肝疾患研究のための末梢血からのヒト肝スフェロイド
Summary
ここでは、定常状態の末梢血から単核球を単離した単核球を用いてヒト自家肝スフェロイドを作製する非遺伝的方法を紹介します。
Abstract
ヒト肝細胞は、数週間培養中で増殖し、その機能的能力を維持することができる三次元(3D)構造を形成することができる。接着特性が低いかまったくない培養皿に集まる性質のため、ヒト肝スフェロイドと呼ばれる複数の肝細胞の凝集体を形成します。3D肝スフェロイドの形成は、接着性基質がない場合に肝細胞が凝集する自然な傾向に依存しています。これらの3D構造は、 in vivo 環境に近い細胞よりも優れた生理学的応答を示します。3D肝細胞培養を使用することは、より生物学的に関連性のある微小環境、天然器官を再構成する建築形態、疾患状態および薬物に対する in vivo様反応に関するより良い予測を含む、古典的な2次元(2D)培養と比較して多くの利点を有する。一次肝臓組織や不死化細胞株などのさまざまなソースを使用してスフェロイドを生成できます。3D肝臓組織は、ヒト胚性幹細胞(hESC)または人工多能性幹細胞(hiPSC)を使用して肝細胞を誘導することによって操作することもできます。ヒト膜結合GPI結合タンパク質の活性化により非改変末梢血から作製し、ヒト肝細胞に分化させた血液由来多能性幹細胞(BD-PSC)を用いてヒト肝スフェロイドを取得しています。BD-PSC由来のヒト肝細胞およびヒト肝スフェロイドを、光学顕微鏡およびヒト肝細胞マーカーを用いたイムノフェノタイピングによって分析した。
Introduction
近年、3次元(3D)スフェロイド培養システムは、癌研究、創薬、毒物学のさまざまな分野を研究するための重要なツールになっています。このような培養は、2次元(2D)細胞培養単層と複雑な器官の間のギャップを埋めるため、大きな関心を集めています1。
接着面がない場合、2D細胞培養と比較して、スフェロイドの形成は、3D形態のクラスターに対するこれらの細胞の自然な親和性に基づいています。これらの細胞は、1つ以上のタイプの成熟細胞からなるグループに組織化されます。異物がないので、これらの細胞は元の微小環境のように相互作用します。3D培養中の細胞は、2D培養よりも細胞外マトリックス産生が高く、互いにより近く、適切な配向性を有し、 自然環境に近い2を構成しています。
動物モデルは、人間の生物学と病気の研究に長い間使用されてきました3。この点で、人間と動物の間には本質的な違いがあるため、これらのモデルは外挿研究に完全には適していません。3D培養スフェロイドとオルガノイドは、 in vivo で発生する組織様の構造、相互作用、および異なる細胞タイプ間のクロストークを研究するための有望なツールであり、動物モデルの削減または置き換えにも貢献できます。それらは、肝疾患の病因および薬物スクリーニングプラットフォームを研究するために特に興味深いものです4。
3Dスフェロイド培養は、2D培養用の腫瘍細胞単分子膜の調製に必要なトリプシン処理またはコラゲナーゼ処理の必要性を減らすことにより、細胞とその環境との間の不連続性を排除できるため、癌研究にとって特に重要です。腫瘍スフェロイドは、正常細胞と悪性細胞が周囲からのシグナルをどのように受信して応答するかの研究を可能にし5 、腫瘍生物学研究の重要な部分です。
単層と比較して、さまざまな細胞タイプからなる3D培養は、その構造的および機能的特性において腫瘍組織に類似しているため、腫瘍細胞の転移および浸潤の研究に適しています。そのため、このようなスフェロイドモデルは癌研究の加速に貢献しています6。
スフェロイドは、組織および臓器生物学、特にヒトにおいて研究が非常に難しいため、ヒトオルガノイドを作成する技術の開発にも役立っています。幹細胞培養の進歩により、幹細胞や組織前駆細胞からなるオルガノイドのような3次元培養や、臓器発生や疾患のモデル化に利用できる実際の臓器のような機能的特徴を持つ臓器からのさまざまな種類の成熟(組織)細胞の開発が可能になりますが、再生医療にも有用であると考えられます7。
初代ヒト肝細胞は通常、ヒト肝細胞、肝機能、および薬物誘発毒性の in vitro 生物学の研究に使用されます。ヒト肝細胞の培養には、ヒト肝細胞のような初代組織の限られた利用可能性、および第二に、肝細胞が2D培養で急速に脱分化し、それによって特定の肝細胞機能を失う傾向の2つの主な欠点があります8。3D肝培養はこの点で優れており、最近では分化したヒト胚性幹細胞(hESC)または人工多能性幹細胞(hiPSC)から作られています9。バイオエンジニアリングされた肝臓3Dスフェロイドは、肝臓の開発、毒性、遺伝性疾患、感染症の研究、ならびに肝疾患の治療のための創薬に特に関心があります10。最後に、急性肝疾患の死亡率は80%近くであり、生物人工肝臓および/または肝スフェロイドは、適切なドナーが見つかるまで部分的な肝機能を提供することにより、これらの患者を救う可能性があることを知って、臨床的に使用される可能性もあります11。
