Waiting
Traitement de la connexion…

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

Hypothalamus kisspeptin neuroner som et mål for helcelle patch-clamp optagelser

Published: March 17, 2023 doi: 10.3791/64989
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1Department of Anatomy, Instituto de Ciencias Biomedicas, Universidade de Sao Paulo

Summary

Her præsenterer vi en protokol til at udføre en helcelleplasterklemme på hjerneskiver indeholdende kisspeptinneuroner, den primære modulator af gonadotropinfrigivende hormonceller (GnRH). Ved at tilføje viden om kisspeptinneuronaktivitet har dette elektrofysiologiske værktøj tjent som grundlag for betydelige fremskridt inden for neuroendokrinologiområdet i løbet af de sidste 20 år.

Abstract

Kisspeptiner er afgørende for modningen af hypothalamus-hypofyse-gonadal (HPG) akse og frugtbarhed. Hypothalamus kisspeptinneuroner placeret i den anteroventrale periventrikulære kerne og rostrale periventrikulære kerne samt den bueformede kerne i hypothalamus projicerer til gonadotropinfrigivende hormon (GnRH) neuroner, blandt andre celler. Tidligere undersøgelser har vist, at kisspeptinsignalering sker gennem Kiss1-receptoren (Kiss1r), hvilket i sidste ende spændende GnRH-neuronaktivitet. I mennesker og eksperimentelle dyremodeller er kisspeptiner tilstrækkelige til at inducere GnRH-sekretion og følgelig luteiniserende hormon (LH) og follikelstimulerende hormon (FSH) frigivelse. Da kisspeptiner spiller en væsentlig rolle i reproduktive funktioner, arbejder forskere på at vurdere, hvordan den iboende aktivitet af hypothalamus kisspeptinneuroner bidrager til reproduktionsrelaterede handlinger og identificere de primære neurotransmittere / neuromodulatorer, der er i stand til at ændre disse egenskaber. Helcelle patch-clamp-teknikken er blevet et værdifuldt værktøj til at undersøge kisspeptinneuronaktivitet i gnaverceller. Denne eksperimentelle teknik giver forskere mulighed for at registrere og måle spontane excitatoriske og hæmmende ioniske strømme, hvilemembranpotentiale, handlingspotentiel fyring og andre elektrofysiologiske egenskaber ved cellemembraner. I denne undersøgelse gennemgås afgørende aspekter af helcelle-patch-clamp-teknikken, kendt som elektrofysiologiske målinger, der definerer hypothalamus kisspeptinneuroner, og en diskussion af relevante spørgsmål om teknikken.

Introduction

Hodgkin og Huxley lavede den første intracellulære registrering af et handlingspotentiale beskrevet i flere videnskabelige undersøgelser. Denne optagelse blev udført på blæksprutteaxonen, som har en stor diameter (~ 500 μm), hvilket gør det muligt at placere en mikroelektrode inde i axonen. Dette arbejde gav store muligheder for videnskabelig forskning, der senere kulminerede i oprettelsen af spændingsklemmetilstanden, som blev brugt til at studere det ioniske grundlag for handlingspotentialegenerering 1,2,3,4,5,6,7,8. I årenes løb er teknikken blevet forbedret, og den er blevet bredt anvendt i videnskabelig forskning 6,9. Opfindelsen af patch-clamp-teknikken, som fandt sted i slutningen af 1970'erne gennem undersøgelser initieret af Erwin Neher og Bert Sakmann, tillod forskere at registrere enkeltionkanaler og intracellulære membranpotentialer eller strømme i stort set alle typer celler ved hjælp af kun en enkelt elektrode 9,10,11,12 . Patch-clamp-optagelser kan foretages på en række vævspræparater, såsom dyrkede celler eller vævsskiver, enten i spændingsklemmetilstand (holder cellemembranen ved en indstillet spænding, der muliggør registrering af f.eks. spændingsafhængige strømme og synaptiske strømme) eller strømklemmetilstand (muliggør registrering af f.eks. ændringer i hvilemembranpotentiale induceret af ionstrømme. handlingspotentialer og postsynaptisk potentiel frekvens).

