Humane leversferoïden uit perifeer bloed voor leverziektestudies
Summary
Hier presenteren we een niet-genetische methode om menselijke autologe leversferoïden te genereren met behulp van mononucleaire cellen geïsoleerd uit steady-state perifeer bloed.
Abstract
Menselijke levercellen kunnen een driedimensionale (3D) structuur vormen die in staat is om enkele weken in cultuur te groeien, waardoor hun functionele capaciteit behouden blijft. Vanwege hun aard om te clusteren in de kweekschalen met lage of geen kleefeigenschappen, vormen ze aggregaten van meerdere levercellen die menselijke leversferoïden worden genoemd. De vorming van 3D-leversferoïden is afhankelijk van de natuurlijke neiging van levercellen om te aggregeren in afwezigheid van een kleefbaar substraat. Deze 3D-structuren hebben betere fysiologische reacties dan cellen, die dichter bij een in vivo omgeving staan. Het gebruik van 3D-hepatocytenculturen heeft tal van voordelen in vergelijking met klassieke tweedimensionale (2D) culturen, waaronder een meer biologisch relevante micro-omgeving, architecturale morfologie die natuurlijke organen opnieuw samenstelt, evenals een betere voorspelling met betrekking tot de ziektetoestand en in vivo-achtige reacties op geneesmiddelen. Verschillende bronnen kunnen worden gebruikt om sferoïden te genereren, zoals primair leverweefsel of onsterfelijke cellijnen. Het 3D-leverweefsel kan ook worden gemanipuleerd door menselijke embryonale stamcellen (hESCs) of geïnduceerde pluripotente stamcellen (hiPSC’s) te gebruiken om hepatocyten af te leiden. We hebben menselijke leversferoïden verkregen met behulp van van bloed afgeleide pluripotente stamcellen (BD-PSC’s) gegenereerd uit ongemanipuleerd perifeer bloed door activering van menselijk membraangebonden GPI-gebonden eiwit en gedifferentieerd tot menselijke hepatocyten. De van BD-PSC’s afgeleide menselijke levercellen en menselijke leversferoïden werden geanalyseerd door lichtmicroscopie en immunofenotypering met behulp van menselijke hepatocytenmarkers.
Introduction
In de afgelopen jaren zijn driedimensionale (3D) sferoïde cultuursystemen een belangrijk hulpmiddel geworden om verschillende gebieden van kankeronderzoek, medicijnontdekking en toxicologie te bestuderen. Dergelijke culturen wekken grote belangstelling omdat ze de kloof overbruggen tussen tweedimensionale (2D) celkweek monolagen en complexe organen1.
Bij afwezigheid van een kleefoppervlak, in vergelijking met de 2D-celcultuur, is de vorming van sferoïden gebaseerd op de natuurlijke affiniteit van deze cellen om in 3D-vorm te clusteren. Deze cellen organiseren zich in groepen bestaande uit een of meer soorten volwassen cellen. Vrij van vreemde materialen, deze cellen interageren met elkaar zoals in hun oorspronkelijke micro-omgeving. De cellen in 3D-cultuur zijn veel dichter bij elkaar en hebben een goede oriëntatie op elkaar, met een hogere extracellulaire matrixproductie dan 2D-culturen, en vormen een dicht bij natuurlijke omgeving 2.
Diermodellen worden al heel lang gebruikt om menselijke biologie en ziekten te bestuderen3. In dit opzicht zijn er intrinsieke verschillen tussen mens en dier, waardoor deze modellen niet helemaal geschikt zijn voor extrapolatieve studies. 3D-cultuursferoïden en organoïden vormen een veelbelovend hulpmiddel om weefselachtige architectuur, interactie en overspraak tussen verschillende celtypen te bestuderen die in vivo voorkomen en kunnen bijdragen aan het verminderen of zelfs vervangen van diermodellen. Ze zijn van bijzonder belang voor het bestuderen van de pathogenese van leverziekten en voor het screenen van geneesmiddelen4.
3D-sferoïdecultuur is van bijzonder belang voor kankeronderzoek omdat het de discontinuïteit tussen de cellen en hun omgeving kan elimineren door de behoefte aan trypsinisatie of collagenasebehandeling te verminderen die nodig is voor het voorbereiden van de tumorcelmonolagen voor 2D-culturen. Tumorsferoïden maken het mogelijk om te bestuderen hoe de normale versus kwaadaardige cellen signalen uit hun omgeving ontvangen en erop reageren5 en zijn een belangrijk onderdeel van tumorbiologische studies.
