Выделение пигментных эпителиальных клеток сетчатки из глаз морской свинки
Summary
Описан простой и эффективный метод выделения клеток пигментного эпителия сетчатки (РПЭ) из глаз молодых пигментированных морских свинок. Эта процедура позволяет проводить последующие молекулярно-биологические исследования изолированного RPE, включая анализ экспрессии генов.
Abstract
Этот протокол описывает выделение клеток пигментного эпителия сетчатки (RPE) из глаз молодых пигментированных морских свинок для потенциального применения в исследованиях молекулярной биологии, включая анализ экспрессии генов. В контексте регуляции роста глаз и близорукости RPE, вероятно, играет роль клеточного реле для сигналов модуляции роста, поскольку он расположен между сетчаткой и двумя стенками глаза, такими как сосудистая оболочка и склера. Хотя протоколы изоляции RPE были разработаны как для цыплят, так и для мышей, оказалось, что эти протоколы не могут быть напрямую перенесены на морскую свинку, которая стала важной и широко используемой моделью близорукости млекопитающих. В этом исследовании инструменты молекулярной биологии использовались для изучения экспрессии специфических генов, чтобы подтвердить, что образцы не были загрязнены соседними тканями. Ценность этого протокола уже была продемонстрирована в исследовании RNA-Seq RPE молодых пигментированных морских свинок, подвергшихся оптическому расфокусированию, вызывающему близорукость. Помимо регуляции роста глаз, этот протокол имеет и другие потенциальные применения в исследованиях заболеваний сетчатки, включая миопическую макулопатию, одну из основных причин слепоты при миопах, в которую был вовлечен RPE. Основное преимущество этого метода заключается в том, что он относительно прост и после совершенствования дает высококачественные образцы RPE, подходящие для исследований молекулярной биологии, включая анализ РНК.
Introduction
RPE содержит уникальный монослой пигментированных клеток, расположенных между нервной сетчаткой и сосудистой сосудистой сосудистой оболочкой, и RPE играет хорошо известную роль в развитии и поддержании нормальной функции сетчатки, включая фототрансдукцию 1,2. Совсем недавно РПЭ была отведена дополнительная ключевая роль в регуляции ростаглаз 3 и, таким образом, в развитии близорукости4. Это назначение основано на критическом расположении RPE, расположенном между сетчаткой и сосудистой оболочкой, и в настоящее время широко распространенном признании того, что рост глаз и, следовательно, аномалии рефракции регулируются локально5. Считается, что RPE играет ключевую роль в качестве сигнального реле, связывающего сетчатку, предполагаемый источник сигналов модуляции роста, с сосудистой оболочкой и склерой, двумя мишенями ретранслируемых сигналов 6,7,8.
Увеличение осевой длины, которое характеризует большинство близорукости, не может считаться доброкачественным, при этом патофизиологические изменения, затрагивающие сетчатку, сосудистую оболочку и/или склеру, представляют собой неизбежные и в настоящее время хорошо известные последствия чрезмерного удлинения глаза 7,9. В этом контексте RPE, пожалуй, наиболее уязвим, поскольку, будучи немитотической тканью, он способен приспосабливаться к расширяющейся стекловидной камере только за счет растяжения и истончения отдельных клеток. Хотя его роль в патологиях, связанных с близорукостью, таких как миопическая макулярная дегенерация, еще предстоит полностью понять, RPE был вовлечен в патогенез ряда других заболеваний сетчатки, включая географическую атрофию, одну из основных причин слепоты, которая связана с документально подтвержденными аномалиями сетчатки, RPE и сосудистой оболочки10,11, Статья 12.
Успешная изоляция клеток RPE, свободных от загрязнения из соседних тканей глаза, потенциально открывает множество исследовательских возможностей для получения нового понимания механизмов, лежащих в основе различных заболеваний глаз / сетчатки. Тем не менее, выделение РПЭ оказалось сложной задачей, и по этой причине во многих опубликованных исследованиях использовались комбинированные образцы сетчатки/РПЭ или РПЭ/сосудистой оболочки13,14,15. Исследования, связанные с успешным выделением RPE качества, подходящего для исследований молекулярной биологии, были ограничены глазами цыплят и мышей16,17. Например, метод одновременной изоляции RPE и стабилизации РНК (SRIRS), описанный Wang et al.18. Выделение клеток RPE у мышей, по-видимому, не очень хорошо работает в глазах морских свинок. Описанный здесь протокол представляет собой усовершенствование подхода, который был первоначально прототипирован с глазами землеройки одним из авторов (М.Ф.) и доказал, что дает высококачественные образцы RPE, подходящие для анализа РНК и других молекулярной биологии, из глаз молодых пигментированных морских свинок19.
Protocol
Representative Results
Discussion
В этой статье мы описываем метод выделения RPE, подходящий для анализа экспрессии генов RPE, из глаз молодых пигментированных морских свинок. Достоинства этого протокола заключаются в том, что он дает высококачественные образцы RPE, которые относительно свободны от загрязнения, с РНК, соот?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Это исследование поддержано стипендиями Японского общества содействия науке за рубежом (S.G.), докторантом Лориса и Дэвида Рича (S.G.) и грантом Национального глазного института Национальных институтов здравоохранения (R01EY012392; К.Ф.В.).
