Esferoides do fígado humano do sangue periférico para estudos de doença hepática
Summary
Aqui apresentamos um método não genético para gerar esferoides hepáticos autólogos humanos usando células mononucleares isoladas do sangue periférico em estado estacionário.
Abstract
As células hepáticas humanas podem formar uma estrutura tridimensional (3D) capaz de crescer em cultura por algumas semanas, preservando sua capacidade funcional. Devido à sua natureza de se agrupar nos pratos de cultura com características adesivas baixas ou nenhumas, eles formam agregados de múltiplas células hepáticas que são chamadas de esferoides hepáticos humanos. A formação de esferoides hepáticos 3D depende da tendência natural das células hepáticas de se agregarem na ausência de um substrato adesivo. Essas estruturas 3D possuem melhores respostas fisiológicas do que as células, que estão mais próximas de um ambiente de vivo. O uso de culturas de hepatócitos 3D tem inúmeras vantagens quando comparado com culturas bidimensionais clássicas (2D), incluindo um microambiente mais biologicamente relevante, morfologia arquitetônica que remonta órgãos naturais, bem como uma melhor predição sobre o estado da doença e respostas in vivo a drogas. Várias fontes podem ser usadas para gerar esferoides, como tecido hepático primário ou linhas celulares imortalizadas. O tecido hepático 3D também pode ser modificado usando células-tronco embrionárias humanas (hESCs) ou células-tronco pluripotentes induzidas (hiPSCs) para derivar hepatócitos. Obtivemos esferoides hepáticos humanos usando células-tronco pluripotentes derivadas do sangue (BD-PSCs) geradas a partir de sangue periférico não manipulado pela ativação de proteínas ligadas à GPI ligadas à membrana humana e diferenciadas aos hepatócitos humanos. As células hepáticas humanas derivadas de BD-PSCs e os esferoides hepáticos humanos foram analisados por microscopia de luz e imunofenotipagem usando marcadores de hepatócitos humanos.
Introduction
Nos últimos anos, os sistemas de cultura esferoides tridimensionais (3D) tornaram-se uma ferramenta importante para estudar várias áreas de pesquisa sobre o câncer, descoberta de medicamentos e toxicologia. Tais culturas despertam grande interesse porque preenchem a lacuna entre as monocamadas de cultura celular bidimensional (2D) e os órgãos complexos1.
Na ausência de uma superfície adesiva, em comparação com a cultura de células 2D, a formação de esferoides é baseada na afinidade natural dessas células para se agruparem na forma 3D. Essas células se organizam em grupos que consistem em um ou mais tipos de células maduras. Livres de materiais estranhos, essas células interagem umas com as outras como em seu microambiente original. As células em cultura 3D são muito mais próximas e têm uma orientação adequada entre si, com maior produção de matriz extracelular do que as culturas 2D, e constituem um ambiente próximo ao natural 2.
Modelos animais têm sido utilizados há muito tempo para estudar a biologia humana e doenças3. A este respeito, existem diferenças intrínsecas entre humanos e animais, o que torna esses modelos não inteiramente adequados para estudos extrapolativos. Os esferoides e organoides de cultura 3D representam uma ferramenta promissora para estudar a arquitetura, a interação e o crosstalk semelhantes a tecidos entre diferentes tipos de células que ocorrem in vivo e podem contribuir para reduzir ou mesmo substituir modelos animais. Eles são de particular interesse para o estudo da patogênese das doenças hepáticas, bem como das plataformas de triagem de medicamentos4.
A cultura esferoide 3D é de particular importância para a pesquisa do câncer, pois pode eliminar a descontinuidade entre as células e seu ambiente, reduzindo a necessidade de tripsinização ou tratamento com colagenase necessário para preparar as monocamadas de células tumorais para culturas 2D. Os esferoides tumorais permitem o estudo de como as células normais versus malignas recebem e respondem aos sinais de seus arredores5 e são uma parte importante dos estudos de biologia tumoral.
