Summary
여기에서는 화학 지문 다중 패턴 인식과 결합 된 고성능 액체 크로마토 그래피 (HPLC)를 확립하기위한 프로토콜을 제시하여 클레 마티 디스 아르만디 콜리스 및 그 불순물의 진정한 품종을 효과적으로 식별하기위한 새로운 전략을 제공합니다.
Abstract
중국 약재 및 관련 간음 물질을 식별하는 방법은 Clematidis Armandii Caulis (Chuanmutong, 보편적으로 사용되는 중국 전통 의학)를 예로 들어 구성되었습니다. 클러스터 분석(CA), 주성분 분석(PCA) 및 직교 부분 최소 제곱 판별 분석(OPLS-DA)을 포함하여 화학 측정법과 결합된 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC) 지문을 기반으로 정품 Chuanmutong 품종 10개 배치와 관련 불순물 5개 배치를 분석하고 비교했습니다. 또한, β- 시토스테롤의 함량을 결정하였다. Chuanmutong의 대조 화학 지문이 확립되었고 12 개의 공통 피크가 확인되었습니다. 정품 Chuanmutong 품종 10 개 배치의 지문과 대조 지문 간의 유사성은 0.910-0.989 인 반면, 5 개 배치의 간음 자의 유사성은 0.133-0.720에 불과했습니다. 크로마토그램의 공통 피크를 기반으로 15개의 샘플 배치를 PCA에 의해 3가지 함량 수준으로 분류하고 CA에 의해 4가지 범주로 집계하여 정통 Chuanmutong과 Chuanmutong의 불순물을 명확하게 구분했습니다. 또한, OPLS-DA를 통해 진짜 촨무퉁과 촨무통의 불순물을 효과적으로 식별할 수 있는 7가지 차등 성분이 발견되었다. 정품 Chuanmutong 품종의 10 개 배치의 β- 시토스테롤 함량은 97.53-161.56 μg / g 인 반면, 5 개 배치의 β- 시토스테롤 함량은 크게 다양했으며, 그 중 클레 마티스 피터라 핸드의 β- 시토스테롤 함량. 그리고 클레 마티스 구 리아나 록스 브. Var. finetii Rehd. et 윌스. Chuanmutong의 정통 품종보다 현저히 낮았습니다. 본 연구에서 확립된 HPLC 지수 성분 함량 및 화학적 지문 다중 패턴 인식 방법은 정통 한약 재료 및 관련 불순물을 효과적으로 식별하기 위한 새로운 전략을 제공합니다.
Introduction
Chuanmutong, 클레 마티스 아르 만디 프란치의 마른 콜리스. 또는 클레 마티스 몬타나 Buch.-Ham.은 클리닉 1,2,3에서 일반적으로 사용되는 중국 전통 의학입니다. 비뇨기 문제, 부종, 혀와 입의 염증, 우유 분비 감소, 관절 경직, 습열로 인한 근육통치료에 사용됩니다 4. Chuanmutong은 항상 중국 남서부, 특히 최고의 품질을 찾을 수있는 쓰촨에 분포하는 야생 품종에서 항상 얻었습니다 5,6. 정통 품종과 밀접하게 관련된 간음제는 유사한 특성 7,8,9,10으로 인해 구별하기가 어렵습니다. 중국 약전 2020년판에서 Chuanmutong의 품질 표준은 내용물 결정 없이 특성, 현미경 식별 및 박층 식별만 규정하고 있어 불순물을 효과적으로 식별할 수 없으므로 잠재적인 위험이 있습니다. 또한 Chuanmutong과 관련 식물을 비교하고 식별하는보고는 거의 없습니다. 결과적으로 Chuanmutong의 진위를 보장하는 품질 관리 방법은 추가 연구가 필요합니다.
Chuanmutong의 화학 성분은 주로 올레아나난형 펜타사이클릭 트리테르페노이드와 그 배당체, 플라보노이드 및 유기산 11,12,13,14로 구성됩니다. 그 중 올레아놀산, β- 시토스테롤, 스티그마 스테롤 및 에르고 스테롤은 다양한 강도의 이뇨 효과를 가지며, 이는 이뇨를 촉진하고 stranguria15,16을 완화시키는 잠재적 인 약력학 물질 일 수 있습니다. 화학 지문은 고성능 액체 크로마토 그래피 (HPLC), 가스 크로마토 그래피 (GC) 등으로 샘플에 포함 된 많은 화학 성분을 분리하고 검출하여 얻습니다. Chuanmutong의 특성을 분석하기 위해 적절한 통계 분석 방법을 채택하면 중국 전통 의학17,18,19의 전반적인 품질 관리 및 과학적 식별을 결정할 수 있습니다.
이 연구에서는 Chuanmutong 정통 품종 10 배치와 간음제 5 배치를 수집했습니다. 이들의 품질은 클러스터 분석 (CA), 주성분 분석 (PCA), 직교 부분 최소 제곱 차별 분석 (OPLS-CA) 및 약력학 성분의 함량 측정을 포함한 다중 패턴 인식과 결합 된 HPLC 지문 방법으로 비교 및 분석되었습니다. 이 프로토콜은 높은 특이성으로 정통 품종을 식별하는 방법, 정통 품종 및 한약 재료의 불순물을 과학적으로 식별하기위한 새로운 전략을 수립합니다.
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Protocol
1. 화학적 지문 검출 방법
- 크로마토그래피 조건
- 아세토니트릴(A)/물(B) 이동상을 준비합니다. HPLC 소프트웨어에서 다음과 같이 그라디언트 프로그램을 설정하십시오 : 0-20 분, 3 % A-10 % A; 20-25 분, 10 % A-13 % A; 25-65 분, 13 % A-25 % A; 65-75 분, 25 % A-40 % A; 75-76 분, 40 % A-3 % A; 76-85 분, 3 % A-3 % A.
