Neuroni ipotalamici di kisspeptina come bersaglio per le registrazioni di patch-clamp a cellule intere
Summary
Qui, presentiamo un protocollo per eseguire un patch-clamp a cellule intere su fette di cervello contenenti neuroni kisspeptina, il modulatore primario delle cellule dell’ormone di rilascio delle gonadotropine (GnRH). Aggiungendo conoscenze sull’attività dei neuroni kisspeptina, questo strumento elettrofisiologico è servito come base per progressi significativi nel campo della neuroendocrinologia negli ultimi 20 anni.
Abstract
Le kisspeptine sono essenziali per la maturazione dell’asse ipotalamo-ipofisi-gonadia (HPG) e la fertilità. I neuroni kisspeptina ipotalamici situati nel nucleo periventricolare anteroventrale e nel nucleo periventricolare rostrale, così come il nucleo arcuato dell’ipotalamo, proiettano i neuroni dell’ormone di rilascio della gonadotropina (GnRH), tra le altre cellule. Studi precedenti hanno dimostrato che la segnalazione della kisspeptina avviene attraverso il recettore Kiss1 (Kiss1r), in ultima analisi, eccitando l’attività dei neuroni GnRH. Nell’uomo e nei modelli animali sperimentali, le kisspeptine sono sufficienti per indurre la secrezione di GnRH e, di conseguenza, il rilascio di ormone luteinizzante (LH) e ormone follicolo-stimolante (FSH). Poiché le kisspeptine svolgono un ruolo essenziale nelle funzioni riproduttive, i ricercatori stanno lavorando per valutare come l’attività intrinseca dei neuroni ipotalamici della kisspeptina contribuisca alle azioni correlate alla riproduzione e identificare i neurotrasmettitori primari / neuromodulatori in grado di modificare queste proprietà. La tecnica patch-clamp dell’intera cellula è diventata uno strumento prezioso per studiare l’attività dei neuroni kisspeptina nelle cellule dei roditori. Questa tecnica sperimentale consente ai ricercatori di registrare e misurare le correnti ioniche eccitatorie e inibitorie spontanee, il potenziale di membrana a riposo, il potenziale d’azione e altre proprietà elettrofisiologiche delle membrane cellulari. Nel presente studio, vengono esaminati aspetti cruciali della tecnica patch-clamp dell’intera cellula, nota come misurazioni elettrofisiologiche che definiscono i neuroni kisspeptin ipotalamici e una discussione di questioni rilevanti sulla tecnica.
Introduction
Hodgkin e Huxley hanno fatto la prima registrazione intracellulare di un potenziale d’azione descritto in diversi studi scientifici. Questa registrazione è stata eseguita sull’assone del calamaro, che ha un grande diametro (~ 500 μm), consentendo di posizionare un microelettrodo all’interno dell’assone. Questo lavoro ha fornito grandi possibilità per la ricerca scientifica, culminando in seguito nella creazione del modo di morsetto di tensione, che è stato utilizzato per studiare la base ionica della generazione del potenziale d’azione 1,2,3,4,5,6,7,8. Nel corso degli anni, la tecnica è stata migliorata ed è diventata ampiamente applicata nella ricerca scientifica 6,9. L’invenzione della tecnica patch-clamp, avvenuta alla fine del 1970 attraverso studi avviati da Erwin Neher e Bert Sakmann, ha permesso ai ricercatori di registrare singoli canali ionici e potenziali o correnti di membrana intracellulare praticamente in ogni tipo di cellula utilizzando un solo elettrodo 9,10,11,12. Le registrazioni patch-clamp possono essere effettuate su una varietà di preparati tissutali, come cellule coltivate o fette di tessuto, in modalità tension-clamp (mantenendo la membrana cellulare a una tensione impostata che consente la registrazione, ad esempio, di correnti dipendenti dalla tensione e correnti sinaptiche) o in modalità current-clamp (consentendo la registrazione, ad esempio, delle variazioni del potenziale di membrana a riposo indotte da correnti ioniche, potenziali d’azione e frequenza del potenziale postsinaptico).