Em comparação com a monocamada, as culturas 3D que consistem em vários tipos de células se assemelham a tecidos tumorais em suas propriedades estruturais e funcionais e, portanto, são adequadas para estudar metástases e invasão de células tumorais. É por isso que tais modelos esferoides estão contribuindo para acelerar a pesquisa sobre o câncer6.
Os esferoides também estão ajudando a desenvolver a tecnologia para criar organoides humanos, porque a biologia de tecidos e órgãos é muito difícil de estudar, particularmente em humanos. O progresso na cultura de células-tronco possibilita o desenvolvimento de culturas 3D como organoides constituídos por células-tronco e progenitores teciduais, bem como diferentes tipos de células maduras (teciduais) de um órgão com algumas características funcionais, como um órgão real, que pode ser usado para modelar o desenvolvimento de órgãos, doenças, mas também podem ser considerados úteis na medicina regenerativa7.
Os hepatócitos humanos primários são geralmente usados para estudar a biologia in vitro dos hepatócitos humanos, a função hepática e a toxicidade induzida por drogas. As culturas de hepatócitos humanos têm duas desvantagens principais, em primeiro lugar, a disponibilidade limitada de tecido primário, como os hepatócitos humanos, e, em segundo lugar, a tendência dos hepatócitos a se desdiferenciarem rapidamente em cultura 2D, perdendo assim sua função específica de hepatócitos8. As culturas hepáticas 3D são superiores a esse respeito e foram recentemente realizadas a partir de células-tronco embrionárias humanas diferenciadas (hESCs) ou células-tronco pluripotentes induzidas (hiPSCs)9. Os esferoides 3D hepáticos de bioengenharia são de particular interesse para estudar o desenvolvimento, a toxicidade, as doenças genéticas e infecciosas do fígado, bem como na descoberta de medicamentos para o tratamento de doenças hepáticas10. Por fim, também têm potencial para serem utilizados clinicamente, sabendo que as doenças hepáticas agudas têm uma taxa de mortalidade de quase 80%, os esferoides hepáticos e/ou hepáticos bioartificiais poderiam potencialmente resgatar esses pacientes, fornecendo função hepática parcial até que um doador adequado possa ser encontrado11.
Estabelecemos um protocolo para a geração de esferoides hepáticos humanos usando células-tronco pluripotentes derivadas do sangue (BD-PSCs) para preparar esferoides de tamanhos diferentes contendo 4000 a 1 x 106 células e analisá-los por meio de microscopia de luz e imunofluorescência. Também testamos a capacidade da função específica dos hepatócitos, avaliando a expressão das enzimas do citocromo P450 3A4 (CYP3A4) e 2E1 (CYP2E1) pertencentes à família do citocromo P450 que têm papéis importantes no metabolismo celular e de drogas através do processo de desintoxicação12.
Protocol
Representative Results
Discussion
O fígado é um órgão importante no corpo humano com muitas funções biológicas essenciais, como a desintoxicação de metabólitos. Devido a falhas hepáticas graves, como cirrose e / ou hepatite viral, há quase 2 milhões de mortes por ano em todo o mundo. Os transplantes hepáticos ocupam o segundo lugar em transplantes de órgãos sólidos em todo o mundo, mas apenas cerca de 10% da necessidade atual é atendida22.
Hepatócitos humanos primários (PHH) são fre…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Os autores são especialmente gratos pela assistência técnica prestada por Oksana e John Greenacre. Este trabalho foi apoiado pela ACA CELL Biotech GmbH Heidelberg, Alemanha.