血液由来多能性幹細胞(BD-PSC)を用いてヒト肝スフェロイドを作製し、4000〜1×106 個の細胞を含む異なるサイズのスフェロイドを作製し、光学顕微鏡と免疫蛍光法で解析しました。また、肝細胞特異的な機能の能力をテストし、解毒の過程で細胞および薬物代謝に重要な役割を果たすシトクロムP450ファミリーに属するシトクロムP450 3A4(CYP3A4)および2E1(CYP2E1)酵素の発現を評価しました12。
Protocol
Representative Results
Discussion
肝臓は、代謝産物の解毒など、多くの重要な生物学的機能を備えた人体の主要な器官です。肝硬変やウイルス性肝炎などの重度の肝不全により、世界中で年間200万人近くが死亡しています。肝移植は世界の固形臓器移植で2番目にランクされていますが、現在のニーズの約10%しか満たされていません22。
初代ヒト肝細胞(PHH)は、肝毒性の研究によく使用さ…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
著者は、OksanaとJohn Greenacreによって提供された技術支援に特に感謝しています。この研究は、ドイツのハイデルベルクのACA CELL Biotech GmbHによってサポートされました。
Materials
| Albumin antibody | Sigma-Aldrich | SAB3500217 | produced in chicken |
| Albumin Fraction V | Carl Roth GmbH+Co. KG | T8444.4 | |
| Alpha-1 Fetoprotein | Proteintech Germany GmbH | 14550-1-AP | rabbit polyclonal IgG |
| Biolaminin 111 LN | BioLamina | LN111-02 | human recombinant |
| CD45 MicroBeads | Miltenyi | 130-045-801 | nano-sized magnetic beads |
| Cell Strainer | pluriSelect | 43-10040-40 | |
| CellSens | Olympus | imaging software | |
| Centrifuge tubes 50 mL | Greiner Bio-One | 210270 | |
| CEROplate 96 well | OLS OMNI Life Science | 2800-109-96 | |
| CKX53 | Olympus | ||
| Commercially available detergent | Procter & Gamble | nonionic detergent | |
| CYP2E1-specific antibody | Proteintech Germany GmbH | 19937-1-AP | rabbit polyclonal antibody IgG |
| CYP3A4 | Proteintech Germany GmbH | 67110-1-lg | mouse monoclonal antibody IgG1 |
| Cytokeratin 18 | DakoCytomation | M7010 | mouse monoclonal antibody IgG1 |
| DMSO | Sigma-Aldrich | D8418-50ML | |
| DPBS | Thermo Fisher Scientific | 14040091 | |
| FBS | Merck Millipore | S0115/1030B | Discontinued. Available under: TMS-013-B |
| Glass cover slips 14 mm | R. Langenbrinck | 01-0014/1 | |
| GlutaMax 100x Gibco | Thermo Fisher Scientific | 35050038 | L-glutamine |
| Glutaraldehyde 25% | Sigma-Aldrich | G588.2-50ML | |
| Goat anti-mouse IgG Cy3 | Antibodies online | ABIN1673767 | polyclonal |
| Goat anti-mouse IgG DyLight 488 | Antibodies online | ABIN1889284 | polyclonal |
| Goat anti-rabbit IgG Alexa Fluor 488 | Life Technologies | A-11008 | |
| HCl | Sigma-Aldrich | 30721-1LGL | |
| HepatoZYME-SFM | Thermo Fisher Scientific | 17705021 | hepatocyte maturation medium |
