عزل الخلايا الظهارية الصبغية الشبكية من عيون خنزير غينيا
Summary
وصفنا طريقة بسيطة وفعالة لعزل خلايا ظهارة الشبكية الصبغية (RPE) عن عيون خنازير غينيا المصطبغة الصغيرة. يسمح هذا الإجراء بمتابعة دراسات البيولوجيا الجزيئية على RPE المعزول ، بما في ذلك تحليلات التعبير الجيني.
Abstract
يصف هذا البروتوكول عزل خلايا ظهارة الشبكية الصبغية (RPE) عن عيون صغار خنازير غينيا المصطبغة للتطبيق المحتمل في دراسات البيولوجيا الجزيئية ، بما في ذلك تحليلات التعبير الجيني. في سياق تنظيم نمو العين وقصر النظر ، من المحتمل أن يلعب RPE دورا كمرحل خلوي للإشارات المعدلة للنمو ، حيث يقع بين شبكية العين وجداري العين ، مثل المشيمية والصلبة. في حين تم تطوير بروتوكولات لعزل RPE لكل من الكتاكيت والفئران ، فقد أثبتت هذه البروتوكولات أنها غير قابلة للترجمة مباشرة إلى خنزير غينيا ، الذي أصبح نموذجا مهما ومستخدما على نطاق واسع لقصر النظر في الثدييات. في هذه الدراسة ، تم استخدام أدوات البيولوجيا الجزيئية لفحص التعبير عن جينات معينة للتأكد من أن العينات كانت خالية من التلوث من الأنسجة المجاورة. وقد تم بالفعل إثبات قيمة هذا البروتوكول في دراسة RNA-Seq ل RPE من خنازير غينيا الصغيرة المصطبغة المعرضة لإلغاء التركيز البصري الذي يحفز قصر النظر. بالإضافة إلى تنظيم نمو العين ، فإن هذا البروتوكول له تطبيقات محتملة أخرى في دراسات أمراض الشبكية ، بما في ذلك اعتلال البقعة قصير النظر ، وهو أحد الأسباب الرئيسية للعمى في myopes ، والذي تورط فيه RPE. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنها بسيطة نسبيا وبمجرد إتقانها ، تنتج عينات RPE عالية الجودة مناسبة لدراسات البيولوجيا الجزيئية ، بما في ذلك تحليل الحمض النووي الريبي.
Introduction
يتكون RPE من طبقة أحادية فريدة من الخلايا المصطبغة الموجودة بين الشبكية العصبية والمشيمية الوعائية ، و RPE لها أدوار معترف بها جيدا في تطوير وصيانة وظيفة الشبكية الطبيعية ، بما في ذلك النقل الضوئي 1,2. في الآونة الأخيرة ، تم تكليف RPE بدور رئيسي إضافي في تنظيم نمو العين3 ، وبالتالي تطوير قصر النظر4. يعتمد هذا التعيين على الموقع الحرج ل RPE ، المتداخل بين شبكية العين والمشيمية والقبول الواسع الآن بأن نمو العين ، وبالتالي الأخطاء الانكسارية يتم تنظيمها محليا5. يعتقد أن RPE يلعب دورا رئيسيا كمتابع إشارة ، يربط شبكية العين ، المصدر المفترض للإشارات المعدلة للنمو ، بالمشيمية والصلبة ، وهما الهدفان للإشارات المنقولة6،7،8.
لا يمكن اعتبار الزيادة في الطول المحوري التي تميز معظم قصر النظر حميدة ، حيث تمثل التغيرات الفسيولوجية المرضية التي تشمل شبكية العين و / أو المشيمية و / أو الصلبة عواقب لا مفر منها ومعترف بها الآن لاستطالة العين المفرطة 7,9. في هذا السياق ، ربما يكون RPE هو الأكثر ضعفا ، لأنه ، كونه نسيجا غير ميتوتي ، فهو قادر فقط على استيعاب الغرفة الزجاجية المتوسعة عن طريق تمدد الخلايا الفردية وترققها. في حين أن دوره في الأمراض المرتبطة بقصر النظر ، مثل الضمور البقعي قصير النظر ، لم يتم فهمه بالكامل بعد ، فقد تورط RPE في التسبب في عدد من أمراض الشبكية الأخرى ، بما في ذلك الضمور الجغرافي ، أحد الأسباب الرئيسية للعمى ، والذي يرتبط بتشوهات موثقة في شبكية العين ، RPE ، والمشيمية10,11 ، 12.