L’uso della tecnica patch-clamp ha reso possibili diverse scoperte degne di nota. Infatti, i risultati seminali sulle proprietà elettrofisiologiche dei neuroni ipotalamici kisspeptin situati nei nuclei periventricolare anteroventrale e periventricolare rostrale (AVPV / PeN Kisspeptin), noto anche come area periventricolare rostrale del terzo ventricolo (RP3V), e il nucleo arcuato dell’ipotalamo (ARHkisspeptin)13,14,15 sono di particolare interesse. Nel 2010, Ducret et al. hanno eseguito le prime registrazioni di neuroni AVPV / PeNKisspeptinnei topi utilizzando un altro strumento elettrofisiologico, la tecnica patch-clamp a cellule sciolte. Questi studi hanno fornito una descrizione elettrica dei neuroni AVPV/PeNKisspeptin e hanno dimostrato che i loro schemi di attivazione sono estrali dipendenti dal ciclo16. Nel 2011, Qiu et al. hanno utilizzato la tecnica dell’intero patch-clamp cellulare per dimostrare che i neuroni ARHkisspeptin esprimono correnti pacemaker endogene17. Successivamente, Gottsch et al. hanno dimostrato che i neuroni kisspeptin mostrano attività spontanea ed esprimono sia correnti di calcio di tipo H (pacemaker) che di tipo T, suggerendo che i neuroni ARHkisspeptin condividono proprietà elettrofisiologiche con altri neuroni pacemaker del sistema nervoso centrale18. Inoltre, è stato dimostrato che i neuroni ARH kisspeptin mostrano velocità di attivazione sessualmente dimorfiche e che i neuroni AVPV/PeNKisspeptin mostrano un potenziale di membrana a riposo bimodale (RMP) influenzato dai canali del potassio sensibili all’ATP (KATP)19,20. Inoltre, è stato stabilito che gli steroidi gonadici influenzano positivamente l’attività elettrica spontanea dei neuroni kisspeptina nei topi 19,20,21. I primi lavori che studiano le proprietà elettrofisiologiche dei neuroni kisspeptina sono menzionati 16,17,18,19,20. Da allora, molti studi hanno utilizzato la tecnica patch-clamp dell’intera cellula per dimostrare quali fattori/neuromodulatori sono sufficienti a modulare l’attività elettrica dei neuroni kisspeptina (Figura 1)17,21,22,23,24,25,26,27,28,29,30,31,32.
Data l’importanza di questa tecnica per lo studio dei neuroni necessari per la riproduzione, tra gli altri tipi di cellule non trattati qui, questo articolo descrive i passaggi fondamentali per lo sviluppo della tecnica patch-clamp dell’intera cellula, come la preparazione delle soluzioni, la dissezione e il taglio del cervello e l’esecuzione del sigillo della membrana cellulare per le registrazioni. Inoltre, vengono discusse questioni rilevanti sulla tecnica, come i suoi vantaggi, i limiti tecnici e le variabili importanti che devono essere controllate per prestazioni sperimentali ottimali.
Protocol
Representative Results
Discussion
Lo sviluppo della tecnica patch-clamp a cellule intere ha avuto un impatto significativo sulla comunità scientifica, essendo considerato di fondamentale importanza per lo sviluppo della ricerca scientifica e consentendo diverse scoperte. Il suo impatto sulla scienza è stato sufficiente per culminare nel premio Nobel per la medicina nel 1991, poiché questa scoperta ha aperto la porta a una migliore comprensione di come funzionano i canali ionici in condizioni fisiologiche e patologiche, nonché all’identificazione<sup …
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo studio è stato sostenuto dalla Fondazione di ricerca di San Paolo [numeri di sovvenzione FAPESP: 2021/11551-4 (JNS), 2015/20198-5 (TTZ), 2019/21707/1 (RF); e dal Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) – Codice finanziario 001″ (HRV).
