur.
- Fluorescerende microscopie: Voer fluorescerende beeldvorming uit op enkele putten, handmatig of met een gemotoriseerd platformsysteem. De single-well trays zijn compatibel met standaard multi-well plaatadapters. Signaal-naar-ruis wordt geminimaliseerd als het apparaat in een zwartwandige doos wordt geplaatst.
OPMERKING: Omdat de wormen worden afgebeeld terwijl ze vrij blijven om te kruipen, is dit kweeksysteem zeer geschikt voor beeldvorming met een lage resolutie om fluorescentie van het hele lichaam en ruwe weefsellokalisatie van fluoroforen vast te leggen. Hoge resolutie en hoge vergroting beeldvorming vereist meestal dat de dieren worden geïmmobiliseerd om beweging te voorkomen. Hoewel het mogelijk zou moeten zijn om een verlammend middel (bijv. natriumazide of levamisol) topisch op elke put aan te brengen en door te gaan met beeldvorming met een hogere resolutie, zou dit herhaalde metingen van dezelfde worm op latere tijdstippen uitsluiten. Het kweeksysteem, zoals beschreven, is ook niet bedoeld om omgekeerd te zijn, wat het gebruik van omgekeerde microscoopsystemen voorkomt.- Als brightfield niet wordt gebruikt om de levensduur te meten en alleen fluorescentie wordt vastgelegd, meet dan de levensduur handmatig. Het blauwe licht (gebruikt voor GFP-excitatie) gedurende 5 s op de worm laten staan, zal het dier ertoe aanzetten om te bewegen. Als het dier niet binnen 5 s is verplaatst, beschouw het dier dan als dood.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
De microtray-gebaseerde single-worm kweekomgeving die hier wordt beschreven, kan worden gebruikt om een verscheidenheid aan fenotypen te volgen, waaronder levensduur en gezondheidsspanne, activiteit en beweging, lichaamsvorm en kruipgeometrie, en de expressie van transgeen tot expressie gebrachte fluorescerende biomarkers in individuele dieren in de loop van de tijd. Het microtray-kweeksysteem is compatibel met levensduuranalyse door middel van handmatige scoring of beeldverzameling en downstream beeldanalyse. Net als bij standaardkweek op petriplaten21 kunnen wormen handmatig als dood of levend worden beoordeeld op basis van beweging na een stimulus (bijvoorbeeld tikken op de plaat of blootstelling aan blauw licht). Voor op afbeeldingen gebaseerde levensduuranalyse wordt een vergelijking van frame-tot-frame-verschillen tussen afbeeldingen die zijn gemaakt nadat de stimulus is toegepast, gebruikt om te bepalen wanneer elke worm stopt met bewegen. Dit is compatibel met geautomatiseerde beeldverzamelings- en analysesystemen en biedt aanvullende gegevens in de vorm van het activiteitsniveau van individuele dieren op elk tijdstip. Deze informatie kan vervolgens niet alleen worden gebruikt om de levensduur (stoppen van beweging) te schatten, maar ook om de gezondheidsspanne te schatten (een drempel van verminderde activiteit; er zijn meerdere definities voorgesteld). Aanvullende parameters (lichaamsgrootte, vorm en houding) kunnen ook worden gemeten aan de hand van deze afbeeldingen.
