كرويات الكبد البشري من الدم المحيطي لدراسات أمراض الكبد
Summary
نقدم هنا طريقة غير وراثية لتوليد كرويات كبدية ذاتية بشرية باستخدام خلايا أحادية النواة معزولة من الدم المحيطي المستقر.
Abstract
يمكن أن تشكل خلايا الكبد البشرية بنية ثلاثية الأبعاد (3D) قادرة على النمو في الثقافة لعدة أسابيع ، والحفاظ على قدرتها الوظيفية. نظرا لطبيعتها في التجمع في أطباق الاستزراع ذات الخصائص اللاصقة المنخفضة أو المعدومة ، فإنها تشكل تجمعات من خلايا الكبد المتعددة التي تسمى كرويات الكبد البشري. يعتمد تكوين كرويات الكبد 3D على الميل الطبيعي للخلايا الكبدية للتجمع في غياب ركيزة لاصقة. هذه الهياكل 3D تمتلك استجابات فسيولوجية أفضل من الخلايا ، والتي هي أقرب إلى بيئة في الجسم الحي . استخدام ثقافات خلايا الكبد 3D له مزايا عديدة عند مقارنته بالثقافات الكلاسيكية ثنائية الأبعاد (2D) ، بما في ذلك بيئة دقيقة أكثر صلة بيولوجيا ، ومورفولوجيا معمارية تعيد تجميع الأعضاء الطبيعية بالإضافة إلى تنبؤ أفضل فيما يتعلق بحالة المرض وفي استجابات شبيهة بالجسم الحي للأدوية. يمكن استخدام مصادر مختلفة لتوليد كرويات ، مثل أنسجة الكبد الأولية أو خطوط الخلايا الخالدة. يمكن أيضا هندسة أنسجة الكبد 3D باستخدام الخلايا الجذعية الجنينية البشرية (hESCs) أو الخلايا الجذعية المستحثة متعددة القدرات (hiPSCs) لاشتقاق خلايا الكبد. لقد حصلنا على كرويات الكبد البشري باستخدام الخلايا الجذعية متعددة القدرات المشتقة من الدم (BD-PSCs) المتولدة من الدم المحيطي غير المعالج عن طريق تنشيط البروتين المرتبط بغشاء الإنسان المرتبط ب GPI والمتمايز إلى خلايا الكبد البشرية. تم تحليل خلايا الكبد البشرية المشتقة من BD-PSCs وكرويات الكبد البشري عن طريق الفحص المجهري الضوئي والتنميط المناعي باستخدام علامات خلايا الكبد البشرية.
Introduction
في السنوات الأخيرة ، أصبحت أنظمة الاستزراع الكروي ثلاثية الأبعاد (3D) أداة مهمة لدراسة مختلف مجالات أبحاث السرطان واكتشاف الأدوية وعلم السموم. تثير هذه الثقافات اهتماما كبيرا لأنها تسد الفجوة بين أحاديات زراعة الخلايا ثنائية الأبعاد (2D) والأعضاء المعقدة1.
في حالة عدم وجود سطح لاصق ، مقارنة بثقافة الخلايا 2D ، يعتمد تكوين الكائنات الكروية على التقارب الطبيعي لهذه الخلايا للتجمع في شكل 3D. تنظم هذه الخلايا نفسها في مجموعات تتكون من نوع واحد أو أكثر من الخلايا الناضجة. خالية من المواد الغريبة ، تتفاعل هذه الخلايا مع بعضها البعض كما هو الحال في بيئتها المكروية الأصلية. الخلايا في ثقافة 3D أقرب بكثير ولها اتجاه مناسب تجاه بعضها البعض ، مع إنتاج مصفوفة خارج الخلية أعلى من الثقافات ثنائية الأبعاد ، وتشكل بيئة قريبة من البيئة الطبيعية 2.
تم استخدام النماذج الحيوانية لفترة طويلة لدراسة البيولوجيا البشرية والأمراض3. في هذا الصدد ، هناك اختلافات جوهرية بين البشر والحيوانات ، مما يجعل هذه النماذج غير مناسبة تماما للدراسات الاستقراءية. تمثل كرويات الثقافة ثلاثية الأبعاد والكائنات العضوية أداة واعدة لدراسة البنية الشبيهة بالأنسجة والتفاعل والحديث المتبادل بين أنواع الخلايا المختلفة التي تحدث في الجسم الحي ويمكن أن تساهم في تقليل أو حتى استبدال النماذج الحيوانية. فهي ذات أهمية خاصة لدراسة التسبب في أمراض الكبد وكذلك منصات فحص المخدرات4.