Brugen af patch-clamp-teknikken gjorde flere bemærkelsesværdige opdagelser mulige. Faktisk er de skelsættende fund om de elektrofysiologiske egenskaber af hypothalamus kisspeptinneuroner placeret ved de anteroventrale periventrikulære og rostrale periventrikulære kerner (AVPV / PeNKisspeptin), også kendt som det rostrale periventrikulære område af den tredje ventrikel (RP3V) og den bueformede kerne i hypothalamus (ARHkisspeptin)13,14,15 er af særlig interesse. I 2010 udførte Ducret et al. de første optagelser af AVPV/PeNKisspeptin-neuroneri mus ved hjælp af et andet elektrofysiologisk værktøj, loose-cell patch-clamp-teknikken. Disse undersøgelser gav en elektrisk beskrivelse af AVPV / PeNKisspeptin-neuroner og viste, at deres fyringsmønstre er østruscyklusafhængige16. I 2011 brugte Qiu et al. hele celleplasterklemmeteknikken til at demonstrere, at ARHkisspeptinneuroner udtrykker endogene pacemakerstrømme17. Efterfølgende viste Gottsch et al., at kisspeptinneuroner udviser spontan aktivitet og udtrykker både h-type (pacemaker) og T-type calciumstrømme, hvilket tyder på, at ARHkisspeptin-neuroner deler elektrofysiologiske egenskaber med andre pacemakerneuroner i centralnervesystemet18. Derudover er det blevet påvist, at ARHkisspeptinneuroner udviser seksuelt dimorfe affyringshastigheder, og at AVPV / PeNKisspeptin-neuroner udviser et bimodalt hvilemembranpotentiale (RMP) påvirket af ATP-følsomme kaliumkanaler (KATP)19,20. Desuden blev det fastslået, at gonadale steroider positivt påvirker den spontane elektriske aktivitet af kisspeptinneuronerne hos mus 19,20,21. De første værker, der studerer kisspeptinneuronernes elektrofysiologiske egenskaber, nævnes 16,17,18,19,20. Siden da har mange undersøgelser brugt helcelle-patch-clamp-teknikken til at demonstrere, hvilke faktorer / neuromodulatorer der er tilstrækkelige til at modulere den elektriske aktivitet af kisspeptinneuroner (figur 1)17,21,22,23,24,25,26,27,28,29,30,31,32.

I betragtning af vigtigheden af denne teknik til undersøgelse af neuroner, der er nødvendige for reproduktion, blandt andre celletyper, der ikke er dækket her, beskriver denne artikel de grundlæggende trin til udvikling af helcelle-patch-clamp-teknikken, såsom forberedelse af opløsningerne, dissekering og skæring af hjernen og udførelse af cellemembranens forsegling til optagelser. Desuden diskuteres relevante spørgsmål om teknikken, såsom dens fordele, tekniske begrænsninger og vigtige variabler, der skal kontrolleres for optimal eksperimentel ydeevne.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alle dyreforsøg blev godkendt af Institute of Biomedical Sciences Animals Ethics Committee ved University of São Paulo og blev udført i henhold til de etiske retningslinjer, der blev vedtaget af Brazilian College of Animal Experimentation.