De belangrijkste kenmerken van dit microtraycultuursysteem zijn (1) het vermogen om individuele dieren in de loop van de tijd te volgen, (2) de compatibiliteit tussen het kweeksysteem en aversieve interventies zoals dieetbeperking of chemische stressmiddelen, en (3) de mogelijkheid om fluorescentie direct in de kweekomgeving te meten. Om deze kenmerken aan te tonen, stelden we wormen bloot aan 250 μM kopersulfaat (CuSO4) om zware metaalstress te induceren of 10 mM dithiothreitol (DTT) om eiwitmisvouwstress te induceren en maten we dagelijkse activiteit, levensduur en gezondheidsspanne. Zowel CuSO4als DTT verkortten de levensduur van wormen aanzienlijk (figuur 2A). Door de dagelijkse activiteit te monitoren, konden we de individuele gezondheidsspanne van elke worm schatten, hier gedefinieerd als de leeftijd waarop een worm niet langer een volledige lichaamslengte kan bewegen als reactie op de stimulus. CuSO4 en DTT verminderden de gezondheidsspanne ten opzichte van onbehandelde controles (figuur 2B). CuSO4 daarentegen verminderde het aandeel van het leven dat in goede gezondheid werd doorgebracht, terwijl DTT dat niet deed (figuur 2C). CuSO4 verminderde ook de gemiddelde activiteit van individuen binnen de populatie in grotere mate dan DTT op alle leeftijden (figuur 2D), evenals de cumulatieve activiteit voor elk dier gedurende de levensduur (berekend als het gebied onder de activiteitscurve [AUC]; Figuur 2E). Een belangrijk voordeel van deze microtray-opstelling is het vermogen om fenotypes gemeten op verschillende tijdstippen te correleren met individuele dieren binnen een populatie. In dit geval vinden we dat cumulatieve activiteit voor individuele dieren tot dag 10 correleert met de levensduur voor DTT-uitgedaagde dieren, maar niet voor onbehandelde controles of CuSO 4-uitgedaagde dieren (figuur 2F).
Om het vermogen aan te tonen om fluorescerende biomarkers gedurende de hele levensduur te monitoren, gebruikten we het microtraycultuursysteem om de expressie van mScarlet-transgen gefuseerd met de C-terminus van het kynu-1-gen te monitoren, coderend voor het enzym kynureninase in de kynurenine metabole route, op zijn endogene locus. We vonden eerder dat expressie van menselijke kynureninase, gecodeerd door Kynu, toeneemt met de leeftijd in bloed26, en dat knockdown van kynu-1 in C. elegans voldoende is om de levensduur te verlengen27. KYNU-1 geeft leeftijdsafhankelijke expressie weer; het is bijna niet detecteerbaar in het L4-larvale stadium en piekt op dag 9 van de volwassenheid. Een drastische toename van de expressie wordt waargenomen tussen dag 3 en 8 van de volwassenheid, en er is een progressieve afname met de leeftijd daarna (figuur 3A, aanvullende figuur 1). Om de relatie tussen KYNU-1 en C. elegans veroudering te beoordelen, kwantificeerden we de cumulatieve abundantie van KYNU-1 tot dag 14 van de volwassenheid (een leeftijd waarop de meeste dieren nog in leven waren) en vonden we een significante correlatie met de levensduur (figuur 3B). Omdat KYNU1-expressie dynamisch is in de loop van een levensduur, vergeleken we KYNU-1-expressie op verschillende leeftijden met de algehele overleving van individuele dieren. Op geen enkel tijdstip was KYNU-1-expressie significant gecorreleerd met overleving (figuur 3C-F), wat aantoont dat levenslange expressie een betere indicatie is van de impact op de levensduur dan beoordelingen van één enkel tijdstip.
Gecombineerd leveren deze experimenten representatieve gegevens op die de mogelijkheden van het op microtrays gebaseerde kweeksysteem met één worm benadrukken om dynamische veranderingen in wormactiviteit, gezondheid, levensduur en fluorescerende biomarkers te kunnen vangen en vergelijken tussen leeftijden bij individuele dieren. Met name de mogelijkheid om individuen op meerdere tijdstippen te volgen, maakt het mogelijk om dynamische veranderingen in zowel fysiologische als moleculaire fenotypes in vivo te volgen, waardoor patronen kunnen worden gedetecteerd die niet zichtbaar zouden zijn met behulp van cross-sectionele metingen tussen populaties.