تعتبر ثقافة كروية 3D ذات أهمية خاصة لأبحاث السرطان لأنها يمكن أن تقضي على الانقطاع بين الخلايا وبيئتها عن طريق تقليل الحاجة إلى علاج التربسين أو كولاجيناز اللازم لإعداد أحاديات الخلايا السرطانية لثقافات 2D. تمكن الأجسام الكروية للورم من دراسة كيفية تلقي الخلايا الطبيعية مقابل الخلايا الخبيثة للإشارات من محيطهاوالاستجابة لها 5 وهي جزء مهم من دراسات بيولوجيا الورم.
بالمقارنة مع monolayer ، تشبه ثقافات 3D التي تتكون من أنواع مختلفة من الخلايا أنسجة الورم في خصائصها الهيكلية والوظيفية ، وبالتالي فهي مناسبة لدراسة ورم خبيث وغزو الخلايا السرطانية. هذا هو السبب في أن هذه النماذج الكروية تساهم في تسريع أبحاث السرطان6.
تساعد الكائنات الكروية أيضا في تطوير التكنولوجيا اللازمة لإنشاء عضويات بشرية لأن بيولوجيا الأنسجة والأعضاء صعبة للغاية للدراسة ، خاصة في البشر. التقدم في زراعة الخلايا الجذعية يجعل من الممكن تطوير ثقافات 3D مثل المواد العضوية التي تتكون من الخلايا الجذعية وأسلاف الأنسجة وكذلك أنواع مختلفة من الخلايا الناضجة (الأنسجة) من عضو مع بعض الخصائص الوظيفية مثل العضو الحقيقي الذي يمكن استخدامه لنمذجة تطور الأعضاء والأمراض ، ولكن يمكن اعتبارها أيضا مفيدة في الطب التجديدي7.
عادة ما تستخدم خلايا الكبد البشرية الأولية لدراسة البيولوجيا المختبرية لخلايا الكبد البشرية ، ووظائف الكبد ، والسمية التي يسببها الدواء. ثقافات خلايا الكبد البشرية لها عيبان رئيسيان ، أولا ، التوافر المحدود للأنسجة الأولية مثل خلايا الكبد البشرية ، وثانيا ، ميل خلايا الكبد إلى عدم التمايز بسرعة في ثقافة 2D وبالتالي فقدان وظيفة خلايا الكبد المحددة8. الثقافات الكبدية 3D متفوقة في هذا الصدد وقد تم تصنيعها مؤخرا من الخلايا الجذعية الجنينية البشرية المتمايزة (hESCs) أو الخلايا الجذعية المستحثة متعددة القدرات (hiPSCs) 9. تعتبر كرويات 3D الكبدية المهندسة بيولوجيا ذات أهمية خاصة لدراسة التطور والسمية والأمراض الوراثية والمعدية للكبد ، وكذلك في اكتشاف الأدوية لعلاج أمراض الكبد10. أخيرا ، لديهم أيضا إمكانية استخدامها سريريا ، مع العلم أن أمراض الكبد الحادة لها معدل وفيات يقارب 80٪ ، والكبد الاصطناعي الحيوي و / أو كرويات الكبد يمكن أن تنقذ هؤلاء المرضى من خلال توفير وظائف الكبد الجزئية حتى يمكن العثور على متبرع مناسب11.
لقد أنشأنا بروتوكولا لتوليد كرويات كبدية بشرية باستخدام الخلايا الجذعية متعددة القدرات المشتقة من الدم (BD-PSCs) لإعداد كرويات مختلفة الحجم تحتوي على 4000 إلى 1 × 106 خلايا وتحليلها عن طريق الفحص المجهري الضوئي والتألق المناعي. اختبرنا أيضا قدرة الوظيفة الخاصة بخلايا الكبد ، وتقييم تعبير إنزيمات السيتوكروم P450 3A4 (CYP3A4) و 2E1 (CYP2E1) التي تنتمي إلى عائلة السيتوكروم P450 التي لها أدوار مهمة في التمثيل الغذائي الخلوي والدواء من خلال عملية إزالة السموم12.
Protocol
Representative Results
Discussion
الكبد هو عضو رئيسي في جسم الإنسان له العديد من الوظائف البيولوجية الأساسية ، مثل إزالة السموم من الأيضات. بسبب فشل الكبد الحاد مثل تليف الكبد و / أو التهاب الكبد الفيروسي ، هناك ما يقرب من 2 مليون حالة وفاة سنويا في جميع أنحاء العالم. تحتل عمليات زرع الكبد المرتبة الثانية في عمليات زرع الأعض?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ويعرب أصحاب البلاغ عن امتنانهم الخاص للمساعدة التقنية التي قدمها أوكسانا وجون غريناكر. تم دعم هذا العمل من قبل ACA CELL Biotech GmbH هايدلبرغ ، ألمانيا.
