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Environnement

Ensayos de citotoxicidad con líneas celulares de pez cebra

Published: January 06, 2023
doi:
10.3791/64860
, , , , , , , , ,
1Graduate Program in Genetics, Department of Genetics,Federal University of Paraná (UFPR), 2Safety of Product Department,Grupo Boticário, 3Department of Genetics,Federal University of Paraná (UFPR)

Summary

Este protocolo presenta ensayos de citotoxicidad de uso común (ensayos Alamar Blue [AB], CFDA-AM, Neutral Red y MTT) adaptados para la evaluación de la citotoxicidad en líneas celulares de embrión de pez cebra (ZEM2S) e hígado (ZFL) en placas de 96 pocillos.

Abstract

Las líneas celulares de peces se han utilizado cada vez más en estudios de ecotoxicidad, y los ensayos de citotoxicidad se han propuesto como métodos para predecir la toxicidad aguda de los peces. Por lo tanto, este protocolo presenta ensayos de citotoxicidad modificados para evaluar la viabilidad celular en líneas celulares de embrión de pez cebra (Danio rerio) (ZEM2S) e hígado (ZFL) en placas de 96 pocillos. Los criterios de valoración de citotoxicidad evaluados son la integridad mitocondrial (ensayos Alamar Blue [AB] y MTT), la integridad de la membrana a través de la actividad de la esterasa (ensayo CFDA-AM) y la integridad de la membrana lisosomal (ensayo Neutral Red [NR]). Después de la exposición de las sustancias de ensayo en una placa de 96 pocillos, se realizan los ensayos de citotoxicidad; aquí, AB y CFDA-AM se llevan a cabo simultáneamente, seguidos de NR en la misma placa, mientras que el ensayo MTT se realiza en una placa separada. Las lecturas para estos ensayos se toman por fluorescencia para AB y CFDA-AM, y absorbancia para MTT y NR. Los ensayos de citotoxicidad realizados con estas líneas celulares de peces se pueden utilizar para estudiar la toxicidad aguda de sustancias químicas en peces.

Introduction

Las sustancias químicas deben ser probadas en cuanto a su seguridad para la salud humana y el medio ambiente. Los biomarcadores moleculares y celulares se han considerado cada vez más en las evaluaciones de seguridad para predecir los efectos en los organismos vivos por parte de las agencias reguladoras y/o legislaciones (por ejemplo, REACH, OCDE, US EPA)1,2, ya que pueden preceder al resultado adverso in vivo (por ejemplo, alteración endocrina, respuesta inmunológica, toxicidad aguda, fototoxicidad)3,4,5,6,7 . En este contexto, la citotoxicidad ha sido tomada como medida para predecir la toxicidad aguda de los peces 5,8; Sin embargo, puede tener muchas otras aplicaciones en estudios de ecotoxicidad, como la definición de concentraciones subcitotóxicas de sustancias químicas para estudiar su conjunto más diverso de efectos en los peces (por ejemplo, efectos de alteración endocrina).

En los sistemas de cultivo celular (sistemas in vitro ), la citotoxicidad de las sustancias químicas puede determinarse mediante métodos que difieren en los tipos de criterios de valoración. Por ejemplo, un método de citotoxicidad puede basarse en un punto final relacionado con la morfología específica observada durante el proceso de muerte celular, mientras que otro puede determinar la citotoxicidad mediante la medición de la muerte celular, la viabilidad y funcionalidad, la morfología, el metabolismo energético y la unión y proliferación celular. Las sustancias químicas pueden afectar la viabilidad celular a través de diferentes mecanismos, por lo que la evaluación de la citotoxicidad que cubre diferentes criterios de valoración de la viabilidad celular es necesaria para predecir los efectos químicos9.