Materials
| Compounds for aCSF, internal and slicing solutions | |||
| ATP | Sigma Aldrich/various | A9187 | |
| CaCl2 | Sigma Aldrich/various | C7902 | |
| D-(+)-Glucose | Sigma Aldrich/various | G7021 | |
| EGTA | Sigma Aldrich/various | O3777 | |
| HEPES | Sigma Aldrich/various | H3375 | |
| KCL | Sigma Aldrich/various | P5405 | |
| K-gluconate | Sigma Aldrich/various | G4500 | |
| KOH | Sigma Aldrich/various | P5958 | |
| MgCl2 | Sigma Aldrich/various | M9272 | |
| MgSO4 | Sigma Aldrich/various | 230391 | |
| NaCl | Sigma Aldrich/various | S5886 | |
| NaH2PO4 | Sigma Aldrich/various | S5011 | |
| NaHCO3 | Sigma Aldrich/various | S5761 | |
| nitric acid | Sigma Aldrich/various | 225711 | CAUTION |
| Sucrose | Sigma Aldrich/various | S1888 | |
| Equipments | |||
| Air table | TMC | 63-534 | |
| Amplifier | Molecular Devices | Multiclamp 700B | |
| Computer | various | – | |
| DIGIDATA 1440 LOW-NOISE DATA ACQUISITION SYSTEM | Molecular Devices | DD1440 | |
| Digital peristaltic pump | Ismatec | ISM833C | |
| Faraday cage | TMC | 81-333-03 | |
| Imaging Camera | Leica | DFC 365 FX | |
| Micromanipulator | Sutter Instruments | Roe-200 | |
| Micropipette Puller | Narishige | PC-10 | |
| Microscope | Leica | DM6000 FS | |
| Osteotome | Bonther equipamentos & Tecnologia/various | 128 | |
| Recovery chamber | Warner Instruments/Harvard apparatus | – | can be made in-house |
| Recording chamber | Warner Instruments | 640277 | |
| Spatula | Fisher Scientific /various | FISH-14-375-10; FISH-21-401-20 | |
| Vibratome | Leica | VT1000 S | |
| Water Bath | Fisher Scientific /various | Isotemp | |
| Software and systems | |||
| AxoScope 10 software | Molecular Devices | – | Commander Software |
| LAS X wide field system | Leica | – | Image acquisition and analysis |
| MultiClamp 700B | Molecular Devices | MULTICLAMP 700B | Commander Software |
| PCLAMP 10 SOFTWARE FOR WINDOWS | Molecular Devices | Pclamp 10 Standard | |
| Tools | |||
| Ag/AgCl electrode, pellet, 1.0 mm | Warner Instruments | 64-1309 | |
| Curved hemostatic forcep | various | – | |
| cyanoacrylate glue | LOCTITE/various | – | |
| Decapitation scissors | various | – | |
| Filter paper | various | – | |
| Glass capillaries (micropipette) | World Precision Instruments, Inc | TW150F-4 | |
| Iris scissors | Bonther equipamentos & Tecnologia/various | 65-66 | |
| Pasteur glass pipette | Sigma Aldrich/various | CLS7095B9-1000EA | |
| Petri dish | various | – | |
| Polyethylene tubing | Warner Instruments | 64-0756 | |
| Razor blade for brain dissection | TED PELLA | TEDP-121-1 | |
| Razor blade for the vibratome | TED PELLA | TEDP-121-9 | |
| Scissors | Bonther equipamentos & Tecnologia/various | 71-72, 48,49; | |
| silicone teat | various | – | |
| Slice Anchor | Warner Instruments | 64-0246 | |
| Syringe filters | Merck Millipore Ltda | SLGVR13SL | Millex-GV 0.22 μm |
| Tweezers | Bonther equipamentos & Tecnologia/various | 131, 1518 |
References
- Bezanilla, F. Single sodium channels from the squid giant axon. Biophysical Journal. 52 (6), 1087-1090 (1987).