Materials
| Albumin antibody | Sigma-Aldrich | SAB3500217 | produced in chicken |
| Albumin Fraction V | Carl Roth GmbH+Co. KG | T8444.4 | |
| Alpha-1 Fetoprotein | Proteintech Germany GmbH | 14550-1-AP | rabbit polyclonal IgG |
| Biolaminin 111 LN | BioLamina | LN111-02 | human recombinant |
| CD45 MicroBeads | Miltenyi | 130-045-801 | nano-sized magnetic beads |
| Cell Strainer | pluriSelect | 43-10040-40 | |
| CellSens | Olympus | imaging software | |
| Centrifuge tubes 50 mL | Greiner Bio-One | 210270 | |
| CEROplate 96 well | OLS OMNI Life Science | 2800-109-96 | |
| CKX53 | Olympus | ||
| Commercially available detergent | Procter & Gamble | nonionic detergent | |
| CYP2E1-specific antibody | Proteintech Germany GmbH | 19937-1-AP | rabbit polyclonal antibody IgG |
| CYP3A4 | Proteintech Germany GmbH | 67110-1-lg | mouse monoclonal antibody IgG1 |
| Cytokeratin 18 | DakoCytomation | M7010 | mouse monoclonal antibody IgG1 |
| DMSO | Sigma-Aldrich | D8418-50ML | |
| DPBS | Thermo Fisher Scientific | 14040091 | |
| FBS | Merck Millipore | S0115/1030B | Discontinued. Available under: TMS-013-B |
| Glass cover slips 14 mm | R. Langenbrinck | 01-0014/1 | |
| GlutaMax 100x Gibco | Thermo Fisher Scientific | 35050038 | L-glutamine |
| Glutaraldehyde 25% | Sigma-Aldrich | G588.2-50ML | |
| Goat anti-mouse IgG Cy3 | Antibodies online | ABIN1673767 | polyclonal |
| Goat anti-mouse IgG DyLight 488 | Antibodies online | ABIN1889284 | polyclonal |
| Goat anti-rabbit IgG Alexa Fluor 488 | Life Technologies | A-11008 | |
| HCl | Sigma-Aldrich | 30721-1LGL | |
| HepatoZYME-SFM | Thermo Fisher Scientific | 17705021 | hepatocyte maturation medium |
| HGF | Thermo Fisher Scientific | PHG0324 | human recombinant |
| HNF4α antibody | Sigma-Aldrich | ZRB1457-25UL | clone 4C19 ZooMAb Rbmono |
| Hydrocortisone 21-hemisuccinate (sodium salt) | Biomol | Cay18226-100 | |
| Knock out Serum Replacement – Multi Species Gibco | Fisher Scientific | A3181501 | KSR |
| KnockOut DMEM/F-12 | Thermo Fisher Scientific | 12660012 | Discontinued. Available under Catalog No. 10-828-010 |
| MACS Buffer | Miltenyi | 130-091-221 | |
| MACS MultiStand | Miltenyi | 130-042-303 | magnetic stand |
| MEM NEAA 100x Gibco | Thermo Fisher Scientific | 11140035 | |
| Mercaptoethanol | Thermo Fisher Scientific | 31350010 | 50mM |
| MiniMACS columns | Miltenyi | 130-042-201 | |
| Nunclon Multidishes | Sigma-Aldrich | D6789 | 4 well plates |
| Oncostatin M | Thermo Fisher Scientific | PHC5015 | human recombinant |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 158127 | |
| PBS sterile | Carl Roth GmbH+Co. KG | 9143.2 | |
| Penicillin/Streptomycin | Biochrom GmbH | A2213 | 10000 U/ml |
| PS 15ml tubes sterile | Greiner Bio-One | 188171 | |
| Rabbit anti-chicken IgG Texas red | Antibodies online | ABIN637943 | |
| Roti Cell Iscoves MDM | Carl Roth GmbH+Co. KG | 9033.1 | |
| Roti Mount FluorCare DAPI | Carl Roth GmbH+Co. KG | HP20.1 | |
| Roti Sep 1077 human | Carl Roth GmbH+Co. KG | 0642.2 | |
| Transthyretin antibody | Sigma-Aldrich | SAB3500378 | produced in chicken |
| Triton X-100 | Thermo Fisher Scientific | HFH10 | 1% |
References
- Fennema, E., Rivron, N., Rouwkema, J., van Blitterswijk, C., de Boer, J. Spheroid culture as a tool for creating 3D complex tissues. Trends in Biotechnology. 31 (2), 108-115 (2013).