Figuur 1: Microtray single-worm cultuur omgeving . (A) 3D-rendering van een microtray gemonteerd in een single-well plaat met behulp van een aangepaste 3D-geprinte adapter. (B) Schema van het kweeksysteem met één worm met de relatieve positie van een microtrayput met laagsmeltende agarose-nematodengroeimedia (NGM), bacterieel voedsel, geïsoleerde C. elegans, aversieve palmitinezuurcoating, de 3D-geprinte adapter, waterkristallen en de single-well plaat. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Correlatie van fenotypes in individuele dieren over populaties met behulp van Microtray single-worm omgevingen. Alle panelen leveren gegevens van een experiment waarin drie groepen wild-type (N2) C. elegans werden vergeleken die zonder toevoegingen waren blootgesteld (controle; N = 55), 250 μM kopersulfaat (CuS04; N = 38), of 10 mM dithiothreitol (DTT; N = 34) vanaf dag 2 van de volwassenheid. Levensduur (A) en gezondheidsspanne (B) worden beide matig verminderd door chronische blootstelling aan CuSO4 of DTT. Gezondheidsspanne wordt gedefinieerd als de laatste dag dat een dier ten minste één volledige lichaamslengte op de plaat kan bewegen. De paarsgewijze significantie wordt berekend met behulp van de log-rank test (R survdiff functie). (C) Gezondheidsspanne en levensduurgemiddelden binnen elke populatie (boven: absolute waarden; onder: genormaliseerd naar de gemiddelde levensduur van elke groep). (D) De gemiddelde wormactiviteit (3-daags voortschrijdend gemiddelde van de dagelijkse activiteit) binnen elke groep gedurende de levensduur en (E) het populatiegemiddelde van het individuele diergebied onder de lifetime activity curve (AUC) worden beide aanzienlijk aangetast door CuSO4 of DTT. Significantie bepaald door de Mann-Whitney U-test om AUC voor individuele dieren tussen groepen te vergelijken. F) Cumulatieve activiteit voor individuele dieren tot dag 10 (onder) correleert met een levensduur voor dieren die zijn blootgesteld aan DTT, maar niet voor controledieren of dieren die zijn blootgesteld aan CuSO4, zoals bepaald door lineaire regressie (lm-functie in R). n.s. = niet significant, * p < 0,05, ** p < 0,01, *** p < 0,001. De Bonferroni-methode werd gebruikt om alle p-waarden voor meerdere vergelijkingen aan te passen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Dynamische kwantificering van KYNU-1 in individuele C. elegans gedurende de gehele levensduur. C. elegans met mScarlet transgeen in beeld gesmolten met de C-terminus van het kynu-1 gen (KYNU-1::mScarlet) werden in beeld gebracht met behulp van een fluorescerende stereomicroscoop uitgerust met een monochrome camera om de 1-4 dagen gedurende 36 dagen totdat alle dieren waren gestorven. (A) KYNU-1, zoals gemeten door dagelijkse kwantificering van KYNU-1::mScarlet fluorescentie, vertoont een duidelijk leeftijdsafhankelijk expressiepatroon gedurende de levensduur (gemiddelde waarde over wormen weergegeven op elke leeftijd). (B) Cumulatieve KYNU-1::mScarlet-expressie tot en met dag 14 van de volwassenheid correleert met de levensduur bij individuele dieren. KYNU1::mScarlet-expressie in het (C) L4-larvale stadium (dag 0 van volwassenheid), (D) dag 4 van volwassenheid, (E) dag 9 van volwassenheid en (F) dag 15 van volwassenheid correleerden niet met de levensduur bij individuele dieren. Correlaties berekend door lineaire regressie (Data Analysis Regression functie in Microsoft Excel). n.s. = niet significant, * p < 0,05, ** p < 0,01, *** p < 0,001. Alle p-waarden werden gecorrigeerd voor meerdere vergelijkingen met behulp van de Bonferroni-methode. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Aanvullende figuur 1: Enkele KYNU-1::mScarlet C. elegans afgebeeld gedurende de hele levensduur onder rood kanaal. Enkele put van een geprefabriceerde microtray met een enkele C. elegans met mScarlet gelabeld KYNU-1 levend op geconcentreerde E. coli voedselbron. Het dier werd voor het eerst afgebeeld in het L4-larvale stadium en vervolgens afgebeeld in stappen van 1-5 dagen voor de rest van zijn leven. Klik hier om dit bestand te downloaden.
