モルモットの目からの網膜色素上皮細胞の分離
Summary
我々は、若い色素性モルモットの目から網膜色素上皮(RPE)細胞の細胞を単離するための簡単で効率的な方法を説明する。この手順により、遺伝子発現解析を含む、単離されたRPEに関するフォローアップ分子生物学的研究が可能になります。
Abstract
このプロトコルは、遺伝子発現分析を含む分子生物学研究への応用の可能性のために、若い色素性モルモットの目から網膜色素上皮(RPE)の細胞を単離することについて説明しています。眼の成長調節と近視の文脈では、RPEは網膜と脈絡膜や強膜などの眼の2つの壁の間に位置するため、成長調節シグナルの細胞リレーとしての役割を果たす可能性があります。RPEを単離するためのプロトコルは、ヒナとマウスの両方について開発されていますが、これらのプロトコルは、重要で広く使用されている哺乳類近視モデルとなっているモルモットに直接翻訳できないことが証明されています。この研究では、分子生物学的ツールを使用して特定の遺伝子の発現を調べ、サンプルに隣接組織からの汚染がないことを確認しました。このプロトコルの価値は、近視誘発性の光学的焦点ぼけにさらされた若い色素性モルモットからのRPEのRNA-Seq研究ですでに実証されています。眼の成長調節以外にも、このプロトコルは、RPEが関与している近視の失明の主な原因の1つである近視性黄斑症を含む網膜疾患の研究に他の潜在的な用途があります。この技術の主な利点は、比較的単純であり、一度完成すると、RNA分析を含む分子生物学研究に適した高品質のRPEサンプルが得られることです。
Introduction
RPEは、神経網膜と血管脈絡膜の間に位置する色素細胞のユニークな単層で構成されており、光伝達を含む正常な網膜機能の発生と維持においてよく認識されている役割を持っています1,2。最近では、RPEは眼の成長調節3、したがって近視4の発症において追加の重要な役割を割り当てられています。この割り当ては、網膜と脈絡膜の間に介在するRPEの重要な位置と、眼の成長、したがって屈折異常が局所的に調節されていることが広く受け入れられていることに基づいています5。RPEは、増殖調節信号の想定源である網膜を、中継信号の2つの標的である脈絡膜および強膜に連結する信号中継として重要な役割を果たすと考えられている6,7,8。
ほとんどの近視を特徴付ける軸長の増加は良性とは見なされず、網膜、脈絡膜、および/または強膜を含む病態生理学的変化は、過度の眼の伸長の避けられない、そして今ではよく認識されている結果を表しています7,9。これに関連して、RPEは、非有糸分裂組織であるため、個々の細胞の伸張および菲薄化によってのみ拡大する硝子体腔を収容することができるので、おそらく最も脆弱である。近視性黄斑変性症などの近視関連の病状におけるその役割はまだ完全には理解されていませんが、RPEは、網膜、RPE、および脈絡膜の文書化された異常に関連する失明の主な原因の1つである地図状萎縮を含む、他の多くの網膜疾患の病因に関与しています10,11、12.
隣接する眼組織からの汚染のないRPE細胞の単離に成功することで、さまざまな眼/網膜疾患の根底にあるメカニズムに関する新しい洞察を得るための多くの研究機会が開かれる可能性があります。しかし、RPEの分離は困難であることが証明されており、多くの発表された研究では、この理由から網膜/RPEまたはRPE/脈絡膜の組み合わせサンプルを利用しています13,14,15。分子生物学的研究に適した品質のRPEの単離の成功を含む研究は、ニワトリおよびマウスの眼に限定されてきた16,17。例えば、RPE単離とRNA安定化の同時進行(SRIRS)法は、Wangら18によって記載される。マウスでRPE細胞を単離することは、モルモットの目ではうまく機能しないようです。ここで説明するプロトコルは、著者の1人(M.F.)によって最初に木のじゃじゃ馬の目でプロトタイプ化されたアプローチの改良を表しており、若い色素性モルモットの目からRNAやその他の分子生物学的分析に適した高品質のRPEサンプルが得られることが証明されています19。
Protocol
Representative Results
Discussion
本稿では、若く色素性モルモットの目からRPE遺伝子発現解析に適したRPEを単離する方法について説明します。このプロトコルのメリットは、比較的汚染のない高品質のRPEサンプルが得られ、RNA特異的分析にRNAが適切に保存され、しかも比較的シンプルで効率的であることです。ここで提供される例では、RPEサンプルは若い(2週齢)モルモットの目から収集されましたが、このプロトコルは、年?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
本研究は、日本学術振興会海外特別研究員(S.G.)、ロリス&デイビッド・リッチ博士研究員(S.G.)、国立衛生研究所眼科研究所(R01EY012392;C.F.W.)。
Materials
| 1 mL Syringe with Slip Tip | Bd Vacutainer Labware Medical | 22-253-260 | |
| 2-Mercaptoethanol | Invitrogen | 21985-023 | |
| 6 Well Tissue Culture Plate with Lid, Flat Bottom, Sterile | pectrum Chemical Mfg. Corp | 970-95008 | |
| 12 Well Tissue Culture Plate with Lid, Individual, Sterile | Thomas Scientific LLC | 1198D72 | |
| Agilent 2100 Bioanalyzer | automated electrophoresis to check RNA quality | ||
| Balanced Salt Solutions | Gibco | 10010031 | |
| Bonn Micro Forceps, Straight Smooth, 0.3 mm Tip, 7 cm | Fine Science Tools, Inc. | 11083-07 | |
| Dumont forceps no. 5 | ROBOZ | RS-5045 | |
| Hypodermic disposable needles | Exelint International, Co. | 26419 | |
| Hypodermic disposable needles | Exelint International, Co. | 26437 | |
| MiniSpin Microcentrifuges | Eppendorf | 540108 | Max. Speed: 8,000 g |
| RNAlater Stabilization Solution | Invitrogen | AM7020 | tissue storage reagent |
| RNeasy Mini kits | Qiagen | 74104 | RNA isolation kit |
| Student Vannas Spring Scissors | Fine Science Tools, Inc. | 91500-09 |
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