In vergelijking met de monolaag lijken 3D-culturen bestaande uit verschillende celtypen op tumorweefsels in hun structurele en functionele eigenschappen en zijn daarom geschikt voor het bestuderen van metastase en invasie van tumorcellen. Daarom dragen dergelijke sferoïde modellen bij aan het versnellen van kankeronderzoek6.
Sferoïden helpen ook bij het ontwikkelen van de technologie om menselijke organoïden te maken, omdat weefsel- en orgaanbiologie zeer uitdagend zijn om te bestuderen, vooral bij mensen. Vooruitgang in stamcelkweek maakt het mogelijk om 3D-culturen zoals organoïden te ontwikkelen die bestaan uit stamcellen en weefselvoorlopers, evenals verschillende soorten volwassen (weefsel) cellen van een orgaan met enkele functionele kenmerken zoals een echt orgaan dat kan worden gebruikt om orgaanontwikkeling, ziekten te modelleren, maar ze kunnen ook als nuttig worden beschouwd in regeneratieve geneeskunde7.
Primaire menselijke hepatocyten worden meestal gebruikt voor het bestuderen van in vitro biologie van menselijke hepatocyten, leverfunctie en geneesmiddel-geïnduceerde toxiciteit. Culturen van menselijke hepatocyten hebben twee belangrijke nadelen, ten eerste de beperkte beschikbaarheid van primair weefsel zoals menselijke hepatocyten, en ten tweede de neiging van hepatocyten om snel te dedifferentiëren in 2D-cultuur, waardoor hun specifieke hepatocytenfunctie verlorengaat 8. 3D-leverculturen zijn in dit opzicht superieur en zijn onlangs gemaakt van gedifferentieerde menselijke embryonale stamcellen (hESCs) of geïnduceerde pluripotente stamcellen (hiPSC’s)9. Bioengineered hepatische 3D-sferoïden zijn van bijzonder belang voor het bestuderen van ontwikkeling, toxiciteit, genetische en infectieziekten van de lever, evenals bij het ontdekken van geneesmiddelen voor de behandeling van leverziekten10. Ten slotte hebben ze ook het potentieel om klinisch te worden gebruikt, wetende dat acute leverziekten een sterftecijfer van bijna 80% hebben, bio-kunstmatige lever en / of leversferoïden kunnen deze patiënten mogelijk redden door een gedeeltelijke leverfunctie te bieden totdat een geschikte donor kan worden gevonden11.
We hebben een protocol opgesteld voor het genereren van menselijke leversferoïden met behulp van bloedafgeleide pluripotente stamcellen (BD-PSC’s) om sferoïden van verschillende grootte te bereiden die 4000 tot 1 x 106 cellen bevatten en deze geanalyseerd door middel van lichtmicroscopie en immunofluorescentie. We hebben ook het vermogen van hepatocyt-specifieke functie getest, waarbij we de expressie van cytochroom P450 3A4 (CYP3A4) en 2E1 (CYP2E1) enzymen beoordeelden die behoren tot de cytochroom P450-familie die een belangrijke rol spelen in cellulair en geneesmiddelmetabolisme door het proces van ontgifting12.
Protocol
Representative Results
Discussion
De lever is een belangrijk orgaan in het menselijk lichaam met veel essentiële biologische functies, zoals de ontgifting van metabolieten. Als gevolg van ernstig leverfalen zoals cirrose en / of virale hepatitis, zijn er wereldwijd bijna 2 miljoen sterfgevallen per jaar. Levertransplantaties staan wereldwijd op de tweede plaats in solide orgaantransplantaties, maar slechts aan ongeveer 10% van de huidige behoefte wordt voldaan22.
Primaire menselijke hepatocyten (PHH) w…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
De auteurs zijn vooral dankbaar voor de technische assistentie van Oksana en John Greenacre. Dit werk werd ondersteund door ACA CELL Biotech GmbH Heidelberg, Duitsland.