من المحتمل أن يفتح العزل الناجح لخلايا RPE ، الخالية من التلوث من أنسجة العين المجاورة ، العديد من الفرص البحثية لاكتساب رؤى جديدة حول الآليات الكامنة وراء مجموعة متنوعة من أمراض العين / الشبكية. ومع ذلك ، فقد ثبت أن عزل RPE يمثل تحديا ، حيث استخدمت العديد من الدراسات المنشورة عينات شبكية العين / RPE أو RPE / المشيمية المدمجة لهذا السبب13،14،15. اقتصرت الدراسات التي تنطوي على عزل ناجح ل RPE لجودة مناسبة لدراسات البيولوجيا الجزيئية على عيون الفرخ والفأر16,17. على سبيل المثال ، طريقة عزل RPE المتزامنة وتثبيت الحمض النووي الريبي (SRIRS) التي وصفها Wang et al.18. لا يبدو أن عزل خلايا RPE في الفئران يعمل بشكل جيد في عيون خنزير غينيا. يمثل البروتوكول الموصوف هنا تحسينا لنهج تم تصميمه في البداية بعيون زبابة الأشجار من قبل أحد المؤلفين (MF) وأثبت أنه ينتج عينات RPE عالية الجودة ، مناسبة لتحليلات الحمض النووي الريبي والبيولوجيا الجزيئية الأخرى ، من عيون خنازير غينيا الصغيرة المصطبغة19.
Protocol
Representative Results
Discussion
في هذه المقالة ، نصف طريقة لعزل RPE ، مناسبة لتحليلات التعبير الجيني RPE ، من عيون خنازير غينيا الصغيرة المصطبغة. تتمثل مزايا هذا البروتوكول في أنه ينتج عينات RPE عالية الجودة وخالية نسبيا من التلوث ، مع الحفاظ على الحمض النووي الريبي بشكل مناسب للتحليلات الخاصة بالحمض النووي الريبي ، ومع ذلك ?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
هذه الدراسة مدعومة من قبل الجمعية اليابانية لتعزيز زمالات أبحاث العلوم في الخارج (SG) ، وباحث ما بعد الدكتوراه لوريس وديفيد ريتش (SG) ، ومنحة من المعهد الوطني للعيون التابع للمعاهد الوطنية للصحة (R01EY012392; كف. و.).
Materials
| 1 mL Syringe with Slip Tip | Bd Vacutainer Labware Medical | 22-253-260 | |
| 2-Mercaptoethanol | Invitrogen | 21985-023 | |
| 6 Well Tissue Culture Plate with Lid, Flat Bottom, Sterile | pectrum Chemical Mfg. Corp | 970-95008 | |
| 12 Well Tissue Culture Plate with Lid, Individual, Sterile | Thomas Scientific LLC | 1198D72 | |
| Agilent 2100 Bioanalyzer | automated electrophoresis to check RNA quality | ||
| Balanced Salt Solutions | Gibco | 10010031 | |
| Bonn Micro Forceps, Straight Smooth, 0.3 mm Tip, 7 cm | Fine Science Tools, Inc. | 11083-07 | |
| Dumont forceps no. 5 | ROBOZ | RS-5045 | |
| Hypodermic disposable needles | Exelint International, Co. | 26419 | |
| Hypodermic disposable needles | Exelint International, Co. | 26437 | |
| MiniSpin Microcentrifuges | Eppendorf | 540108 | Max. Speed: 8,000 g |
| RNAlater Stabilization Solution | Invitrogen | AM7020 | tissue storage reagent |
| RNeasy Mini kits | Qiagen | 74104 | RNA isolation kit |
| Student Vannas Spring Scissors | Fine Science Tools, Inc. | 91500-09 |
References
- Strauss, O. The retinal pigment epithelium in visual function. Physiological Reviews. 85 (3), 845-881 (2005).