1. Fremstilling af opløsninger

  1. Fremstilling af intern opløsning
    BEMÆRK: Den interne opløsning fylder plasterklemmemikropipetten og kommer i kontakt med cellens indre (se et eksempel i figur 2). Interne løsninger kan variere afhængigt af den type aktivitet, der skal måles33.
    1. Vælg den interne løsning i betragtning af dens eksperimentelle formål og den passende posttype. For at registrere membranpotentiale i strømklemmetilstand skal du bruge den interne opløsning sammensat af 120 mM K-gluconat, 1 mM NaCl, 5 mM EGTA, 10 mM HEPES, 1 mM MgCl 2, 1 mM CaCl2, 3 mM KOH, 10 mM KCl og 4 mM (Mg)-ATP. Alle salte afvejes i henhold til det ønskede slutvolumen, jf. tabel 1.
    2. Brug nok deioniseret vand til at nå 90% af opløsningens endelige volumen. Dette volumen sikrer plads nok til at justere pH og osmolaritet.
    3. Efter tilsætning og blanding af alle ingredienserne grundigt justeres pH til 7,2-7,3 med 5 M KOH ved hjælp af en pH-meter. Brug et osmometer til at kontrollere osmolariteten, som skal være omkring 275-280 mOsm (juster om nødvendigt kun ned).
    4. Forbered den interne opløsning på forhånd og opbevar ved 8 °C. Tilføj ATP på dagen for eksperimentet. Den ATP-holdige interne opløsning opbevares ved -20 °C (1 ml alikvoter) i 3-4 måneder.
  2. Fremstilling af skiveopløsning
    1. Der fremstilles skiveopløsning indeholdende 238 mM saccharose, 2,5 mM KCl, 26 mM NaHCO3, 1,0 mMNaH2PO4, 10 mM glucose, 1,0 mM CaCl2 og 5,0 mMMgCl2. Alle salte afvejes i henhold til det ønskede slutvolumen, som vist i tabel 2. Det nøjagtige volumen af denne opløsning, der skal fremstilles, afhænger af skærekammerets størrelse.
    2. Mens du blander alle salte i deioniseret vand, mættes konstant med carbogen (95%O2 og 5% CO2). Fastgør polyethylenrør (1,57 mm udvendig diameter [OD] x 1,14 mm indvendig diameter [ID]) til en carbogen-cylinder for at levere carbogen til udskæringsopløsningen. Hold rørets åbne ende inde i bægerglasset med skiveopløsningen.
    3. Efter at have blandet alle ingredienserne godt, justeres pH til 7,3 med 10% salpetersyre ved hjælp af en pH-meter. Brug et osmometer til at kontrollere osmolariteten, som skal være 290-295 mOsm (juster om nødvendigt kun ned). Derefter afkøles opløsningen til 0-2 °C.
  3. Forbered aCSF-løsning til optagelser
    1. Forbered kunstig cerebrospinal spinalvæske (aCSF) opløsning til optagelser indeholdende 124 mM NaCl, 2,8 mM KCl, 26 mM NaHCO3, 1,25 mM NaH 2 PO 4, 1,2 mM MgSO4, 5 mM glucose og 2,5 mM CaCl2. Alle salte afvejes i henhold til det ønskede slutvolumen, der er angivet i tabel 3.
    2. Under blanding af alle salte i deioniseret vand mættes konstant med carbogen (95%O2 og 5% CO 2) som beskrevet i trin 1.2.2.
    3. Efter tilsætning og blanding af alle ingredienserne justeres pH til 7,3 (10% salpetersyre kan anvendes) ved hjælp af en pH-meter. Brug et osmometer til at kontrollere osmolariteten, som skal være 290-300 mOsm. Derefter hældes aCSF i et bægerglas og opbevares i vandbad ved 30 °C.

2. Hjernedissektion og udskæring

BEMÆRK: Da forskellige hjernestrukturer kan kræve skæring i forskellige planer (koronale, sagittale eller vandrette skiver), afhænger den nøjagtige tilgang til opnåelse af skiverne af hjerneområdet af interesse. Typisk for at studere de Kiss1-ekspressive celler i AVPV / PeN og ARH (her denomineret som AVPV / PeN Kisspeptin neuroner og ARHkisspeptin neuroner; Figur 2A, B), koronale hjerneskiver (200-300 μm) fremstilles normalt 17,19,20,21,34. AVPV / PeN Kisspeptin-neuronerne er placeret ca. 0,5 til -0,22 mm fra bregma, mens ARHkisspeptin-neuroner er ved -1,22 til -2,70 mm. Kernens placering kan bestemmes ved hjælp af et stereotaxisk musehjerneatlas35 eller Allen Mouse Brain Reference Atlas (http://mouse.brain-map.org/). Voksne Kiss1-Cre/GFP hunmus (diestrus-stadiet) og hanmus36 blev anvendt i dette studie.