| HGF | Thermo Fisher Scientific | PHG0324 | human recombinant |
| HNF4α antibody | Sigma-Aldrich | ZRB1457-25UL | clone 4C19 ZooMAb Rbmono |
| Hydrocortisone 21-hemisuccinate (sodium salt) | Biomol | Cay18226-100 | |
| Knock out Serum Replacement – Multi Species Gibco | Fisher Scientific | A3181501 | KSR |
| KnockOut DMEM/F-12 | Thermo Fisher Scientific | 12660012 | Discontinued. Available under Catalog No. 10-828-010 |
| MACS Buffer | Miltenyi | 130-091-221 | |
| MACS MultiStand | Miltenyi | 130-042-303 | magnetic stand |
| MEM NEAA 100x Gibco | Thermo Fisher Scientific | 11140035 | |
| Mercaptoethanol | Thermo Fisher Scientific | 31350010 | 50mM |
| MiniMACS columns | Miltenyi | 130-042-201 | |
| Nunclon Multidishes | Sigma-Aldrich | D6789 | 4 well plates |
| Oncostatin M | Thermo Fisher Scientific | PHC5015 | human recombinant |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 158127 | |
| PBS sterile | Carl Roth GmbH+Co. KG | 9143.2 | |
| Penicillin/Streptomycin | Biochrom GmbH | A2213 | 10000 U/ml |
| PS 15ml tubes sterile | Greiner Bio-One | 188171 | |
| Rabbit anti-chicken IgG Texas red | Antibodies online | ABIN637943 | |
| Roti Cell Iscoves MDM | Carl Roth GmbH+Co. KG | 9033.1 | |
| Roti Mount FluorCare DAPI | Carl Roth GmbH+Co. KG | HP20.1 | |
| Roti Sep 1077 human | Carl Roth GmbH+Co. KG | 0642.2 | |
| Transthyretin antibody | Sigma-Aldrich | SAB3500378 | produced in chicken |
| Triton X-100 | Thermo Fisher Scientific | HFH10 | 1% |
References
- Fennema, E., Rivron, N., Rouwkema, J., van Blitterswijk, C., de Boer, J. Spheroid culture as a tool for creating 3D complex tissues. Trends in Biotechnology. 31 (2), 108-115 (2013).
- Ryu, N. E., Lee, S. H., Park, H. Spheroid culture system methods and applications for mesenchymal stem cells. Cells. 8 (12), 1620 (2019).
- Nevzorova, Y. A., Boyer-Diaz, Z., Cubero, F. J., Gracia-Sancho, J. Animal models for liver disease – A practical approach for translational research. Journal of Hepatology. 73 (2), 423-440 (2020).
- Ingelman-Sundberg, M., Lauschke, V. M. 3D human liver spheroids for translational pharmacology and toxicology. Basic and Clinical Pharmacology and Toxicology. 130, 5-15 (2022).