- 이동상의 유속을 1.0mL/분으로 유지합니다.
- 30°C로 유지된 C18 컬럼(250 mm x 4.6 mm, 5 μm)에서 크로마토그래피 분리를 수행한다.
- 주입량을 10μL로 설정합니다.
- 205 nm의 파장에서 샘플을 검출합니다.
참고: 크로마토그래피 조건의 특정 설정은 고성능 액체 크로마토그래피 작동 소프트웨어의 작동 절차(재료 표)를 참조하십시오.
- 시료용액 준비
- 원료를 내경 850 μm ± 29 μm 인 나일론 메쉬를 통과시켜 균일 한 입자 크기로 분쇄합니다.
- 분쇄 된 원료 2g (정확하게 칭량)을 마개가있는 50mL 원추형 플라스크에 넣고 메탄올 50mL를 첨가합니다. 플라스크에 스토퍼를 놓고 초음파 (600W, 40kHz)를 30 분 동안 놓습니다.
- 그런 다음 플라스크를 실온(RT)으로 냉각합니다. 샘플을 다시 칭량하고 손실된 추출제를 교체하여 초기 중량을 보충합니다.
- 약재 추출물이 포함된 메탄올 용액 4mL를 10mL 부피 플라스크에 붓습니다. 6mL의 H2O를 넣고 혼합하고 10분 동안 가라앉힙니다.
- 마지막으로 0.45μm 필터 멤브레인을 통해 상청액을 여과하고 대기 상태로 둡니다.
- 지문 검출 방법 검증
- 상기와 같이 샘플을 준비하고(단계 1.2) 하루에 6회 HPLC 분석(단계 1.1)을 실시한다. 정밀도를 평가하려면 1.3.5단계에 설명된 대로 상대 머무름 시간 및 상대 피크 영역의 상대 표준 편차(RSD)를 계산합니다.
- 0, 2, 4, 6, 8, 12 및 24시간 동안 RT에 저장된 동일한 샘플 용액을 분석하여 샘플 용액의 안정성을 평가하고 단계 1.3.5에 설명된 대로 상대 머무름 시간 및 상대 피크 영역의 RSD를 계산합니다.
- 동일한 샘플(CMT-4)의 6회 반복을 취하고, 위의 절차(단계 1.2)에 따라 샘플 용액을 준비하고, 1.1단계에 따라 HPLC에서 지문을 검출합니다. 상대 머무름 시간 및 상대 피크 영역의 RSD를 계산하고 1.3.5단계에 설명된 대로 반복성을 평가합니다.
- 그런 다음 그림 1B 의 피크 번호 10을 기준 피크로 사용하고 단계 1.3.5에 설명된 대로 각 공통 피크의 상대 머무름 시간 및 상대 피크 면적의 RSD를 계산합니다.
- 아래에 언급된 공식을 사용하여 각 공통 피크의 상대 머무름 시간과 상대 피크 면적을 계산합니다.
T re = T 특성/T참조
A re =특성/A참조
여기서, Tre=상대 머무름 시간, T 특성 = 특성 피크 체류 시간, T 기준 = 기준 피크 체류 시간, Are = 상대 피크 면적, A 특성 = 특성 피크 면적, 및 A 기준 = 기준 피크 면적.
참고: 중국 전통 의학 지문을 설정하려면 일반적으로 얻기 쉽고 분해능이 높은 크로마토그래피 피크를 선택해야 합니다. 이것은 지문을 식별하고 안정성과 재현성을 검사하기 위한 기준 피크로 사용됩니다.
2. 촨무통 지문 및 유사성 분석 수립
- 10 개의 정통 샘플 배치와 Clematis argentilucida (Levl. et Vant.) W. T. Wang (CC), Clematis apiifolia var. obtusidentata Rehd와 같은 5 개의 간음제를 사용하십시오. et 윌스. (DC), 클레 마티스 피터라 핸드 .- 마즈. (DE), 클레 마티스 구 리아나 록스. Var. finetii Rehd. et Wils (XS), 그리고 클레 마티스 파인 티아나 레블. et Vaniot. (SMT)를 지문 분석용 샘플로 사용합니다.
- 단계 1.2에 설명된 대로 샘플 용액을 준비합니다. 단계 1.1에 설명된 조건에 따라 HPLC로 모든 샘플 용액의 지문 분석을 수행합니다.
- 관련 데이터를 중국 전통 의학의 크로마토 그래피 지문의 유사성 평가 시스템으로 가져옵니다 (SESCF-TCM, 2012 버전). 시스템은 모든 샘플의 크로마토그램에서 합리적인 높이와 우수한 해상도를 가진 피크를 공통 피크로 지정합니다.
참고: SESCF-TCM 소프트웨어는 등록 후 중국 약전 위원회(http://114.247.108.158:8888/login) 웹사이트에서 다운로드할 수 있습니다.- 소프트웨어에서 메뉴에서 참조 스펙트럼 설정 버튼을 클릭합니다.
- 그런 다음 파라미터 설정 창에서 시간 창 너비를 0.5로 설정하고 제어 스펙트럼 생성 방법을 중앙값 방법으로 선택합니다.
- 메인 메뉴에서 다지점 보정을 클릭한 다음, 피크 매칭을 전체 스펙트럼 피크 매칭으로 선택합니다.
- 마지막으로 제어 생성을 클릭하여 Chuanmutong의 실제 종의 참조 크로마토그래피 지문을 생성합니다.
- 분석을 위해 정통 Chuanmutong 샘플 10개 배치와 불순물 5개 배치의 머무름 시간과 피크 영역을 SESCF-TCM으로 가져옵니다. 구체적인 작업은 다음과 같습니다.