  1. Fjernelse af hjernen
    1. Forbered dissektionsstedet og de nødvendige værktøjer til at udtrække hjernen: halshugningssaks, irissaks, Castroviejo-buet saks, osteotom, pincet, spatel, filterpapir, petriskål, barberblad og cyanoacrylatlim.
    2. Før du laver skiverne, skal du forberede bænken, som dissektionen skal udføres på, da alle efterfølgende procedurer skal udføres hurtigt. Sørg for at have adgang til en udskæringsenhed, såsom et vibratom.
    3. Forbered et optagekammer for at opretholde hjerneskiverne, før vævet skæres i skiver. Anskaf et optagekammer, baddimensioner på 24 mm x 15 mm x 2 mm (L x B x H), fra et kommercielt mærke (materialebord) eller lav et internt.
      BEMÆRK: Et internt genvindingskammer kan fremstilles som følger: Skær en 24-brønds plade, så ni brønde er tilgængelige. Lim en nylonskærm til bunden af de ni brønde. Med resten af brøndpladen laves en base, så den nederste del af nylon er fri. Denne tilpassede base kan placeres inde i et 500 ml bægerglas, der indeholder aCSF (supplerende figur 1).
    4. Efter tilberedning af alt bedøves dyret med inhaleret bedøvelsesmiddel ved hjælp af 4% -5% isofluran. Anæstesien skal være i overensstemmelse med en protokol godkendt af den etiske komité. Kort efter at dyret er immobilt, skal du udføre hale- og poteklemmetest for at sikre, at dyret er dybt bedøvet.
    5. Halshug hurtigt musene, mens hjertet stadig er aktivt for at øge cellelevedygtigheden. Høst hjernen hurtigt efter halshugning.
    6. Med kirurgisk saks skal du lave et snit i huden øverst på dyrets kranium, fra kaudal til rostral, og fjerne hovedbunden fra dyrets hoved. Skær derefter den interparietale plade langs sagittal sutur med irissaksen og fjern occipitalbenet. Skub osteotomet under parietalbenet og træk det forsigtigt ud, indtil hjernen er udsat.
    7. Når du har udsat hjernen, skal du vende hovedet på hovedet, forsigtigt sænke hjernen for at visualisere trigeminusnerven på hver side og derefter klippe trigeminusnerven ved hjælp af Castroviejos buede saks. Efter visualisering af hypothalamus skal du identificere synsnerven og skære den forsigtigt.
      BEMÆRK: Vær forsigtig, når du skærer synsnerven, da træk i den vil rive det tilstødende hypothalamus område, der indeholder AVPV / PeN-kernen.
    8. Skær den forreste del af frontallappen og fjern hjernen helt. Sænk straks hjernen i skiveopløsningen, indtil skiverne erhverves.
  2. Skæring af hjerneprøver
    1. Placer hjernen på filterpapir (understøttet på en petriskål) for at tørre overskydende opløsning. Udfør derefter et koronalt snit, der adskiller hjernestammen med lillehjernen fra resten af vævet, med et skarpt skærebarberblad.
    2. Lim derefter den kaudale del af hjernen på bunden af vibratomet, og fyld skiveindretningens kammer med udskærings-/aCSF-opløsningen afkølet til 0-2 °C. Under proceduren pakkes tøris omkring vibratomkammeret for at holde skiveopløsningen kold.
    3. Indsæt barberbladet i vibratomet, og indstil enhedens passende skæreparametre: hastighed = 3, frekvens = 9 og feed = 250 μm. Brug en akryloverførselspipette (omvendt Pasteur-glaspipette fastgjort til en silikonesut) til at overføre skiverne til genvindingskammeret (beskrevet i trin 2.1.3) under vævsudskæringsproceduren. Vent 60 minutter på vævsgendannelse efter skiveopsamling.