Materials
| Albumin antibody | Sigma-Aldrich | SAB3500217 | produced in chicken |
| Albumin Fraction V | Carl Roth GmbH+Co. KG | T8444.4 | |
| Alpha-1 Fetoprotein | Proteintech Germany GmbH | 14550-1-AP | rabbit polyclonal IgG |
| Biolaminin 111 LN | BioLamina | LN111-02 | human recombinant |
| CD45 MicroBeads | Miltenyi | 130-045-801 | nano-sized magnetic beads |
| Cell Strainer | pluriSelect | 43-10040-40 | |
| CellSens | Olympus | imaging software | |
| Centrifuge tubes 50 mL | Greiner Bio-One | 210270 | |
| CEROplate 96 well | OLS OMNI Life Science | 2800-109-96 | |
| CKX53 | Olympus | ||
| Commercially available detergent | Procter & Gamble | nonionic detergent | |
| CYP2E1-specific antibody | Proteintech Germany GmbH | 19937-1-AP | rabbit polyclonal antibody IgG |
| CYP3A4 | Proteintech Germany GmbH | 67110-1-lg | mouse monoclonal antibody IgG1 |
| Cytokeratin 18 | DakoCytomation | M7010 | mouse monoclonal antibody IgG1 |
| DMSO | Sigma-Aldrich | D8418-50ML | |
| DPBS | Thermo Fisher Scientific | 14040091 | |
| FBS | Merck Millipore | S0115/1030B | Discontinued. Available under: TMS-013-B |
| Glass cover slips 14 mm | R. Langenbrinck | 01-0014/1 | |
| GlutaMax 100x Gibco | Thermo Fisher Scientific | 35050038 | L-glutamine |
| Glutaraldehyde 25% | Sigma-Aldrich | G588.2-50ML | |
| Goat anti-mouse IgG Cy3 | Antibodies online | ABIN1673767 | polyclonal |
| Goat anti-mouse IgG DyLight 488 | Antibodies online | ABIN1889284 | polyclonal |
| Goat anti-rabbit IgG Alexa Fluor 488 | Life Technologies | A-11008 | |
| HCl | Sigma-Aldrich | 30721-1LGL | |
| HepatoZYME-SFM | Thermo Fisher Scientific | 17705021 | hepatocyte maturation medium |
| HGF | Thermo Fisher Scientific | PHG0324 | human recombinant |
| HNF4α antibody | Sigma-Aldrich | ZRB1457-25UL | clone 4C19 ZooMAb Rbmono |
| Hydrocortisone 21-hemisuccinate (sodium salt) | Biomol | Cay18226-100 | |
| Knock out Serum Replacement – Multi Species Gibco | Fisher Scientific | A3181501 | KSR |
| KnockOut DMEM/F-12 | Thermo Fisher Scientific | 12660012 | Discontinued. Available under Catalog No. 10-828-010 |
| MACS Buffer | Miltenyi | 130-091-221 | |
| MACS MultiStand | Miltenyi | 130-042-303 | magnetic stand |
| MEM NEAA 100x Gibco | Thermo Fisher Scientific | 11140035 | |
| Mercaptoethanol | Thermo Fisher Scientific | 31350010 | 50mM |
| MiniMACS columns | Miltenyi | 130-042-201 | |
| Nunclon Multidishes | Sigma-Aldrich | D6789 | 4 well plates |
| Oncostatin M | Thermo Fisher Scientific | PHC5015 | human recombinant |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 158127 | |
| PBS sterile | Carl Roth GmbH+Co. KG | 9143.2 | |
| Penicillin/Streptomycin | Biochrom GmbH | A2213 | 10000 U/ml |
| PS 15ml tubes sterile | Greiner Bio-One | 188171 | |
| Rabbit anti-chicken IgG Texas red | Antibodies online | ABIN637943 | |
| Roti Cell Iscoves MDM | Carl Roth GmbH+Co. KG | 9033.1 | |
| Roti Mount FluorCare DAPI | Carl Roth GmbH+Co. KG | HP20.1 | |
| Roti Sep 1077 human | Carl Roth GmbH+Co. KG | 0642.2 | |
| Transthyretin antibody | Sigma-Aldrich | SAB3500378 | produced in chicken |
| Triton X-100 | Thermo Fisher Scientific | HFH10 | 1% |
References
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