- Ryu, N. E., Lee, S. H., Park, H. Spheroid culture system methods and applications for mesenchymal stem cells. Cells. 8 (12), 1620 (2019).
- Nevzorova, Y. A., Boyer-Diaz, Z., Cubero, F. J., Gracia-Sancho, J. Animal models for liver disease – A practical approach for translational research. Journal of Hepatology. 73 (2), 423-440 (2020).
- Ingelman-Sundberg, M., Lauschke, V. M. 3D human liver spheroids for translational pharmacology and toxicology. Basic and Clinical Pharmacology and Toxicology. 130, 5-15 (2022).
- Nelson, C. M., Bissell, M. J. Of extracellular matrix, scaffolds, and signalling: tissue architecture regulates development, homeostasis, and cancer. Annual review of cell and developmental biology. 22, 287-309 (2006).
- Khanna, S., Chauhan, A., Bhatt, A. N., Dwarakanath, B. S. R. Multicellular tumor spheroids as in vitro models for studying tumor responses to anticancer therapies. Animal Biotechnology (Second Edition). , 251-268 (2020).
- Rossi, G., Manfrin, A., Lutolf, M. P. Progress and potential in organoid research. Nature Reviews Genetics. 19 (11), 671-687 (2018).
- Riede, J., Wollmann, B. M., Molden, E., Ingelman-Sundberg, M. Primary human hepatocyte spheroids as an in vitro tool for investigating drug compounds with low clearance. Drug metabolism and disposition: The Biological Fate of Chemicals. 49 (7), 501-508 (2021).
- Soto-Gutierrez, A., et al. Differentiating stem cells into liver. Biotechnology & Genetic Engineering Reviews. 25, 149-163 (2008).
- Hurrell, T., et al. Human liver spheroids as a model to study aetiology and treatment of hepatic fibrosis. Cells. 9 (4), 964 (2020).
- Chen, S., et al. Hepatic spheroids derived from human induced pluripotent stem cells in bio-artificial liver rescue porcine acute liver failure. Cell Research. 30 (1), 95-97 (2020).
- Zhao, M., et al. Cytochrome P450 enzymes and drug metabolism in humans. International Journal of Molecular Sciences. 22 (23), 12808 (2021).
- Becker-Kojić, Z. A., Schott, A. K., Zipančić, I., Hernández-Rabaza, V. GM-Free generation of blood-derived neuronal cells. Journal of Visualized Experiments. (168), e61634 (2021).
- Marchenko, S., Flanagan, L. Immunocytochemistry: Human neural stem cells. Journal of Visualized Experiments. (7), e267 (2007).
- Crandall, B. F. Alpha-fetoprotein: a review. Critical Reviews in Clinical Laboratory Sciences. 15 (2), 127-185 (1981).
- Magalhães, J., Eira, J., Liz, M. A. The role of transthyretin in cell biology: impact on human pathophysiology. Cellular and Molecular Life Sciences 2021. 78 (17-18), 6105-6117 (2021).
- Huck, I., Gunewardena, S., Espanol-Suner, R., Willenbring, H., Apte, U. Hepatocyte nuclear factor 4 alpha activation is essential for termination of liver regeneration in mice. Hepatology. 70 (2), 666-681 (2019).
- Korver, S., et al. The application of cytokeratin-18 as a biomarker for drug-induced liver injury. Archives of Toxicology. 95 (11), 3435-3448 (2021).
- Klyushova, L. S., Perepechaeva, M. L., Grishanova, A. Y. The role of CYP3A in health and disease. Biomedicines. 10 (11), 2686 (2022).
- Fujino, C., Sanoh, S., Katsura, T. Variation in expression of cytochrome P450 3A isoforms and toxicological effects: endo- and exogenous substances as regulatory factors and substrates. Biological & Pharmaceutical Bulletin. 44 (11), 1617-1634 (2021).
- Hutchinson, M. R., Menelaou, A., Foster, D. J., Coller, J. K., Somogyi, A. A. CYP2D6 and CYP3A4 involvement in the primary oxidative metabolism of hydrocodone by human liver microsomes. British Journal of Clinical Pharmacology. 57 (3), 287-297 (2004).
- Asrani, S. K., Devarbhavi, H., Eaton, J., Kamath, P. S. Burden of liver diseases in the world. Journal of Hepatology. 70 (1), 151-171 (2019).
- Kammerer, S. Three-dimensional liver culture systems to maintain primary hepatic properties for toxicological analysis in vitro. International Journal of Molecular Sciences. 22 (19), 10214 (2021).