- Nelson, C. M., Bissell, M. J. Of extracellular matrix, scaffolds, and signalling: tissue architecture regulates development, homeostasis, and cancer. Annual review of cell and developmental biology. 22, 287-309 (2006).
- Khanna, S., Chauhan, A., Bhatt, A. N., Dwarakanath, B. S. R. Multicellular tumor spheroids as in vitro models for studying tumor responses to anticancer therapies. Animal Biotechnology (Second Edition). , 251-268 (2020).
- Rossi, G., Manfrin, A., Lutolf, M. P. Progress and potential in organoid research. Nature Reviews Genetics. 19 (11), 671-687 (2018).
- Riede, J., Wollmann, B. M., Molden, E., Ingelman-Sundberg, M. Primary human hepatocyte spheroids as an in vitro tool for investigating drug compounds with low clearance. Drug metabolism and disposition: The Biological Fate of Chemicals. 49 (7), 501-508 (2021).
- Soto-Gutierrez, A., et al. Differentiating stem cells into liver. Biotechnology & Genetic Engineering Reviews. 25, 149-163 (2008).
- Hurrell, T., et al. Human liver spheroids as a model to study aetiology and treatment of hepatic fibrosis. Cells. 9 (4), 964 (2020).
- Chen, S., et al. Hepatic spheroids derived from human induced pluripotent stem cells in bio-artificial liver rescue porcine acute liver failure. Cell Research. 30 (1), 95-97 (2020).
- Zhao, M., et al. Cytochrome P450 enzymes and drug metabolism in humans. International Journal of Molecular Sciences. 22 (23), 12808 (2021).
- Becker-Kojić, Z. A., Schott, A. K., Zipančić, I., Hernández-Rabaza, V. GM-Free generation of blood-derived neuronal cells. Journal of Visualized Experiments. (168), e61634 (2021).
- Marchenko, S., Flanagan, L. Immunocytochemistry: Human neural stem cells. Journal of Visualized Experiments. (7), e267 (2007).
- Crandall, B. F. Alpha-fetoprotein: a review. Critical Reviews in Clinical Laboratory Sciences. 15 (2), 127-185 (1981).
- Magalhães, J., Eira, J., Liz, M. A. The role of transthyretin in cell biology: impact on human pathophysiology. Cellular and Molecular Life Sciences 2021. 78 (17-18), 6105-6117 (2021).
- Huck, I., Gunewardena, S., Espanol-Suner, R., Willenbring, H., Apte, U. Hepatocyte nuclear factor 4 alpha activation is essential for termination of liver regeneration in mice. Hepatology. 70 (2), 666-681 (2019).
- Korver, S., et al. The application of cytokeratin-18 as a biomarker for drug-induced liver injury. Archives of Toxicology. 95 (11), 3435-3448 (2021).
- Klyushova, L. S., Perepechaeva, M. L., Grishanova, A. Y. The role of CYP3A in health and disease. Biomedicines. 10 (11), 2686 (2022).
- Fujino, C., Sanoh, S., Katsura, T. Variation in expression of cytochrome P450 3A isoforms and toxicological effects: endo- and exogenous substances as regulatory factors and substrates. Biological & Pharmaceutical Bulletin. 44 (11), 1617-1634 (2021).
- Hutchinson, M. R., Menelaou, A., Foster, D. J., Coller, J. K., Somogyi, A. A. CYP2D6 and CYP3A4 involvement in the primary oxidative metabolism of hydrocodone by human liver microsomes. British Journal of Clinical Pharmacology. 57 (3), 287-297 (2004).
- Asrani, S. K., Devarbhavi, H., Eaton, J., Kamath, P. S. Burden of liver diseases in the world. Journal of Hepatology. 70 (1), 151-171 (2019).
- Kammerer, S. Three-dimensional liver culture systems to maintain primary hepatic properties for toxicological analysis in vitro. International Journal of Molecular Sciences. 22 (19), 10214 (2021).