MTT y Alamar Blue (AB) son ensayos que determinan los efectos sobre la viabilidad celular en función de la actividad metabólica celular. El ensayo MTT evalúa la actividad de la enzima mitocondrial succinato deshidrogenasa10. La reducción del bromuro amarillento de 3-[4,5-dimetiltiazol-2il]-2,5-difeniltetrazolio (MTT) a azul de formazán ocurre solo en células viables, y su densidad óptica es directamente proporcional al número de células viables10. El ensayo AB es un indicador sensible de oxidación-reducción, mediado por enzimas mitocondriales que emiten fluorescencia y cambian de color al reducir la resazurina a resorufina por las células vivas11; sin embargo, las enzimas citosólicas y microsomales también contribuyen a la reducción de AB y MTT12. Estas enzimas pueden incluir varias reductasas, como alcohol y aldehído oxidorreductasas, NAD(P)H: quinona oxidorreductasa, flavina reductasa, NADH deshidrogenasa y citocromos11.

El ensayo Neutral Red (NR) es un ensayo de viabilidad celular basado en la incorporación de este colorante en los lisosomas de células viables13. La absorción de NR depende de la capacidad de las células para mantener gradientes de pH. El gradiente de protones dentro de los lisosomas mantiene un pH más bajo que el citoplasma. A pH fisiológico normal, el NR presenta una carga neta de aproximadamente cero, lo que le permite penetrar en las membranas celulares. Por lo tanto, el tinte se carga y se retiene dentro de los lisosomas. En consecuencia, cuanto mayor es la cantidad de NR retenida, mayor es el número de células viables14. Las sustancias químicas que dañan la superficie celular o las membranas lisosomales perjudican la absorción de este colorante.

El ensayo CFDA-AM es un ensayo de viabilidad celular fluorométrica basado en la retención de éster acetoxymetilo de diacetato de 5-carboxifluoresceína (CFDA-AM)15. La 5-CFDA-AM, sustrato de esterasa, se convierte en carboxifluoresceína, sustancia fluorescente que es polar y no permeable por las membranas de las células vivas15; Por lo tanto, se retiene en el lado interno de una membrana celular intacta, lo que indica células viables.

Recientemente, se combinaron tres ensayos de citotoxicidad (ensayos CFDA-AM, NR y AB) en una guía ISO (Organización Internacional de Normalización) validada (ISO 21115: 2019)16 y un método de prueba de la OCDE (Organización para la Cooperación y el Desarrollo Económicos) (OCDE TG 249) para evaluar la toxicidad aguda de los peces utilizando la línea celular RTgill-W1 (línea celular permanente de trucha arco iris [Oncorhynchus mykiss] branquia) en placas de 24 pocillos17 . Aunque existe un método basado en células para predecir la toxicidad aguda de los peces, se han invertido esfuerzos en desarrollar métodos similares con otras especies de peces y aumentar el rendimiento del método. Algunos ejemplos incluyen el desarrollo de líneas celulares ZFL transfectadas con genes reporteros para vías de toxicidad específicas18,19, pruebas de fototoxicidad en la línea celular RTgill-W1 20, y el uso de líneas celulares ZFL y ZF4 (fibroblástico de pez cebra derivado de embriones de 1 día de edad) para evaluar la toxicidad mediante varios ensayos de citotoxicidad21.

Danio rerio (pez cebra) es una de las principales especies de peces utilizadas en estudios de toxicidad acuática; Por lo tanto, los métodos basados en células con líneas celulares de pez cebra para pruebas de toxicidad de peces pueden ser extremadamente útiles. La línea celular ZFL es una línea celular de hepatocitos epiteliales de pez cebra que presenta las principales características de las células del parénquima hepático y puede metabolizar xenobióticos 7,22,23,24,25. Mientras tanto, la línea celular ZEM2S es una línea celular fibroblástica embrionaria de pez cebra derivada de la etapa de blástula que puede usarse para investigar los efectos del desarrollo en peces26,27. Por lo tanto, este protocolo describe cuatro ensayos de citotoxicidad (ensayos MTT, AB, NR y CFDA-AM), con modificaciones que se realizarán con líneas celulares ZFL y ZEM2S en placas de 96 pocillos.