Aanvullende figuur 2: Terasaki-tray versus WorMotel-achtergrond- en artefactvergelijking onder fluorescentiemicroscopie. Putjes van geprefabriceerde microtrays (boven) of gegoten PDMS WorMotels (onder) werden afgebeeld onder GFP (A), RFP (B) en DAPI (C) fluorescentiekanalen met behulp van een fluorescerende stereomicroscoop uitgerust met een monochrome camera. Afbeeldingen worden in valse kleuren weergegeven en een heatmap wordt gebruikt om verzadigingspunten te markeren. Beide cultuursystemen hebben een achtergrond op laag niveau in alle kanalen. De WorMotel-platen zijn gevoelig voor sporadische hoogsignaalartefacten, die waarschijnlijk microbubbels of stof of andere deeltjes zijn die per ongeluk zijn vastgelegd tijdens het PDMS-gietproces14,15. Klik hier om dit bestand te downloaden.
Aanvullend bestand 1: Microtray_adapter_2021-10-20.STL. Een stereolithografiebestand (STL) voor de 3D-geprinte insert waarop de microtray in de single-well plaat wordt geplaatst. Dit bestand bevat de volledige versie met een stevige bodem en is het meest geschikt voor gebruik in een systeem waarbij de lichtbron zich boven de plaat bevindt. Klik hier om dit bestand te downloaden.
Aanvullend bestand 2: Microtray_adapter_bottomless_2021-10-20.STL. Een stereolithografiebestand (STL) voor de 3D-geprinte insert waarop de microtray in de single-well plaat wordt geplaatst. Dit bestand bevat de bodemloze versie en is het meest geschikt voor gebruik in een systeem waarbij de lichtbron zich onder de plaat bevindt. Klik hier om dit bestand te downloaden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Hier beschrijven we een nieuw kweeksysteem dat microtrays aanpast, oorspronkelijk ontwikkeld voor menselijke leukocytenantigeenweefseltyperingstests, om de isolatie en karakterisering van enkele C. elegans in de loop van de tijd mogelijk te maken in een solide mediaomgeving die contextueel vergelijkbaar is met de op agar gebaseerde NGM die de standaard is in C. elegans-onderzoek. Dit systeem is compatibel met een verscheidenheid aan interventies, waaronder dieetbeperking, exogene medicamenteuze behandeling, een uitdaging met chemische of omgevingsstressoren en RNAi. Het maakt verder longitudinale monitoring van fluorescerende biomarkers in vivo bij individuele dieren mogelijk. Het vermogen om individuele dieren binnen een populatie te volgen, maakt het mogelijk om intra-individuele variabiliteit binnen een populatie te beoordelen op fenotypes met een duidelijke temporele component, waaronder gedrag, pathogenese, reactie op stressvolle omstandigheden en achteruitgang van de gezondheid. Het maakt het ook mogelijk om eigenschappen in het vroege leven die binnen een populatie variëren, te koppelen aan de uitkomsten van het late leven, inclusief levensduur en gezondheid. Net als andere beeldvormingstechnologieën met één worm, maakt dit op microtrays gebaseerde kweeksysteem het mogelijk om individuele dieren op meerdere tijdstippen gedurende het leven te volgen, terwijl mogelijke verstorende factoren worden vermeden, zoals de activering van stressresponsroutes die optreden wanneer wormen worden gekweekt in vloeibare omgevingen (zoals het geval is in veel microfluïdica-apparaten). Hierdoor kunnen gegevens die in dit cultuursysteem worden verzameld, directer worden vergeleken met het grootste deel van het eerdere werk van C. elegans dat op vaste media is uitgevoerd. Recente technologische ontwikkelingen maken de automatisering van vele aspecten van C. elegans karakterisering mogelijk, waaronder groei, ontwikkeling en veroudering28. Dit kweeksysteem is, in combinatie met geautomatiseerde microscopie en bijbehorende software, compatibel met een geautomatiseerde, high-throughput verzameling van levensduur, gezondheidsspanne, activiteit en andere fysiologische parameters14,19.