- Clay, J. R. Potassium current in the squid giant axon. International Review of Neurobiology. 27, 363-384 (1985).
- Gandini, M. A., Sandoval, A., Felix, R. Patch-clamp recording of voltage-sensitive Ca2+ channels. Cold Spring Harbor Protocols. 2014 (4), 329-325 (2014).
- Hodgkin, A. L., Huxley, A. F. A quantitative description of membrane current and its application to conduction and excitation in nerve. The Journal of Physiology. 117 (4), 500-544 (1952).
- Perkins, K. L. Cell-attached voltage-clamp and current-clamp recording and stimulation techniques in brain slices. Journal of Neuroscience Methods. 154 (1-2), 1-18 (2006).
- Suk, H. J., Boyden, E. S., van Welie, I. Advances in the automation of whole-cell patch clamp technology. Journal of Neuroscience Methods. 326, 108357 (2019).
- Cole, K. S., Curtis, H. J. Electric impedance of the squid giant axon during activity. The Journal of General Physiology. 22 (5), 649-670 (1939).
- Bernstein, J. Ueber den zeitlichen Verlauf der negativen Schwankung des Nervenstroms. Pflüger, Archiv für die Gesammte Physiologie des Menschen und der Thiere. 1 (1), 173-207 (1868).
- Hamill, O. P., Marty, A., Neher, E., Sakmann, B., Sigworth, F. J. Improved patch-clamp techniques for high-resolution current recording from cells and cell-free membrane patches. Pflugers Archiv. 391 (2), 85-100 (1981).
- Hill, C. L., Stephens, G. J. An introduction to patch clamp recording. Methods in Molecular Biology. 2188, 1-19 (2021).
- Neher, E., Sakmann, B. Single-channel currents recorded from membrane of denervated frog muscle fibres. Nature. 260 (5554), 799-802 (1976).
- Sakmann, B., Neher, E. Patch clamp techniques for studying ionic channels in excitable membranes. Annual Review of Physiology. 46, 455-472 (1984).
- Gottsch, M. L., et al. A role for kisspeptins in the regulation of gonadotropin secretion in the mouse. Endocrinology. 145 (9), 4073-4077 (2004).
- Smith, J. T., Cunningham, M. J., Rissman, E. F., Clifton, D. K., Steiner, R. A. Regulation of Kiss1 gene expression in the brain of the female mouse. Endocrinology. 146 (9), 3686-3692 (2005).
- Smith, J. T., et al. Differential regulation of KiSS-1 mRNA expression by sex steroids in the brain of the male mouse. Endocrinology. 146 (7), 2976-2984 (2005).
- Ducret, E., Gaidamaka, G., Herbison, A. E. Electrical and morphological characteristics of anteroventral periventricular nucleus kisspeptin and other neurons in the female mouse. Endocrinology. 151 (5), 2223-2232 (2010).
- Qiu, J., Fang, Y., Bosch, M. A., Rønnekleiv, O. K., Kelly, M. J. Guinea pig kisspeptin neurons are depolarized by leptin via activation of TRPC channels. Endocrinology. 152 (4), 1503-1514 (2011).
- Gottsch, M. L., et al. Molecular properties of Kiss1 neurons in the arcuate nucleus of the mouse. Endocrinology. 152 (11), 4298-4309 (2011).
- de Croft, S., et al. Spontaneous kisspeptin neuron firing in the adult mouse reveals marked sex and brain region differences but no support for a direct role in negative feedback. Endocrinology. 153 (11), 5384-5393 (2012).
- Frazão, R., et al. Shift in Kiss1 cell activity requires estrogen receptor alpha. The Journal of Neuroscience. 33 (7), 2807-2820 (2013).
- DeFazio, R. A., Elias, C. F., Moenter, S. M. GABAergic transmission to kisspeptin neurons is differentially regulated by time of day and estradiol in female mice. The Journal of Neuroscience. 34 (49), 16296-16308 (2014).