- 소프트웨어에서 기본 메뉴의 참조 스펙트럼 설정 버튼을 클릭합니다.
- 파라미터 설정 창에서 Chuanmutong의 정통 종의 참조 크로마토그래피 지문을 참조로 설정하고 제어 스펙트럼 생성 방법을 중앙값 방법으로 선택하고 시간 창 너비를 0.5로 설정합니다.
- 메인 메뉴에서 다지점 보정을 클릭한 다음, 피크 매칭을 전체 스펙트럼 피크 매칭으로 선택합니다.
- 마지막으로 유사 성 계산을 클릭하여 Chuanmutong의 참조 크로마토그램 지문을 기반으로 유사성을 계산합니다. 마지막으로 한약 크로마토그래피 지문 평가 시스템(2012년 버전)을 사용하여 지문의 유사성을 계산합니다.
알림: 특정 작업에 대해서는 한약 크로마토그래피 지문 평가 시스템(2012 버전)의 작동 사양을 참조하십시오.
3. 촨무통 지문의 다중 패턴 인식 분석
- 클러스터 분석(CA)
- 실제 Chuanmutong 샘플 10 개 배치와 5 개 배치의 불순물 지문에서 12 개의 공통 피크의 피크 영역을 변수로 사용하고 체계적인 클러스터 분석 (CA)을 위해 통계 분석 소프트웨어에 입력하십시오.
- 그룹 간 방법을 선택하고 Pearson 상관 계수를 분류 기준으로 사용하여 Chuanmutong 및 그 간 음 물질의 클러스터 분석 다이어그램을 그립니다. 구체적인 작업은 다음과 같습니다.
- 통계 분석 소프트웨어에서 파일을 클릭하여 데이터를 가져옵니다.
- 메뉴에서 분석을 클릭하고 분류에서 시스템 클러스터링을 클릭합니다.
- 공통 피크 영역을 변수로 선택하고 군집 수를 4로 설정합니다.
- 방법을 클릭하고 클러스터링 방법을 그룹 간 연결로 선택하고 측정 간격을 Pearson 상관 관계로 선택한 다음 확인을 클릭하여 CA 맵을 그립니다.
- 주성분 분석 (PCA)
- 실제 품종과 불순물의 상대적 공통 피크 영역을 PCA 분석을 위해 분석 소프트웨어로 가져오고 PCA 점수 맵을 사용하여 샘플 차이의 점수 매트릭스 맵을 평가합니다. 구체적인 작업은 다음과 같습니다.
- 데이터 분석 소프트웨어를 열고 메뉴에서 파일을 클릭 한 다음 새 일반 프로젝트를 만듭니다. HPLC 시스템에서 스프레드시트(예: Excel 형식)로 12개의 공통 피크의 피크 영역을 가져옵니다. 그런 다음 마침 을 클릭하여 데이터 가져오기를 완료합니다.
- 새로 만들기를 클릭하여 새 모델을 생성하여 PCA로 모델 유형을 설정합니다. 자동 맞춤 및 추가를 클릭하여 데이터를 맞춘 다음 점수를 클릭하여 PCA 점수 맵을 가져옵니다.
- 실제 품종과 불순물의 상대적 공통 피크 영역을 PCA 분석을 위해 분석 소프트웨어로 가져오고 PCA 점수 맵을 사용하여 샘플 차이의 점수 매트릭스 맵을 평가합니다. 구체적인 작업은 다음과 같습니다.
- 직교 부분 최소제곱 판별 분석(OPLS-DA)
- 감독 모드와 함께 직교 부분 최소 제곱 판별 분석 방법을 사용하여 실제 Chuanmutong 품종 및 불순물의 상대적 공통 피크 면적 피크를 추가로 분석하고 모든 샘플의 OPLS-DA 분류 점수 맵을 그립니다. 구체적인 작업은 다음과 같습니다.
- 데이터 분석 소프트웨어의 메뉴에서 파일을 클릭하여 파일을 가져오고 새 일반 프로젝트를 만듭니다. HPLC 시스템에서 스프레드시트에 있는 12개의 공통 피크의 피크 영역을 가져온 다음 마침 을 클릭하여 데이터 가져오기를 완료합니다.
- 새로 만들기를 클릭하여 새 모델을 생성하여 PCA로 모델 유형을 설정합니다. 자동 맞춤 및 추가를 클릭하여 데이터를 피팅합니다. 그런 다음 점수를 클릭하여 PCA 점수 맵을 가져옵니다.
- 새로 만들기를 클릭하고 모델 1로 새로 만들기를 선택하여 OPLS-DA로 모델 유형을 설정합니다.
- 스케일을 클릭하고 모두를 위한 파로 유형을 설정합니다. 먼저 자동 맞춤을 클릭한 다음 점수를 클릭하여 OPLS-DA 점수 맵을 가져옵니다.
- Chuanmutong의 각 공통 피크가 분류 결과에 미치는 영향과 정품 Chuanmutong 재료와 관련 불순물 간의 차이를 확인하려면 분석을 위해 투영 (VIP)의 변수 중요도를 사용하십시오.
- Chuanmutong의 다양한 구성 요소에 대한 VIP 맵을 그립니다. 결과 VIP 맵을 사용하여 분류에 대한 각 변수의 영향을 평가하고 그룹 간 차이에 크게 기여하는 성분을 선별합니다. 구체적인 작업은 다음과 같습니다.
- 데이터 분석 소프트웨어의 메뉴에서 분석을 클릭하고 순열을 클릭하고 순열 수를 200으로 설정하고 OPLS-DA 점수 맵의 R 2 및 Q2를 가져옵니다.