Protocol

NOTA: Consulte la Tabla de materiales para obtener la lista de materiales utilizados en este protocolo y la Tabla 1 para la composición de soluciones y medios utilizados en este protocolo. 1. Preparación de células ZFL y ZEM2S Comenzar con un matraz T75 de células ZFL o ZEM2S con 80% de confluencia, cultivadas en el medio completo respectivo a 28 °C sinCO2. Retirar el medio de cultivo del matraz y lavar las …

Representative Results

La figura 3 muestra las placas de los ensayos AB, CFDA-AM, NR y MTT. Para el ensayo AB (Figura 3A), los pocillos en blanco y los pocillos sin células viables o con un número reducido de ellas muestran color azul y baja fluorescencia, mientras que los pocillos con un alto número de células viables son rosados y presentan altos valores de fluorescencia debido a la transformación de resazurina (AB) en resorufina (sustancia rosada) por las células viables. Par…

Discussion

Los ensayos de citotoxicidad son ampliamente utilizados para la evaluación de toxicidad in vitro, y este artículo del protocolo presenta cuatro ensayos de citotoxicidad comúnmente utilizados modificados para ser realizados en líneas celulares de pez cebra (es decir, densidad celular para placa de 96 pocillos, tiempo de incubación en el ensayo MTT, agotamiento de FBS durante la condición de exposición química y concentración máxima aceptable para el SC). Como estos ensayos cuantifican la citotoxicidad p…

Divulgations

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

En memoria del Dr. Márcio Lorencini, coautor de este trabajo, excelente investigador en el campo de la cosmética y dedicado a promover la investigación cosmética en Brasil. Los autores agradecen al Laboratorio Multiusuario del Departamento de Fisiología (UFPR) por la disponibilidad de equipos y por el apoyo financiero de la Coordinación para el Perfeccionamiento del Personal de Enseñanza Superior (CAPES, Brasil) (Código de Finanzas 001) y del Grupo Boticario.

Materials

5-CFDA, AM (5-Carboxyfluorescein Diacetate, Acetoxymethyl Ester) Invitrogen C1345
Cell culture plate, 96 well plate Sarstedt 83.3924 Surface: Standard, flat base
DMEM Gibco 12800-017 Powder, high glucose, pyruvate
Ham's F-12 Nutrient Mix, powder Gibco 21700026 Powder
HEPES (1 M) Gibco 15630080
Leibovitz's L-15 Medium Gibco 41300021 Powder
Neutral red  Sigma-Aldrich N4638 Powder, BioReagent, suitable for cell culture
Orbital shaker  Warmnest KLD-350-BI 22 mm rotation diameter
Dulbeccos PBS (10X) with calcium and magnesium Invitrogen 14080055
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) Gibco 15140122
Resazurin sodium salt  Sigma-Aldrich R7017 Powder, BioReagent, suitable for cell culture
RPMI 1640 Medium Gibco 31800-014 Powder
SFB – Fetal Bovine Serum, qualified, USDA-approved regions Gibco 12657-029
Sodium bicarbonate Sigma-Aldrich S5761 Powder,  bioreagent for molecular biology
Thiazolyl Blue Tetrazolium Bromide  98% Sigma-Aldrich M2128
Trypan blue stain (0.4%) Gibco 15250-061
Trypsin-EDTA (0.5%), no phenol red Gibco 15400054
ZEM2S cell line ATCC CRL-2147 This cell line was kindly donated by Professor Dr. Michael J.
Carvan (University of Wisconsin, Milwaukee, USA)
ZFL cell line BCRJ 256
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References

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Keywords: Cytotoxicity AssayZebrafish Cell LinesZEM2SZFL96-well PlateCell ViabilityAcute ToxicityEcotoxicityAlternative Fish AssaysHepatocytesEmbryonic CellsCell SuspensionMulti-channel PipetteTest ChemicalsTriton X-100Exposure Media
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Citer Cet Article
Rodrigues de Souza, I., Wilke Sivek, T., Vaz de Oliveira, J. B., Di Pietro Micali Canavez, A., de Albuquerque Vita, N., Cigaran Schuck, D., Rodrigues de Souza, I., Cestari, M. M., Lorencini, M., Leme, D. M. Cytotoxicity Assays with Zebrafish Cell Lines. J. Vis. Exp. (191), e64860, doi:10.3791/64860 (2023).
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