- Mansano, N. D. S., et al. Vasoactive intestinal peptide exerts an excitatory effect on hypothalamic kisspeptin neurons during estrogen negative feedback. Molecular and Cellular Endocrinology. 542, 111532 (2022).
- Jamieson, B. B., Piet, R. Kisspeptin neuron electrophysiology: Intrinsic properties, hormonal modulation, and regulation of homeostatic circuits. Frontiers in Neuroendocrinology. 66, 101006 (2022).
- Silveira, M. A., et al. STAT5 signaling in kisspeptin cells regulates the timing of puberty. Molecular and Cellular Endocrinology. 448, 55-65 (2017).
- Silveira, M. A., et al. Acute effects of somatomammotropin hormones on neuronal components of the hypothalamic-pituitary-gonadal axis. Brain Research. 1714, 210-217 (2019).
- Cravo, R. M., et al. Leptin signaling in Kiss1 neurons arises after pubertal development. PLoS One. 8 (3), e58698 (2013).
- Manfredi-Lozano, M., et al. Defining a novel leptin-melanocortin-kisspeptin pathway involved in the metabolic control of puberty. Molecular Metabolism. 5 (10), 844-857 (2016).
- Qiu, J., et al. Insulin excites anorexigenic proopiomelanocortin neurons via activation of canonical transient receptor potential channels. Cell Metabolism. 19 (4), 682-693 (2014).
- de Croft, S., Boehm, U., Herbison, A. E. Neurokinin B activates arcuate kisspeptin neurons through multiple tachykinin receptors in the male mouse. Endocrinology. 154 (8), 2750-2760 (2013).
- Frazao, R., et al. Estradiol modulates Kiss1 neuronal response to ghrelin. American Journal of Physiology. Endocrinology and Metabolism. 306 (6), E606-E614 (2014).
- True, C., Verma, S., Grove, K. L., Smith, M. S. Cocaine- and amphetamine-regulated transcript is a potent stimulator of GnRH and kisspeptin cells and may contribute to negative energy balance-induced reproductive inhibition in females. Endocrinology. 154 (8), 2821-2832 (2013).
- Navarro, V. M., et al. Regulation of NKB pathways and their roles in the control of Kiss1 neurons in the arcuate nucleus of the male mouse. Endocrinology. 152 (11), 4265-4275 (2011).
- Segev, A., Garcia-Oscos, F., Kourrich, S. Whole-cell patch-clamp recordings in brain slices. Journal of Visualized Experiments. (112), e54024 (2016).
- Gibson, A. G., Jaime, J., Burger, L. L., Moenter, S. M. Prenatal androgen treatment does not alter the firing activity of hypothalamic arcuate kisspeptin neurons in female mice. eNeuro. 8 (5), (2021).
- Paxinos, G., Franklin, K. B. J. The Mouse Brain. Stereotaxic Coordinates. 2nd edition. , (2001).
- Cravo, R. M., et al. Characterization of Kiss1 neurons using transgenic mouse models. Neurosciences. 173, 37-56 (2011).
- Emane, M. N., Delouis, C., Kelly, P. A., Djiane, J. Evolution of prolactin and placental lactogen receptors in ewes during pregnancy and lactation. Endocrinology. 118 (2), 695-700 (1986).
- Fuh, G., Colosi, P., Wood, W. I., Wells, J. A. Mechanism-based design of prolactin receptor antagonists. The Journal of Biological Chemistry. 268 (8), 5376-5381 (1993).
- Barinaga, M. Ion channel research wins physiology Nobel. Science. 254 (5030), 380 (1991).
- Colquhoun, D. Neher and Sakmann win Nobel Prize for patch-clamp work. Trends in Pharmacological Sciences. 12 (12), 449 (1991).
- Greger, R. Nobel Prize for Medicine and Physiology 1991. Analysis of the function of single ion channel. Deutsche Medizinische Wochenschrift. 116 (48), 1849-1851 (1991).