- VIP를 클릭하고 VIP 예측을 선택하여 VIP 지도를 가져옵니다.
- 감독 모드와 함께 직교 부분 최소 제곱 판별 분석 방법을 사용하여 실제 Chuanmutong 품종 및 불순물의 상대적 공통 피크 면적 피크를 추가로 분석하고 모든 샘플의 OPLS-DA 분류 점수 맵을 그립니다. 구체적인 작업은 다음과 같습니다.
4. HPLC에 의한 촨무통의 β-시토스테롤 측정
- 크로마토그래피 조건(1.1단계 참조)
- 이동상을 준비하십시오 : 메탄올 - 물 (97 : 3).
- 이동상의 유속을 1.0mL/분으로 설정합니다.
- 30°C로 유지된 C18 컬럼(250 mm x 4.6 mm, 5 μm)에서 크로마토그래피 분리를 수행한다.
- 주입량을 10μL로 설정합니다.
- 204nm의 파장에서 성분을 검출합니다.
- 시료용액 준비
- β-시토스테롤(0.1mg/mL)의 스톡 표준물질을 정확하게 칭량된 양의 해당 표준물질을 메탄올에 용해시켜 준비합니다.
- 분석 원료의 시료를 내경 180 μm ± 7.6 μm의 나일론 메쉬에 통과시켜 균일한 입자 크기로 분쇄한다.
- 둥근 바닥 플라스크에 분쇄 된 원료 2g (정확하게 칭량)을 넣고 클로로포름 50mL를 첨가합니다.
- 플라스크를 환류 응축기에 연결하고 끓는 수조 (적당한 끓임)에서 60 분 동안 가열합니다. 15-20 μm 여과지로 추출 용액을 여과하십시오.
- 약 10분 동안 끓는 수조(적당한 끓임)에서 거의 건조될 때까지 여과액을 증발시킵니다.
- 잔류물을 용해하고 메탄올을 사용하여 부피를 5mL로 구성한다. 마지막으로 상청액을 0.45μm 필터 멤브레인에 통과시키고 대기 상태로 둡니다.
- 분석법 검증
- 하위 단계 4.2.1에서 제조 된 β- 시토스테롤의 저장 용액을 취하여 100 % 메탄올로 희석하고 100 μg / mL, 80 μg / mL, 60 μg / mL, 50 μg / mL, 40 μg / mL, 30 μg / mL 및 20 μg / mL 농도의 용액을 준비합니다.
- 단계 4.1에 설명된 크로마토그래피 조건에서 샘플을 주입하여 피크 면적을 결정하고, 주입 부피에 대한 피크 영역을 사용한 회귀 분석을 수행하고, 회귀 방정식 및 상관 계수를 얻어 선형성을 평가합니다.
- 상기와 같이 샘플을 준비하고(단계 4.2) 이를 같은 날에 6회 HPLC 분석(단계 4.1)한다. 그런 다음 피크 영역의 RSD를 계산하여 정밀도를 평가합니다.
- 단계 4.1에 설명된 대로 0, 2, 4, 6, 8, 12 및 24시간 동안 RT에 저장된 동일한 샘플 용액을 분석하여 샘플 용액의 안정성을 평가합니다. 그런 다음 1.3.5단계에서 설명한 대로 피크 영역의 RSD를 계산합니다.
- 동일한 샘플 (CMT-4)을 단계 4.2에 기재된 바와 같이 제조된 육분투액에 용해시키고, 이를 단계 4.1에 기재된 바와 같이 HPLC 분석을 실시함으로써 반복성을 검사한다. 그런 다음 6 개의 샘플에서 β- 시토스테롤 함량의 RSD를 계산하십시오.
- 표준 첨가 방법을 사용하여 방법의 정확도를 평가합니다. 이를 위해 β-시토스테롤 함량의 80%, 100% 및 120%에서 샘플에 β-시토스테롤 기준 용액을 추가하고 4.1단계에 설명된 대로 각 조건을 세 번 반복합니다. 평균 회수율과 RSD를 계산하여 방법의 정확도를 평가합니다.
참고: 회복률(RR)의 계산 공식은 다음과 같습니다.
RR % = [(M t - M 0) / Ms] × 100
여기서 Mt는 표준물질을 첨가한 후의 β-시토스테롤의 품질, M0 = 시료 용액의 품질, 및Ms = 첨가된 β-시토스테롤의 품질이다.
- 시료의 β-시토스테롤 함량 측정
- 4.2 단계에 따라 샘플 용액을 준비하기 위해 정통 한약 재료 10 배치와 관련 불순물 5 배치를 취하십시오.
- 그런 다음 각 샘플 용액과 β-시토스테롤 기준 용액을 주입하여 단계 4.1에 설명된 조건에서 피크 면적을 결정하고 외부 표준 원포인트 방법을 사용하여 각 샘플의 β-시토스테롤 함량을 계산합니다.
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Representative Results
촨무통의 크로마토그래피 지문 및 유사성 분석(SA)
정밀도, 반복성 및 안정성의 상대적 머무름 시간의 RSD 값은 각각 0.46%, 1.65% 및 0.53% 미만이었습니다. 상대 피크 영역의 RSD 값은 각각 4.23%, 3.56% 및 3.96% 미만이었다. 그림 1A, B에서 볼 수 있듯이 10개의 정통 Chuanmutong 샘플의 HPLC 지문에는 12개의 뚜렷한 공통 피크(피크 1에서 피크 12까지)가 있었습니다. 10 호의 피크 면적이 상대적으로 컸기 때문에 해상도가 좋았습니다. 각 샘플에 존재하는 성분이었기 때문에 지문의 안정성과 재현성을 조사하기 위한 기준 피크로 사용되었습니다. 이어서, 피크 번호 10을 기준 피크(S)로 취하고, 나머지 11번 피크의 상대 체류 시간을 계산하였다.
