Essais de cytotoxicité avec des lignées cellulaires de poisson zèbre

Summary

Ce protocole présente des tests de cytotoxicité couramment utilisés (tests Alamar Blue [AB], CFDA-AM, Neutral Red et MTT) adaptés à l’évaluation de la cytotoxicité dans des lignées cellulaires d’embryons de poisson zèbre (ZEM2S) et de foie (ZFL) dans des plaques à 96 puits.

Abstract

Les lignées cellulaires de poissons sont de plus en plus utilisées dans les études d’écotoxicité, et des essais de cytotoxicité ont été proposés comme méthodes pour prédire la toxicité aiguë des poissons. Ainsi, ce protocole présente des tests de cytotoxicité modifiés pour évaluer la viabilité cellulaire dans des lignées cellulaires embryonnaires de poisson zèbre (Danio rerio) (ZEM2S) et de foie (ZFL) dans des plaques à 96 puits. Les paramètres de cytotoxicité évalués sont l’intégrité mitochondriale (tests Alamar Blue [AB] et MTT), l’intégrité de la membrane via l’activité estérase (test CFDA-AM) et l’intégrité de la membrane lysosomale (test rouge neutre [NR]). Après l’exposition des substances d’essai dans une plaque de 96 puits, les essais de cytotoxicité sont effectués; ici, AB et CFDA-AM sont effectués simultanément, suivis de NR sur la même plaque, tandis que le test MTT est effectué sur une plaque séparée. Les lectures de ces tests sont prises par fluorescence pour AB et CFDA-AM, et absorbance pour MTT et NR. Les essais de cytotoxicité effectués avec ces lignées cellulaires de poissons peuvent être utilisés pour étudier la toxicité aiguë des substances chimiques sur les poissons.

Introduction

Les substances chimiques doivent être testées en ce qui concerne leur sécurité pour la santé humaine et l’environnement. Les biomarqueurs moléculaires et cellulaires sont de plus en plus pris en compte dans les évaluations de l’innocuité pour prédire les effets sur les organismes vivants par les organismes de réglementation et/ou les lois (p. ex. REACH, OCDE, US EPA)^1,2, car ils peuvent précéder le résultat indésirable in vivo (p. ex. perturbation endocrinienne, réponse immunologique, toxicité aiguë, phototoxicité)3,4,5,6,7 ^<....

Protocol

REMARQUE : Voir le tableau des matériaux pour la liste des matériaux utilisés dans ce protocole et le tableau 1 pour la composition des solutions et des milieux utilisés dans ce protocole.

1. Préparation des cellules ZFL et ZEM2S

1. Commencer avec une fiole T75 de cellules ZFL ou ZEM2S avec 80% de confluence, cultivée dans le milieu complet respectif à 28 °C sans CO₂.
2. Retirer le milieu de culture de la fiole et laver les cellules en ajoutant 10 mL de 1x solution saline tamponnée au phosphate (PBS) (0,01 M). Ajouter 3 mL de 1x trypsine (0,05 % v/v; 0,5 mM trypsine....

Results

La figure 3 montre les plaques des tests AB, CFDA-AM, NR et MTT. Pour le test AB (figure 3A), les puits blancs et les puits sans cellules viables ou avec un nombre réduit de cellules viables présentent une couleur bleue et une faible fluorescence, tandis que les puits avec un nombre élevé de cellules viables sont rosâtres et présentent des valeurs de fluorescence élevées en raison de la transformation de la résazurine (AB) en résorunine (substance rosâtre) par l.......

Discussion

Les essais de cytotoxicité sont largement utilisés pour l’évaluation de la toxicité in vitro, et cet article de protocole présente quatre tests de cytotoxicité couramment utilisés modifiés pour être effectués dans des lignées cellulaires de poisson zèbre (c.-à-d. densité cellulaire pour la plaque de 96 puits, temps d’incubation dans le test MTT, déplétion FBS pendant les conditions d’exposition chimique et concentration maximale acceptable pour le SC). Comme ces tests quantifient la cytotoxicité selon différents.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
5-CFDA, AM (Diacétate de 5-carboxyfluorescéine, ester acétoxyméthylique)	Invitrogen	C1345
Plaque de culture cellulaire, plaque 96 puits	Sarstedt	83.3924	Surface : Standard, base plate
DMEM	Gibco	12800-017	Poudre, haute teneur en glucose, pyruvate
FBS - Sérum de veau fœtal, qualifié, régions approuvées par l’USDA	Gibco	12657-029
Ham’s F-12 Nutrient Mix, poudre	Gibco	21700026	Poudre
HEPES (1 M)	Gibco	15630080
Leibovitz’s L-15	Medium Gibco	41300021	Poudre
Neutral red  ;	Sigma-Aldrich	N4638	Poudre, BioRéactif, adapté à la culture cellulaire
Agitateur orbital  ;	Warmnest	KLD-350-BI	22 mm de diamètre
de rotation Dulbeccos PBS (10X) avec calcium et magnésium	Invitrogen	14080055
Pénicilline-Streptomycine (10 000 U/mL)	Gibco	15140122
Sel sodique de résazurine  ;	Sigma-Aldrich	R7017	Poudre, BioRéactif, adapté à la culture cellulaire
RPMI 1640 Medium	Gibco	31800-014	Poudre
Bicarbonate	de sodium Sigma-Aldrich	S5761	Poudre, bioréactif pour la biologie moléculaire
Bleu de thiazolyle Bromure de tétrazolium 98 %	Sigma-Aldrich	M2128
Coloration bleue de trypan (0,4 %)	Gibco	15250-061
Trypsine-EDTA (0,5 %), pas de rouge de phénol	Gibco	15400054
lignée cellulaire ZEM2S	ATCC	CRL-2147	Cette lignée cellulaire a été aimablement donnée par le professeur Dr. Michael J. Carvan (Université du Wisconsin, Milwaukee, États-Unis)
Lignée cellulaire ZFL	BCRJ	256