We gebruiken WorMotels14,15 routinematig om fysiologische fenotypen (bijv. Levenslange activiteit), gezondheidsspanne en levensduur voor individuele C. elegans te controleren onder niet-stressvolle omstandigheden zoals medicamenteuze behandelingen en RNAi. In onze ervaring bieden andere beeldvormingstechnologieën met één worm een uitstekend hulpmiddel voor het monitoren van individuele variatie in deze fenotypen, maar ze hebben twee beperkingen. Ten eerste, in de context van fluorescentiebeeldvorming, heeft het PDMS-materiaal dat wordt gebruikt om de chip te vormen de neiging om microbubbels te vormen en kleine deeltjes op te vangen, die beide fluoresceren in de buurt van de GFP-emissiegolflengte. Dit genereert visuele artefacten wanneer platen worden gevisualiseerd onder verschillende fluorescentiekanalen (aanvullende figuur 2). Een tweede beperking is dat kopersulfaat een onvoldoende afschrikmiddel is om te voorkomen dat ze vluchten wanneer wormen worden blootgesteld aan interventies die zelf aversief zijn, met name dieetbeperking, pathogene bacteriën of stressveroorzakende middelen. De gracht van andere single-worm opstellingen is te smal en hydrofoob om palmitinezuur te accommoderen, wat een sterker aversief middel is dat vaak wordt gebruikt om populaties onder dieetbeperking of andere aversieve omstandigheden op petriplaten te houden.
De hier gepresenteerde microtray single-worm cultuurtechniek pakt beide beperkingen aan. De grotere grachtgrootte en het hydrofiele materiaal van de microtrays, samen met de toepassing van warmte en de opname van Tween 20, maakt het mogelijk palmitinezuur toe te passen als een verbeterde aversieve barrière rond elke put zonder de lmNGM-pads zelf te vervuilen. De polystyreenconstructie van de microtrays genereert alleen laag-niveau, consistent verdeelde autofluorescentie, waardoor het probleem van autofluorescente microbubbels en deeltjesinsluitsels van het PDMS wordt vermeden (aanvullende figuur 2). Zowel achtergrondgeluid als artefacten worden verder verminderd door een zwart oppervlak onder en rond de lade te gebruiken om diffractie te minimaliseren. We nemen 3D-printbestanden op voor zowel een holle adapter (die brightfield-beeldvorming mogelijk maakt) als een effen zwarte adapter (die een donkerveld biedt dat zowel darkfield- als fluorescentiebeeldvorming verbetert; zie Aanvullend bestand 1 en Aanvullend bestand 2). Hoewel de lmNGM zelf enige autofluorescentie genereert, wordt de impact op de beeldkwaliteit geminimaliseerd door het kleine putvolume. Deze factoren maken microtrays optimaal voor herhaalde fluorescerende beeldvorming van individuele dieren in vivo zonder ze uit hun kweekomgeving te verwijderen. Het grootste nadeel van het microtray single-culture systeem ten opzichte van andere single-worm imaging technologieën is de steekproefgrootte; elke microtray biedt plaats aan maximaal 96 individueel gekweekte dieren, in tegenstelling tot de capaciteit van 240 dieren van elke WorMotel14,15. Beide bieden capabele kweeksystemen met één worm en de experimentele toepassing bepaalt welke het meest geschikt is.
Er zijn verschillende beperkingen aan het microtray-cultuursysteem. Ten eerste is het op microtrays gebaseerde kweeksysteem zowel moeilijker als tijdrovender om op te zetten dan standaard kweekmethoden met petrischladen. Ten tweede worden C. elegans gestimuleerd door verschillende veel voorkomende excitatiegolflengten in fluorescentiemicroscopie. Omdat dieren niet worden geïmmobiliseerd tijdens het beeldvormingsproces, kunnen fluorescerende biomarkers die lange blootstellingstijden vereisen, worden vervaagd. We vinden dat het vastleggen van meerdere beelden gedurende elk tijdstip over het algemeen voldoende is om een nauwkeurige kwantificering van het fluorescerende signaal van hele dieren mogelijk te maken. Vanwege dit probleem is het microtray-cultuursysteem echter niet compatibel met beeldvorming met hoge resolutie, zoals met confocale microscopie, en is het niet optimaal voor het afbeelden van biomarkers met een laag signaal. Zelfs in het licht van deze beperkingen biedt deze nieuwe methode het potentieel om complexe fysiologische processen te begrijpen met tijdsafhankelijke dynamiek of hoge individu-tot-individuele variabiliteit in de context van activiteit en overleving.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs stellen dat ze geen belangenconflicten openbaar te maken hebben.