유사성 분석에서 상관 계수가 1에 가까울수록 표본 간의 유사성이 높아집니다. 표 1에 나타낸 바와 같이, Chuanmutong의 10 배치의 유사도는 0.910-0.989였다. 이 결과는 Chuanmutong의 10 개 배치가 높은 유사성과 우수한 일관성을 가졌으며, 이는 Chuanmutong의 전반적인 품질을 평가하는 데 사용할 수 있음을 보여주었습니다. 그림 1C에 도시된 바와 같이, 간음제의 5개 배치의 지문이 얻어졌다. 5 개 배치의 간음제의 지문과 Chuanmutong의 대조 지문 사이의 유사성은 0.133-0.720 (표 1)에 불과했으며, 이는 실제 샘플과 관련 간음제 사이에 명백한 차이가 있음을 나타냅니다. 차이는 주로 28-55분에 크로마토그램 상의 크로마토그래피 피크 수에 집중되었다. 따라서 Chuanmutong의 제어 지문은 실제 샘플을 관련 불순물과 효과적으로 구별 할 수 있습니다.
SPSS 26 통계 소프트웨어는 본 실험에서 CA 분석에 사용되었다(도 2A); 15 개의 샘플 배치는 분류 거리가 20 일 때 두 가지 범주로 나뉩니다. 첫 번째 범주는 Chuanmutong과 그 습관성 간음자 (CC)의 10 배치였습니다. 두 번째 범주는 DC, DE, XS 및 SMT를 포함한 Chuanmutong의 간음자였습니다. 분류 거리가 4 일 때, 모든 샘플은 4 개의 범주로 나뉘었다. 첫 번째 범주는 Chuanmutong의 10 배치, 두 번째 범주는 CC, 세 번째 범주는 SMT 및 XS, 네 번째 범주는 DC 및 DE였습니다. 분류 결과에 따르면 Chuanmutong의 정통 품종의 품질은 기본적으로 동일했으며 모든 불순물과 명백한 차이가 있음을 보여주었습니다. 동시에 다른 간음제와 비교할 때 CC는 Chuanmutong의 정통 품종에 더 가까웠지만 분류 거리가 좁아지면 여전히 구별 할 수 있습니다.
15개 샘플 배치의 공통 피크 영역을 PCA 분석을 위해 데이터 분석 소프트웨어로 가져왔고, 스코어 매트릭스(R2x = 0.994, Q2=0.961)(그림 2B)는 15개 샘플 배치의 클러스터링 효과가 뚜렷함을 보여주었습니다. Y 축의 오른쪽에는 10 개의 Chuanmutong 및 CC 배치가있었습니다. 그 중 CC는 Chuanmutong의 정통 품종과 다른 첫 번째 사분면에 위치했습니다. Y 축의 왼쪽은 SMT, XS, DE 및 DC를 포함한 불순물이었습니다. 그 중 SMT와 XS는 두 번째 사분면에 위치했고 DE와 DC는 세 번째 사분면에 위치했습니다. Chuanmutong의 정통 품종과 기존 간음제를 비교하면서 CC와 정통 품종의 차이는 상대적으로 작은 반면 정통 간음과 다른 간음제의 차이는 분명합니다.
Chuanmutong과 그 불순물의 공통 피크 영역을 변수로 사용하고 OPLS-DA용 데이터 분석 소프트웨어로 가져온 다음 점수 매트릭스를 그렸습니다(그림 3A). OPLS-DA 모델의 R2 x [1]은 0.695이고 R2x [2]는 0.605로 둘 다 0.5보다 크며, 이는 모델이 안정적이고 신뢰할 수 있으며 실제 샘플과 불순물을 구별하는 데 사용할 수 있음을 나타냅니다.
도 3A로부터 진짜와 다른 불순물의 샘플 포인트가 완전히 분리되었고, 샘플 포인트들 사이에 교차점이 없음을 알 수 있다. 모든 샘플은 세 부분으로 나누어졌다. Chuanmutong과 CC의 정통 품종은 비슷했습니다. XS, DC 및 DE의 샘플은 하나의 클래스로 그룹화되었으며 SMT 샘플은 마지막 클래스였습니다. 또한, 투영(VIP)에서 가변 중요도의 판단 방법(그림 3B)을 사용하여 각 샘플의 지문에서 서로 다른 성분의 피크를 스크리닝했습니다. VIP > 1.0은 샘플 그룹 간의 분류에 크게 기여하는 seveb 변수를 선별하는 표준으로 사용되었습니다. 스크리닝 결과에 따르면, 정통 샘플과 불순물 간의 조성 차이를 일으킨 주요 마커 성분은 피크 번호 9, No. 5, No. 7, No. 6, No. 10, No. 3 및 No. 2였다. 나머지 피크의 VIP 값은 1 미만이었으며 샘플 식별에 거의 영향을 미치지 않았습니다.