- Amram, B., Cohen-Tayar, Y., David, A., Ashery-Padan, R. The retinal pigmented epithelium – from basic developmental biology research to translational approaches. The International Journal of Developmental Biology. 61 (3-4-5), 225-234 (2017).
- Goto, S., et al. Neural retina-specific Aldh1a1 controls dorsal choroidal vascular development via Sox9 expression in retinal pigment epithelial cells. Elife. 7, 32358 (2018).
- Rymer, J., Wildsoet, C. F. The role of the retinal pigment epithelium in eye growth regulation and myopia: A review. Visual Neuroscience. 22 (3), 251-261 (2005).
- Wallman, J., et al. Moving the retina: Choroidal modulation of refractive state. Vision Research. 35 (1), 37-50 (1995).
- Wu, H., et al. Scleral hypoxia is a target for myopia control. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (30), 7091-7100 (2018).
- Troilo, D., et al. Imi – Report on experimental models of emmetropization and myopia. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 60 (3), 31-88 (2019).
- Jiang, X., et al. Violet light suppresses lens-induced myopia via neuropsin (OPN5) in mice. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 118 (22), e2018840118 (2021).
- Zhang, Y., Wildsoet, C. F. RPE and choroid mechanisms underlying ocular growth and myopia. Progress in Molecular Biology and Translational Science. 134, 221-240 (2015).
- Jager, R. D., Mieler, W. F., Miller, J. W. Age-related macular degeneration. New England Journal of Medicine. 358 (24), 2606-2617 (2008).
- McLeod, D. S., et al. Relationship between RPE and choriocapillaris in age-related macular degeneration. Investigative Opthalmology and Visual Science. 50 (10), 4982 (2009).
- Bhutto, I., Lutty, G. Understanding age-related macular degeneration (AMD): Relationships between the photoreceptor/retinal pigment epithelium/Bruch’s membrane/choriocapillaris complex. Molecular Aspects of Medicine. 33 (4), 295-317 (2012).
- Shelton, L., et al. Microarray analysis of choroid/RPE gene expression in marmoset eyes undergoing changes in ocular growth and refraction. Molecular Vision. 14, 1465-1479 (2008).
- Wang, S., Liu, S., Mao, J., Wen, D. Effect of retinoic acid on the tight junctions of the retinal pigment epithelium-choroid complex of guinea pigs with lens-induced myopia in vivo. International Journal of Molecular Medicine. 33 (4), 825-832 (2014).
- He, L., Frost, M. R., Siegwart, J. T., Norton, T. T. Altered gene expression in tree shrew retina and retinal pigment epithelium produced by short periods of minus-lens wear. Experimental Eye Research. 168 (3), 77-88 (2018).
- Nickla, D. L., Wallman, J. The multifunctional choroid. Progress in Retinal and Eye Research. 29 (2), 144-168 (2010).
- Zhang, Y., Liu, Y., Wildsoet, C. F. Bidirectional, optical sign-dependent regulation of BMP2 gene expression in chick retinal pigment epithelium. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 53 (10), 6072-6080 (2012).
- Xin-Zhao Wang, C., Zhang, K., Aredo, B., Lu, H., Ufret-Vincenty, R. L. Novel method for the rapid isolation of RPE cells specifically for RNA extraction and analysis. Experimental Eye Research. 102 (1), 1-9 (2012).
- Goto, S., et al. Gene expression signatures of contact lens-induced myopia in guinea pig retinal pigment epithelium. Investigative Opthalmology and Visual Science. 63 (9), 25 (2022).
- De Schaepdrijver, L., Simoens, P., Lauwers, H., De Geest, J. P. Retinal vascular patterns in domestic animals. Research in Veterinary Science. 47 (1), 34-42 (1989).
- Araki, H., et al. Base-resolution methylome of retinal pigment epithelial cells used in the first trial of human induced pluripotent stem cell-based autologous transplantation. Stem Cell Reports. 13 (4), 761-774 (2019).
- Sonoda, S., et al. A protocol for the culture and differentiation of highly polarized human retinal pigment epithelial cells. Nature Protocols. 4 (5), 662-673 (2009).
- Fernandez-Godino, R., Garland, D. L., Pierce, E. A. Isolation, culture and characterization of primary mouse RPE cells. Nature Protocols. 11 (7), 1206-1218 (2016).