Materials
| Albumin antibody | Sigma-Aldrich | SAB3500217 | produced in chicken |
| Albumin Fraction V | Carl Roth GmbH+Co. KG | T8444.4 | |
| Alpha-1 Fetoprotein | Proteintech Germany GmbH | 14550-1-AP | rabbit polyclonal IgG |
| Biolaminin 111 LN | BioLamina | LN111-02 | human recombinant |
| CD45 MicroBeads | Miltenyi | 130-045-801 | nano-sized magnetic beads |
| Cell Strainer | pluriSelect | 43-10040-40 | |
| CellSens | Olympus | imaging software | |
| Centrifuge tubes 50 mL | Greiner Bio-One | 210270 | |
| CEROplate 96 well | OLS OMNI Life Science | 2800-109-96 | |
| CKX53 | Olympus | ||
| Commercially available detergent | Procter & Gamble | nonionic detergent | |
| CYP2E1-specific antibody | Proteintech Germany GmbH | 19937-1-AP | rabbit polyclonal antibody IgG |
| CYP3A4 | Proteintech Germany GmbH | 67110-1-lg | mouse monoclonal antibody IgG1 |
| Cytokeratin 18 | DakoCytomation | M7010 | mouse monoclonal antibody IgG1 |
| DMSO | Sigma-Aldrich | D8418-50ML | |
| DPBS | Thermo Fisher Scientific | 14040091 | |
| FBS | Merck Millipore | S0115/1030B | Discontinued. Available under: TMS-013-B |
| Glass cover slips 14 mm | R. Langenbrinck | 01-0014/1 | |
| GlutaMax 100x Gibco | Thermo Fisher Scientific | 35050038 | L-glutamine |
| Glutaraldehyde 25% | Sigma-Aldrich | G588.2-50ML | |
| Goat anti-mouse IgG Cy3 | Antibodies online | ABIN1673767 | polyclonal |
| Goat anti-mouse IgG DyLight 488 | Antibodies online | ABIN1889284 | polyclonal |
| Goat anti-rabbit IgG Alexa Fluor 488 | Life Technologies | A-11008 | |
| HCl | Sigma-Aldrich | 30721-1LGL | |
| HepatoZYME-SFM | Thermo Fisher Scientific | 17705021 | hepatocyte maturation medium |
| HGF | Thermo Fisher Scientific | PHG0324 | human recombinant |
| HNF4α antibody | Sigma-Aldrich | ZRB1457-25UL | clone 4C19 ZooMAb Rbmono |
| Hydrocortisone 21-hemisuccinate (sodium salt) | Biomol | Cay18226-100 | |
| Knock out Serum Replacement – Multi Species Gibco | Fisher Scientific | A3181501 | KSR |
| KnockOut DMEM/F-12 | Thermo Fisher Scientific | 12660012 | Discontinued. Available under Catalog No. 10-828-010 |
| MACS Buffer | Miltenyi | 130-091-221 | |
| MACS MultiStand | Miltenyi | 130-042-303 | magnetic stand |
| MEM NEAA 100x Gibco | Thermo Fisher Scientific | 11140035 | |
| Mercaptoethanol | Thermo Fisher Scientific | 31350010 | 50mM |
| MiniMACS columns | Miltenyi | 130-042-201 | |
| Nunclon Multidishes | Sigma-Aldrich | D6789 | 4 well plates |
| Oncostatin M | Thermo Fisher Scientific | PHC5015 | human recombinant |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 158127 | |
| PBS sterile | Carl Roth GmbH+Co. KG | 9143.2 | |
| Penicillin/Streptomycin | Biochrom GmbH | A2213 | 10000 U/ml |
| PS 15ml tubes sterile | Greiner Bio-One | 188171 | |
| Rabbit anti-chicken IgG Texas red | Antibodies online | ABIN637943 | |
| Roti Cell Iscoves MDM | Carl Roth GmbH+Co. KG | 9033.1 | |
| Roti Mount FluorCare DAPI | Carl Roth GmbH+Co. KG | HP20.1 | |
| Roti Sep 1077 human | Carl Roth GmbH+Co. KG | 0642.2 | |
| Transthyretin antibody | Sigma-Aldrich | SAB3500378 | produced in chicken |
| Triton X-100 | Thermo Fisher Scientific | HFH10 | 1% |
References
- Fennema, E., Rivron, N., Rouwkema, J., van Blitterswijk, C., de Boer, J. Spheroid culture as a tool for creating 3D complex tissues. Trends in Biotechnology. 31 (2), 108-115 (2013).
- Ryu, N. E., Lee, S. H., Park, H. Spheroid culture system methods and applications for mesenchymal stem cells. Cells. 8 (12), 1620 (2019).