β- 시토스테롤 피크 면적과 용액 농도 사이의 선형 관계는 회귀 분석을 사용하여 발견되었습니다. 이 의존성은 방정식 Y = 5.4918 X-4.5563을 따랐으며, 여기서 Y는 β- 시토스테롤 피크 면적이고 X는 μg / mL 단위의 β- 시토스테롤 함량입니다. 동시에 상관 계수 r = 0.9995로 요구 사항을 충족합니다. 정밀도 시험, 안정성 시험 및 반복성 시험의 RSD는 각각 1.76 %, 4.22 % 및 3.85 %였다. 결과는 β- 시토스테롤 함량의 측정 방법이 우수한 선형성, 정밀도 및 반복성을 가지며 샘플 용액이 24 시간 이내에 안정적임을 보여줍니다. 세 가지 수준에서 평균 회복률은 101.50%, 101.90% 및 100.72%였습니다. 해당 RSD는 각각 2.56%, 1.56% 및 1.68%였다. 이론적 인 값과 실제 결정된 값 사이의 좋은 일치는 분석 방법의 정확성과 적용 가능성을 확인시켜주었습니다. β- 시토스테롤의 액체 크로마토 그램이 그림 4에 나와 있으며, 15 개의 샘플 배치에서 β- 시토스테롤의 함량이 결정되었습니다 (표 2). 결과는 10 개의 실제 샘플 배치에서 β- 시토스테롤의 농도가 97.53-161.56 μg / g (비교적 안정한) 범위에 있음을 보여주었습니다. 이 구성 요소는 5 개의 간음 물질 배치 모두에서 검출되었지만 내용은 크게 다릅니다.
그림 1: 촨무퉁과 그 간음자들의 지문. (A) 정통 촨무통 샘플 10개 배치의 지문(S1: CMT-1, S2: CMT-2, S3: CMT-3, S4: CMT-4, S5: CMT-5, S6: CMT-6, S7: CMT-7, S8: CMT-8, S9: CMT-9, S10: CMT-10). (B) 정품 Chuanmutong 샘플의 기준 크로마토 그램 지문; 상대 머무름 시간은 0.18(피크 번호 1), 0.22(피크 번호 2), 0.29(피크 번호 3), 0.72(피크 번호 4), 0.75(피크 번호 5), 0.82(피크 번호 6), 0.86(피크 번호 7), 0.92(피크 번호 8), 0.96(피크 번호 9), 1.00(피크 번호 10), 1.02(피크 번호 11), 1.37(피크 번호 12)이었습니다. (C) 5 개의 Chuanmutong 간음제 (S1 : CC, S2 : DC, S3 : DE, S4 : XS, S5 : SMT)의 지문. (D) 정품 Chuanmutong 샘플의 참조 크로마토그램 지문과 불순물의 5개 배치(S1: 참조 크로마토그램 지문, S2: CC, S3: DC, S4: DE, S5: XS, S6: SMT) 간의 비교. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: 정통 Chuanmutong 샘플 10개 배치와 불순물 5개 배치에 대한 CA 및 PCA 분석. (A) CA 분석. (B) PCA 분석. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: OPLS-DA 점수 맵 및 VIP 점수 맵은 정통 Chuanmutong 샘플 10개 배치와 불순물 5개 배치입니다. (A) OPLS-DA 점수 맵. (B) VIP 점수 맵. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4: β-시토스테롤의 액체 크로마토그램. S1 : β- 시토스테롤, S2 : CMT-4, S3 : XS, S4 : DC, S5 : SMT, S6 : CC, S7 : DE. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
| 샘플 | 이름 | 유사성 |
| 촨무통의 진짜 품종 | CMT-1 | 0.947 |
| CMT-2 | 0.910 | |
| CMT-3 | 0.989 | |
| CMT-4 | 0.937 | |
| CMT-5 | 0.989 | |
| CMT-6 | 0.988 | |
| CMT-7 | 0.956 | |
| CMT-8 | 0.959 | |
| CMT-9 | 0.939 | |
| CMT-10 | 0.966 | |
| 간음자 | 참조 | 0.599 |
| 직류 | 0.720 | |
| 드 | 0.133 | |
| 증권 시세 표시기 | 0.694 | |
| 증권 시세 표시기 | 0.180 |
표 1 : 정통 Chuanmutong 샘플 10 개 배치와 그 불순물의 유사성 결과. 관련 데이터를 한약 크로마토 그래피 지문 평가 시스템으로 가져와 정통 Chuanmutong 샘플 10 배치와 불순물 5 배치의 유사성을 계산했습니다.
| 샘플 | 이름 | 함량 (μg / g) |
| 촨무통의 진짜 품종 | CMT-1 | 103.5 |
| CMT-2 | 124.6 | |
| CMT-3 | 131 | |
| CMT-4 | 121.1 | |
| CMT-5 | 97.5 | |
| CMT-6 | 113.8 | |
| CMT-7 | 105.6 | |
| CMT-8 | 161.6 | |
| CMT-9 | 118 | |
| CMT-10 | 123.5 | |
| 간음자 | 참조 | 157.4 |
| 직류 | 165.6 | |
| 드 | 32.9 | |
| 증권 시세 표시기 | 69.7 | |
| 증권 시세 표시기 | 192.2 |
표 2: 정통 Chuanmutong 샘플과 그 불순물의 β-시토스테롤 함량 측정 결과.
보충 그림 1: 다양한 시료 준비 조건 및 다양한 크로마토그래피 조건에서의 액체 크로마토그래피. (A) 이동상 시스템(S1: 아세토니트릴-0.1% 포름산 용액, S2: 아세토니트릴-0.5% 아세트산 용액, S3: 아세토니트릴-순수, S4: 아세토니트릴-0.05% 인산 용액, S5: 메탄올-순수). (b) 검출 파장(S1: 205 nm, S2: 230 nm, S3: 250 nm, S4: 300 nm). (C) 컬럼 온도(S1: 20°C, S2: 30°C, S3: 40°C). (D) 유속 (S1 : 0.8 mL / 분, S2 : 0.9 mL / 분, S3 : 1.0 mL / 분). (e) 추출방법(S1: 초음파 추출, S2: 환류 추출). (F) 추출용매(S1: 에틸아세테이트, S2: 에탄올, S3: 클로로포름, S4: 노말부탄올, S5: 메탄올). (g) 추출 시간(S1: 15분, S2: 30분, S3: 60분). 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
보충 그림 2: 에르고스테롤, 스티그마스테롤 및 정통 Chuanmutong의 액체 크로마토그램. S1 : 스티그마 스테롤, S2 : 에르고 스테롤, S3 : CMT-4. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
연구를 위한 샘플 수집은 중국 약재의 진위 여부를 식별하는 다중 패턴 인식을 구축하는 첫 번째 핵심 단계입니다. 시장 조사를 통해 우리는 쓰촨 야안, 량산, 러산이 촨무통의 야생 자원의 주요 생산 지역임을 발견했습니다. 같은 속의 관련 품종도 동일한 지리적 분포 6,20을 가지고 있습니다. CC, DC, DE, XS 및 SMT는 종종 Chuangmutong16,21; 따라서이 연구에서는 위에서 언급 한 원산지에서 정통 Chuanmutong 10 배치와 혼합 샘플 5 배치를 수집하고 품종의 정확성을 확인했습니다.