- Brau, M. E., Vogel, W., Hempelmann, G. Possible applications of the "patch-clamp" method in anesthesiologic research; comment. Anasthesiologie, Intensivmedizin, Notfallmedizin, Schmerztherapie. 31 (9), 537-542 (1996).
- Cahalan, M., Neher, E. Patch clamp techniques: an overview. Methods in Enzymology. 207, 3-14 (1992).
- Kornreich, B. G. The patch clamp technique: principles and technical considerations. Journal of Veterinary Cardiology. 9 (1), 25-37 (2007).
- Neher, E., Sakmann, B. The patch clamp technique. Scientific American. 266 (3), 44-51 (1992).
- Sachs, F., Auerbach, A. Single-channel electrophysiology: use of the patch clamp. Methods in Enzymology. 103, 147-176 (1983).
- Dallas, M., Bell, D. . Patch Clamp Electrophysiology: Methods and Protocols. 1st edition. , (2021).
- Robinson, R. A., Stokes, R. H. . Electrolyte Solutions. 2nd edition. , (1959).
- de Souza, G. O., et al. Gap junctions regulate the activity of AgRP neurons and diet-induced obesity in male mice. The Journal of Endocrinology. 255 (2), 75-90 (2022).
- Houades, V., Koulakoff, A., Ezan, P., Seif, I., Giaume, C. Gap junction-mediated astrocytic networks in the mouse barrel cortex. The Journal of Neuroscience. 28 (20), 5207-5217 (2008).
- Richerson, G. B., Messer, C. Effect of composition of experimental solutions on neuronal survival during rat brain slicing. Experimental Neurology. 131 (1), 133-143 (1995).
- Pan, J. T., Li, C. S., Tang, K. C., Lin, J. Y. Low calcium/high magnesium medium increases activities of hypothalamic arcuate and suprachiasmatic neurons in brain tissue slices. Neuroscience Letters. 144 (1-2), 157-160 (1992).
- Hamill, O. P., McBride, D. W. Induced membrane hypo/hyper-mechanosensitivity: a limitation of patch-clamp recording. Annual Review of Physiology. 59, 621-631 (1997).
- Herbison, A. E., Moenter, S. M. Depolarising and hyperpolarising actions of GABA(A) receptor activation on gonadotrophin-releasing hormone neurones: towards an emerging consensus. Journal of Neuroendocrinology. 23 (7), 557-569 (2011).
- Qiu, J., et al. High-frequency stimulation-induced peptide release synchronizes arcuate kisspeptin neurons and excites GnRH neurons. eLife. 5, e16246 (2016).
- Chaves, F. M., Mansano, N. S., Frazão, R., Donato, J. Tumor necrosis factor α and interleukin-1β acutely inhibit AgRP neurons in the arcuate nucleus of the hypothalamus. International Journal of Molecular Sciences. 21 (23), 8928 (2020).
- Chaves, F. M., et al. Effects of the isolated and combined ablation of growth hormone and IGF-1 receptors in somatostatin neurons. Endocrinology. 163 (5), 045 (2022).
- Wasinski, F., et al. Growth hormone receptor in dopaminergic neurones regulates stress-induced prolactin release in male mice. Journal of Neuroendocrinology. 33 (3), e12957 (2021).
- Furigo, I. C., Ramos-Lobo, A. M., Frazao, R., Donato, J. Brain STAT5 signaling and behavioral control. Molecular and Cellular Endocrinology. 438, 70-76 (2016).
- Zampieri, T. T., et al. Postnatal overnutrition induces changes in synaptic transmission to leptin receptor-expressing neurons in the arcuate nucleus of female mice. Nutrients. 12 (8), 2425 (2020).
- Furigo, I. C., et al. Growth hormone regulates neuroendocrine responses to weight loss via AgRP neurons. Nature Communication. 10 (1), 662 (2019).