Acknowledgments
Dit werk werd ondersteund door NIH R35GM133588 aan G.L.S., een NIHT32GM008659 trainingsbeurs aan L.E., een United States National Academy of Medicine Catalyst Award aan G.L.S., en het State of Arizona Technology and Research Initiative Fund beheerd door de Arizona Board of Regents.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 3D-printed terasaki inserts | Custom printing company | Robot_Terasaki_tray_insert_10-20 -2021.STL |
FDM printing, nozzle size 0.6 mm using standard PLA plus filament |
| AirClean systems AC624LF vertical laminar flow fume hood | Fisher Scientific | 36-100-4376 | |
| Bacto peptone | Thermo Scientific | 211677 | |
| CaCl2 | Acros organics | 349615000 | |
| Caenorhabditis elegans N2 | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) | N2 | Wildtype strain |
| Carbenicillin | Goldbio | C-103-25 | |
| Cholesterol | ICN Biomedicals Inc | 101380 | |
| Escherichia coli OP50 | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) | OP50 | Standard labratory food for C. elegans |
| Ethanol | Millipore | ex0276-4 | |
| Fisher Vortex Genie 2 | Fisher Scientific | G-560 | |
| FUdR | Research Products International | F10705-1.0 | |
| Hydrating water crystals | M2 Polymer Technologies | Type S | Type S super absorbent polymer |
| Isopropyl ß-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) | GoldBio | I2481C100 | |
| K2HPO4 | Fisher Chemical | P288-500 | |
| Kimwipes | KimTech | 34155 | Task wipes |
| LB Broth, Lennox | BD Difco | 240230 | |
| Leica K5 sCMOS monochrome camera | Leica Microsystems | 11547112 | |
| Leica M205 FCA Fluorescent Stereo Microscope | Leica Microsystems | 10450826 | |
| Low-melt agarose | Research Products International | A20070-250.0 | |
| MgSO4 | Fisher Chemical | M-8900 | |
| NaCl | Fisher bioreagents | BP358-1 | |
| Nunc OmniTray Single-Well Plate | Thermo Scientific | 264728 | |
| Nystatin | Sigma | N1538 | |
| Palmitic acid | Acros organics | 129700010 | |
| Paper towels | Coastwide Professional | 365374 | |
| Parafilm M | Parafilm | 16-101 | |
| Stratagene UV Stratalinker 2400 | Stratagene | 400075 | UV crosslinker |
| Terasaki trays (Lambda) | One Lambda | 151431 | |
| Thermolyne Dri-bath | Thermolyne | DB28125 | |
| Tween | Thermo Scientific | J20605-AP |
References
- Shaham, S.
- Boulin, T., et al. Eight genes are required for functional reconstitution of the Caenorhabditis elegans levamisole-sensitive acetylcholine receptor. Proceedings of the National Academy of Sciences. 105 (47), 18590-18595 (2008).
- Massie, M. R., Lapoczka, E. M., Boggs, K. D., Stine, K. E., White, G. E. Exposure to the metabolic inhibitor sodium azide induces stress protein expression and thermotolerance in the nematode Caenorhabditis elegans. Cell Stress & Chaperones. 8 (1), 1-7 (2003).
- Xian, B., et al. WormFarm: a quantitative control and measurement device toward automated Caenorhabditis elegans aging analysis. Aging Cell. 12 (3), 398-409 (2013).
- Rahman, M., et al. NemaLife chip: a micropillar-based microfluidic culture device optimized for aging studies in crawling C. elegans. Scientific Reports. 10 (1), 16190 (2020).
- Chronis, N., Zimmer, M., Bargmann, C. I. Microfluidics for in vivo imaging of neuronal and behavioral activity in Caenorhabditis elegans. Nature Methods. 4 (9), 727-731 (2007).