두 번째 핵심 단계는 화학 성분에 대해 가능한 한 많은 정보를 표시할 수 있는 HPLC 지문의 검출 조건을 선별하는 것입니다. 이 연구에서는 보충 그림 1에 표시된 바와 같이 추출 방법, 추출 용매 및 추출 시간을 포함한 다양한 준비 조건에서 크로마토그래피 피크의 수와 면적을 얻었습니다. Chuanmutong 샘플 용액의 최적 준비 방법이 결정되었습니다. 한편, 상이한 크로마토그래피 조건 하에서 샘플의 크로마토그래피 피크의 수 및 분리능을 비교하였다. 이동상 시스템, 예컨대 아세토니트릴-0.1% 포름산 용액, 아세토니트릴-0.5% 아세트산 용액, 아세토니트릴-0.05% 인산 용액, 및 메탄올-순수, 검출 파장, 예컨대 205 nm, 230 nm, 250 nm, 및 300 nm, 컬럼 온도, 예컨대 20°C, 30°C, 및 40°C, 및 유속, 예컨대 0.8-1.0 mL/min, 조사되었다. Chuanmutong의 샘플을 분석하기위한 최적의 크로마토 그래피 조건이 결정되었습니다. 또한, 그 타당성은 방법 론적 검증에 의해 확인되었고, Chuanmutong의 HPLC 지문의 검출 방법이 성공적으로 구성되었다.
세 번째 핵심 단계는 정통 한약과 그 간음자의 지문에서 다른 정보를 분석하고 찾는 것입니다. 이 연구에서는 먼저 SESCF-TCM (2012 버전)을 사용하여 지문의 유사성을 분석했습니다. 정품 Chuanmutong 샘플 10 배치의 지문과 대조 특성 지문 사이의 유사성이 매우 높은 것으로 나타났습니다. 이에 비해 5 개의 불순물 배치의 지문과 제어 특성 지문 간의 유사성은 실제 샘플보다 현저히 낮았습니다. 그런 다음 화학 지문의 공통 피크 정보를 분석하기 위해 CA, PCA 및 OPLS-DA를 추가로 도입했습니다. CA 및 PCA 결과는 서로 다른 간음제 중에서 일반적으로 사용되는 간음 CC가 구별하기 어려운 진통 CC에 상대적으로 더 가깝다는 것을 보여줍니다. 그러나, CA의 분류 거리가 4로 수정되면, 진짜와 간음자 사이의 효과적인 식별이 달성될 수 있다. 정통 물질의 12 개의 공통 피크를 기반으로 OPLS-DA에 의해 불순물의 차등 피크의 기여 값을 정량적으로 평가하여 7 개의 시차 크로마토 그래피 피크, 즉 피크 번호 9, 피크 번호 5, 피크 번호 7, 피크 번호 6, 피크 번호 10, 피크 번호 3 및 피크 번호 2를 얻었습니다. 이것들은 Chuanmutong의 진품과 가짜 재료를 효과적으로 식별하는 데 사용할 수 있으며, 이는 진품과 간음의 차이의 주요 표시 구성 요소입니다.
중국 약전의 최신판에는 아직 Chuanmutong의 유효 성분에 대한 함량 결정이 포함되어 있지 않습니다. 품질 관리를 개선하기 위해이 연구는 이전 보고서22,23,24,25,26에서 이뇨 작용과 관련된 β- 시토스테롤, 에르고 스테롤, 시토스테롤 및 올레아놀산과 같은 활성 성분의 함량 결정 방법을 조사했습니다. 보충 그림 2에서 볼 수 있듯이 에르고스테롤은 정통 Chuanmutong에서 검출되지 않았으며 스티그마스테롤은 크로마토그램에서 분리되기 어렵고 정확하게 정량할 수 없었습니다. 마지막으로, β- 시토스테롤의 함량 결정 방법이 확립되었다; 검출 결과에 따르면 β-시토스테롤은 10 배치의 정통 Chuanmutong 샘플과 5 배치의 간음제에서 발견되었습니다. 따라서 β-시토스테롤은 진짜 의약재에만 국한된 것이 아닙니다. Chuanmutong의 품질에 대한 일부 정보를 제공할 수 있지만 향후 지문의 시차 크로마토그래피 피크를 추가로 분석하여 Chuanmutong의 효능과 관련된 특정 성분을 찾을 수 있는지 확인해야 합니다.
현재 중국 전통 의약품은 종종 화학적 지문 스펙트럼의 유사성으로 식별됩니다. 그러나 이 지표는 샘플 크로마토그래피 피크의 전체 정보를 기반으로 하는 매개변수로, 다른 샘플의 식별 및 주요 차이점에 대한 자세한 정보를 제공할 수 없습니다. 따라서이 연구는 CA, PCA 및 OPLS-DA를 사용하여 화학 지문의 공통 피크 정보를 식별하고 Chuanmutong의 정품 샘플과 불순물 샘플 사이의 주요 시차 크로마토 그래피 피크를 발견하고 성공적으로 식별했습니다. 마지막으로, 다중 패턴 인식을위한 HPLC 결합 화학 지문이 구성되었습니다.