Materials
| 1 mL Syringe with Slip Tip | Bd Vacutainer Labware Medical | 22-253-260 | |
| 2-Mercaptoethanol | Invitrogen | 21985-023 | |
| 6 Well Tissue Culture Plate with Lid, Flat Bottom, Sterile | pectrum Chemical Mfg. Corp | 970-95008 | |
| 12 Well Tissue Culture Plate with Lid, Individual, Sterile | Thomas Scientific LLC | 1198D72 | |
| Agilent 2100 Bioanalyzer | automated electrophoresis to check RNA quality | ||
| Balanced Salt Solutions | Gibco | 10010031 | |
| Bonn Micro Forceps, Straight Smooth, 0.3 mm Tip, 7 cm | Fine Science Tools, Inc. | 11083-07 | |
| Dumont forceps no. 5 | ROBOZ | RS-5045 | |
| Hypodermic disposable needles | Exelint International, Co. | 26419 | |
| Hypodermic disposable needles | Exelint International, Co. | 26437 | |
| MiniSpin Microcentrifuges | Eppendorf | 540108 | Max. Speed: 8,000 g |
| RNAlater Stabilization Solution | Invitrogen | AM7020 | tissue storage reagent |
| RNeasy Mini kits | Qiagen | 74104 | RNA isolation kit |
| Student Vannas Spring Scissors | Fine Science Tools, Inc. | 91500-09 |
References
- Strauss, O. The retinal pigment epithelium in visual function. Physiological Reviews. 85 (3), 845-881 (2005).
- Amram, B., Cohen-Tayar, Y., David, A., Ashery-Padan, R. The retinal pigmented epithelium – from basic developmental biology research to translational approaches. The International Journal of Developmental Biology. 61 (3-4-5), 225-234 (2017).
- Goto, S., et al. Neural retina-specific Aldh1a1 controls dorsal choroidal vascular development via Sox9 expression in retinal pigment epithelial cells. Elife. 7, 32358 (2018).
- Rymer, J., Wildsoet, C. F. The role of the retinal pigment epithelium in eye growth regulation and myopia: A review. Visual Neuroscience. 22 (3), 251-261 (2005).
- Wallman, J., et al. Moving the retina: Choroidal modulation of refractive state. Vision Research. 35 (1), 37-50 (1995).
- Wu, H., et al. Scleral hypoxia is a target for myopia control. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (30), 7091-7100 (2018).
- Troilo, D., et al. Imi – Report on experimental models of emmetropization and myopia. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 60 (3), 31-88 (2019).
- Jiang, X., et al. Violet light suppresses lens-induced myopia via neuropsin (OPN5) in mice. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 118 (22), e2018840118 (2021).
- Zhang, Y., Wildsoet, C. F. RPE and choroid mechanisms underlying ocular growth and myopia. Progress in Molecular Biology and Translational Science. 134, 221-240 (2015).
- Jager, R. D., Mieler, W. F., Miller, J. W. Age-related macular degeneration. New England Journal of Medicine. 358 (24), 2606-2617 (2008).
- McLeod, D. S., et al. Relationship between RPE and choriocapillaris in age-related macular degeneration. Investigative Opthalmology and Visual Science. 50 (10), 4982 (2009).
- Bhutto, I., Lutty, G. Understanding age-related macular degeneration (AMD): Relationships between the photoreceptor/retinal pigment epithelium/Bruch’s membrane/choriocapillaris complex. Molecular Aspects of Medicine. 33 (4), 295-317 (2012).
- Shelton, L., et al. Microarray analysis of choroid/RPE gene expression in marmoset eyes undergoing changes in ocular growth and refraction. Molecular Vision. 14, 1465-1479 (2008).
- Wang, S., Liu, S., Mao, J., Wen, D. Effect of retinoic acid on the tight junctions of the retinal pigment epithelium-choroid complex of guinea pigs with lens-induced myopia in vivo. International Journal of Molecular Medicine. 33 (4), 825-832 (2014).
- He, L., Frost, M. R., Siegwart, J. T., Norton, T. T. Altered gene expression in tree shrew retina and retinal pigment epithelium produced by short periods of minus-lens wear. Experimental Eye Research. 168 (3), 77-88 (2018).
- Nickla, D. L., Wallman, J. The multifunctional choroid. Progress in Retinal and Eye Research. 29 (2), 144-168 (2010).
- Zhang, Y., Liu, Y., Wildsoet, C. F. Bidirectional, optical sign-dependent regulation of BMP2 gene expression in chick retinal pigment epithelium. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 53 (10), 6072-6080 (2012).
- Xin-Zhao Wang, C., Zhang, K., Aredo, B., Lu, H., Ufret-Vincenty, R. L. Novel method for the rapid isolation of RPE cells specifically for RNA extraction and analysis. Experimental Eye Research. 102 (1), 1-9 (2012).
- Goto, S., et al. Gene expression signatures of contact lens-induced myopia in guinea pig retinal pigment epithelium. Investigative Opthalmology and Visual Science. 63 (9), 25 (2022).
- De Schaepdrijver, L., Simoens, P., Lauwers, H., De Geest, J. P. Retinal vascular patterns in domestic animals. Research in Veterinary Science. 47 (1), 34-42 (1989).
- Araki, H., et al. Base-resolution methylome of retinal pigment epithelial cells used in the first trial of human induced pluripotent stem cell-based autologous transplantation. Stem Cell Reports. 13 (4), 761-774 (2019).
- Sonoda, S., et al. A protocol for the culture and differentiation of highly polarized human retinal pigment epithelial cells. Nature Protocols. 4 (5), 662-673 (2009).
- Fernandez-Godino, R., Garland, D. L., Pierce, E. A. Isolation, culture and characterization of primary mouse RPE cells. Nature Protocols. 11 (7), 1206-1218 (2016).