- Clark, A. S., Huayta, J., Arulalan, K. S., San-Miguel, A. Microfluidic Devices for Imaging and Manipulation of C. elegans. Micro and Nano Systems for Biophysical Studies of Cells and Small Organisms. , Academic Press. Chapter 13 295-321 (2021).
- Levine, E., Lee, K. S. Microfluidic approaches for Caenorhabditis elegans research. Animal Cells and Systems. 24 (6), 311-320 (2020).
- Atakan, H. B., et al. Automated platform for long-term culture and high-content phenotyping of single C. elegans worms. Scientific Reports. 9 (1), 14340 (2019).
- Solis, G. M., Petrascheck, M. Measuring Caenorhabditis elegans life span in 96 well microtiter plates. Journal of Visualized Experiments. (49), e2496 (2011).
- Leung, C. K., Deonarine, A., Strange, K., Choe, K. P. High-throughput screening and biosensing with fluorescent C. elegans strains. Journal of Visualized Experiments. (51), e2745 (2011).
- Laranjeiro, R., Harinath, G., Burke, D., Braeckman, B. P., Driscoll, M. Single swim sessions in C. elegans induce key features of mammalian exercise. BMC Biology. 15 (1), 30 (2017).
- Çelen, İ, Doh, J. H., Sabanayagam, C. R. Effects of liquid cultivation on gene expression and phenotype of C. elegans. BMC Genomics. 19 (1), 562 (2018).
- Churgin, M. A., et al. Longitudinal imaging of Caenorhabditis elegans in a microfabricated device reveals variation in behavioral decline during aging. eLife. 6, 26652 (2017).
- Turner, E., et al. Long-term culture and monitoring of isolated nematodes on solid media in WorMotels. Journal of Visualized Experiments. , (2022).
- Pittman, W. E., et al. A simple apparatus for individual C. elegans culture. Methods in Molecular Biology. 2144, 29-45 (2020).
- Breimann, L., Preusser, F., Preibisch, S. Light-microscopy methods in C. elegans research. Current Opinion in Systems Biology. 13, 82-92 (2019).
- Mittal, K. K., Mickey, M. R., Singal, D. P., Terasaki, P. I. Serotyping for homotransplantation. 18. Refinement of microdroplet lymphocyte cytotoxicity test. Transplantation. 6 (8), 913-927 (1968).
- Freitas, S. Worm paparazzi-a high throughput lifespan and healthspan analysis platform for individual Caenorhabditis elegans. , Available from: https://repository.arizona.edu/handle/10150/661628 (2021).
- Porta-de-la-Riva, M., Fontrodona, L., Villanueva, A., Cerón, J. Basic Caenorhabditis elegans methods: synchronization and observation. Journal of Visualized Experiments. (64), e4019 (2012).
- Sutphin, G. L., Kaeberlein, M. Measuring Caenorhabditis elegans life span on solid media. Journal of Visualized Experiments. (27), e1152 (2009).
- Moore, B. T., Jordan, J. M., Baugh, L. R. WormSizer: high-throughput analysis of nematode size and shape. PloS One. 8 (2), 57142 (2013).
- Husson, S. J., Costa, W. S., Schmitt, C., Gottschalk, A.
- Roussel, N., Sprenger, J., Tappan, S. J., Glaser, J. R. Robust tracking and quantification of C. elegans body shape and locomotion through coiling, entanglement, and omega bends. Worm. 3 (4), Taylor & Francis. 982437 (2014).
- Raizen, D. M., et al. Lethargus is a Caenorhabditis elegans sleep-like state. Nature. 451 (7178), 569-572 (2008).
- Peters, M. J., et al. The transcriptional landscape of age in human peripheral blood. Nature Communications. 6 (1), 8570 (2015).
- Sutphin, G. L., et al. Caenorhabditis elegans orthologs of human genes differentially expressed with age are enriched for determinants of longevity. Aging Cell. 16 (4), 672-682 (2017).
- Felker, D. P., Robbins, C. E., McCormick, M. A. Automation of C. elegans lifespan measurement. Translational Medicine of Aging. 4, 1-10 (2020).