Fritillaria thunbergii, Herba Asari, Lonicera japonica와 같은 정통 중국 약재와 간음 물질을 혼합하는 것은 드문 일이 아니기 때문에이 방법은 정통 중국 약재와 그 간음 물질을 명확하고 과학적으로 식별하기위한 새로운 전략을 제공 할 것입니다. 이 전략은 임상 적용에서 한약재의 품질을 보장하는 데 큰 의미가 있습니다.
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Disclosures
저자는 공개 할 것이 없습니다.
Acknowledgments
이 작업은 쓰촨 한약청 프로젝트(no. 2020JC0088, no. 2021MS203)의 지원을 받았습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acetic acid | Zhiyuan Chemical Reagent Co., Ltd., Tianjin, China | 2017381038 | |
| Acetonitrile | Sigma-Aldrich Trading Co., Ltd., Shanghai, China | WXBD5243V | |
| β-Sitosterol | Meisai Biological Technology Co., Ltd., Chongqing, China | 20210201 | |
| C18 column | Yuexu Material Technology Co., Ltd., Shanghai, China | Welch Ultimate LP | |
| Chuanmutong | Guoqiang Chinese Herbal Pieces Co., Ltd., Sichuan, China | 19020103 | CMT-1 |
| Chuanmutong | Hongya Wawushan Pharmaceutical Co., Ltd., Sichuan, China | 200701 | CMT-2 |
| Chuanmutong | Hongpu Pharmaceutical Co., Ltd., Sichuan, China | 200701 | CMT-3 |
| Chuanmutong | Hongpu Pharmaceutical Co., Ltd., Sichuan, China | 200901 | CMT-4 |
| Chuanmutong | Xinrentai Pharmaceutical Co., Ltd., Sichuan, China | 210701 | CMT-5 |
| Chuanmutong | Haobo Pharmaceutical Co., Ltd., Sichuan, China | 210401 | CMT-6 |
| Chuanmutong | Xinrentai Pharmaceutical Co., Ltd., Sichuan, China | 200901 | CMT-7 |
| Chuanmutong | Wusheng Pharmaceutical Group Co., Ltd., Sichuan, China | 201201 | CMT-8 |
| Chuanmutong | Limin Chinese Herbal Pieces Co., Ltd., Sichuan, China | 201001 | CMT-9 |
| Chuanmutong | Yuhetang Pharmaceutical Co., Ltd., Sichuan, China | 210501 | CMT-10 |
| Clematis argentilucida (Levl. et Vant.) W. T. Wang | Madzi Bridge, Sanlang Township, Tianquan County, Sichuan, China | - | CC |
| Clematis apiifolia var. obtusidentata Rehd. et Wils. | Heilin Village, Qiliping Township, Hongya County, Sichuan, China | - | DC |
| Clematis peterae Hand.-Mazz. | Huangmu Village, Huangmu Township, Hanyuan County, Sichuan, China | - | DE |
| Clematis gouriana Roxb. Var. finetii Rehd. et Wils | Mixedang Mountain, Huangwan Township, Emei County, Sichuan, China | - | XS |
| Clematis finetiana Levl. et Vaniot. | Wannian Village, Huangwan Township, Emei County, Sichuan, China | - | SMT |
| Electronic balance | Haozhuang Hengping Scientific Instrument Co., Ltd., Shanghai, China | FA1204 | |
| Ergosterol | Meisai Biological Technology Co., Ltd, Chongqing, China | 20210201 | |
| Ethanol | Kelon Chemical Co., Ltd., Chengdu, China | 2021112602 | |
| Ethyl acetate | Zhiyuan Chemical Reagent Co., Ltd., Tianjin, China | 2017042043 | |
| Formic acid | Kelon Chemical Co., Ltd., Chengdu, China | 2016062901 | |
| High performance liquid chromatography | Agilent, USA. | 1260 | |
| IBM SPSS Statistics version 26.0 | International Business Machines Corporation, USA | - | |
| Methanol | Sigma-Aldrich Trading Co., Ltd., Shanghai, China | WXBD6409V | |
| Methanol | Kelon Chemical Co., Ltd., Chengdu, China | 202010302 | |
| n-butyl alcohol | Zhiyuan Chemical Reagent Co., Ltd., Tianjin, China | 2020071047 | |
| Petroleum ether | Zhiyuan Chemical Reagent Co., Ltd., Tianjin, China | 2020090125 | |
| Phosphoric acid | Comeo Chemical Reagent Co., Ltd., Tianjin, China | 20200110 | |
| SESCF-TCM version 2012 | National Pharmacopoeia Commission, China | - | http://114.247.108.158:8888/login |
| Stigmasterol | Meisai Biological Technology Co., Ltd., Chongqing, China | 20210201 | |
| Trichloromethane | Sinopharm Group Chemical Reagent Co., Ltd., Shanghai, China | 20200214 | |
| Umetrics SIMCA version 14.1.0.2047 | Umetrics, Sweden | - | https://www.sartorius.com/en/products/process-analytical-technology/data-analytics-software/mvda-software/simca/simca-free-trial-download |
| Ultrapure water machine | Youpu Ultrapure Technology Co., Ltd., Sichuan, China | UPH-II-10T | |
| Ultrasonic cleaner | Kunshan Hechuang Ultrasound Instrument Co., Ltd., Jiangsu, China | KH3200E |
References
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