- Nevzorova, Y. A., Boyer-Diaz, Z., Cubero, F. J., Gracia-Sancho, J. Animal models for liver disease – A practical approach for translational research. Journal of Hepatology. 73 (2), 423-440 (2020).
- Ingelman-Sundberg, M., Lauschke, V. M. 3D human liver spheroids for translational pharmacology and toxicology. Basic and Clinical Pharmacology and Toxicology. 130, 5-15 (2022).
- Nelson, C. M., Bissell, M. J. Of extracellular matrix, scaffolds, and signalling: tissue architecture regulates development, homeostasis, and cancer. Annual review of cell and developmental biology. 22, 287-309 (2006).
- Khanna, S., Chauhan, A., Bhatt, A. N., Dwarakanath, B. S. R. Multicellular tumor spheroids as in vitro models for studying tumor responses to anticancer therapies. Animal Biotechnology (Second Edition). , 251-268 (2020).
- Rossi, G., Manfrin, A., Lutolf, M. P. Progress and potential in organoid research. Nature Reviews Genetics. 19 (11), 671-687 (2018).
- Riede, J., Wollmann, B. M., Molden, E., Ingelman-Sundberg, M. Primary human hepatocyte spheroids as an in vitro tool for investigating drug compounds with low clearance. Drug metabolism and disposition: The Biological Fate of Chemicals. 49 (7), 501-508 (2021).
- Soto-Gutierrez, A., et al. Differentiating stem cells into liver. Biotechnology & Genetic Engineering Reviews. 25, 149-163 (2008).
- Hurrell, T., et al. Human liver spheroids as a model to study aetiology and treatment of hepatic fibrosis. Cells. 9 (4), 964 (2020).
- Chen, S., et al. Hepatic spheroids derived from human induced pluripotent stem cells in bio-artificial liver rescue porcine acute liver failure. Cell Research. 30 (1), 95-97 (2020).
- Zhao, M., et al. Cytochrome P450 enzymes and drug metabolism in humans. International Journal of Molecular Sciences. 22 (23), 12808 (2021).
- Becker-Kojić, Z. A., Schott, A. K., Zipančić, I., Hernández-Rabaza, V. GM-Free generation of blood-derived neuronal cells. Journal of Visualized Experiments. (168), e61634 (2021).
- Marchenko, S., Flanagan, L. Immunocytochemistry: Human neural stem cells. Journal of Visualized Experiments. (7), e267 (2007).
- Crandall, B. F. Alpha-fetoprotein: a review. Critical Reviews in Clinical Laboratory Sciences. 15 (2), 127-185 (1981).
- Magalhães, J., Eira, J., Liz, M. A. The role of transthyretin in cell biology: impact on human pathophysiology. Cellular and Molecular Life Sciences 2021. 78 (17-18), 6105-6117 (2021).
- Huck, I., Gunewardena, S., Espanol-Suner, R., Willenbring, H., Apte, U. Hepatocyte nuclear factor 4 alpha activation is essential for termination of liver regeneration in mice. Hepatology. 70 (2), 666-681 (2019).
- Korver, S., et al. The application of cytokeratin-18 as a biomarker for drug-induced liver injury. Archives of Toxicology. 95 (11), 3435-3448 (2021).
- Klyushova, L. S., Perepechaeva, M. L., Grishanova, A. Y. The role of CYP3A in health and disease. Biomedicines. 10 (11), 2686 (2022).
- Fujino, C., Sanoh, S., Katsura, T. Variation in expression of cytochrome P450 3A isoforms and toxicological effects: endo- and exogenous substances as regulatory factors and substrates. Biological & Pharmaceutical Bulletin. 44 (11), 1617-1634 (2021).
- Hutchinson, M. R., Menelaou, A., Foster, D. J., Coller, J. K., Somogyi, A. A. CYP2D6 and CYP3A4 involvement in the primary oxidative metabolism of hydrocodone by human liver microsomes. British Journal of Clinical Pharmacology. 57 (3), 287-297 (2004).
- Asrani, S. K., Devarbhavi, H., Eaton, J., Kamath, P. S. Burden of liver diseases in the world. Journal of Hepatology. 70 (1), 151-171 (2019).
- Kammerer, S. Three-dimensional liver culture systems to maintain primary hepatic properties for toxicological analysis in vitro. International Journal of Molecular Sciences. 22 (19), 10214 (2021).