3. Celleforsegling til optagelse

  1. Sørg for, at alt udstyr (mikroskop, forstærker, digitizer, mikromanipulator og andre) er tændt, før optagelsen påbegyndes.
  2. Fyld optagekammeret fra et kommercielt mærke (materialefortegnelse), der er fastgjort til mikroskopet, med aCSF-løsningen til optagelser. Brug en perfusionspumpe til konstant at perfusere aCSF med en hastighed på 2 ml / min.
  3. Overfør et hjernestykke af interesse (en ad gangen) til optagelseskammeret. Brug en akryloverførselspipette (omvendt Pasteur-glaspipette fastgjort til en silikonesut) til at overføre hypothalamusskiverne til kammeret. Brug et udsnitsanker (Tabel over materialer) til at holde udsnittet, så det ikke bevæger sig under aCSF-perfusionen.
  4. Placer en skive i midten af optagekammeret, der er fastgjort til mikroskopet. Udsnitspositionen er afgørende for at give et godt overblik over det ønskede område under mikroskopet og for en perfekt rækkevidde af optagemikropipetten.
  5. Brug et nedsænkningsmikroskops objektivlinse med lav effekt (10x eller 20x) til at hjælpe med at placere skiven og lokalisere interesseområdet.
  6. Når du har lokaliseret interesseområdet, skal du skifte objektivlinsen til højeffektlinsen (63x) og fokusere på vævsniveauet og observere det endogene fluorescerende protein og cellernes former i målområdet for at lokalisere kisspeptincellerne på overfladen af hjerneskiven20.
  7. Når en mulig målcelle er placeret, skal du markere den på computerskærmen med musemarkøren eller ved at tegne et format, som en firkant, over interesseområdet. Computerskærmmærket hjælper med at guide optagemikropipettens position til cellen.
  8. Når du har bestemt den nøjagtige placering af målcellen, løft målet og introducer optagelsesmikropipetten fyldt med den interne opløsning. Når du placerer mikropipetten i elektrodeholderen, skal du sikre dig, at den interne opløsning er i kontakt med sølvelektroden.
    BEMÆRK: For forberedelse, placering og placering af mikropipetter på elektrodeholderen henvises til33.
  9. Påfør positivt tryk, før mikropipetten nedsænkes i aCSF-opløsningen, for at forhindre snavs i at trænge ind i mikropipetten ved hjælp af en 1-3 ml luftfyldt sprøjte, der er forbundet til mikropipetteholderen gennem en polyethylenslange (≈130 cm længere); påfør næsten 100-200 μL luft.
  10. Brug mikromanipulatoren til at styre mikropipetten under midten af målet. Flyt knapperne på mikromanipulatoren for at lede mikropipetten på X-Y-Z-aksen mod den relevante celle.
  11. Juster fokus for at se spidsen af mikropipetten, og bring fokus tættere på, men ikke for tæt på skiven. Reducer mikromanipulatorens hastighed og sænk langsomt mikropipetten til fokusplanet. Sørg for, at mikropipettespidsen ikke pludselig trænger ind i skiven, men snarere langsomt falder ned, indtil den berører overfladen af cellen/målområdet.
  12. Påfør let overtryk (≈100 μL) med den 1-3 ml luftfyldte sprøjte, der er fastgjort til mikropipetteholderen, for at fjerne snavs fra indflyvningsvejen.
  13. Fokuser på målcellen, og flyt langsomt mikromanipulatoren på X-Y-Z-aksen for at bringe mikropipetten tættere på målcellen. Når mikropipetten berøres til cellen, observeres en fordybning forårsaget af det tryk, der påføres gennem mikropipettespidsen (figur 2C).
  14. Efter dannelse af fordybningen påføres på grund af mikropipettens nærhed til cellen svag, kort sugning gennem munden (1-2 s) gennem røret, der er forbundet med mikropipetteholderen, for at generere forseglingen mellem mikropipetten til cellen (gigaohm forsegling eller gigaseal >1 GΩ; Figur 2D). For at danne tætningen skal du bruge spændingsklemmetilstanden på softwaren. For detaljer om tætningsdannelse henvises til33.
  15. Hvis tætningen forbliver stabil (gigaohm tætningen skal være mekanisk stabil og uden støjinterferens, bestemt ved observation i ca. 1 min), indstilles holdespændingen til det nærmeste fysiologiske hvilepotentiale i den pågældende celle. For kisspeptin hypothalamus neuroner, -50 mV anbefales.
  16. Der suges kortvarigt gennem munden (undertryk) med mikropipetten forseglet til cellen for at bryde plasmamembranen (figur 2E). Tilstrækkelig helcellekonfiguration opnås, når sugningen udføres med tilstrækkelig kraft, således at den bristede membran ikke tilstopper mikropipetten og ikke tiltrækker en betydelig del af membranen eller endda cellen.
  17. Kontroller den anvendte systemindstillingsmanual. Brug softwaren (se materialetabellen) til digitalt at kontrollere og beregne seriemodstanden (SR) og helcellekapacitansen (wcc).
  18. I spændingsklemmetilstand, efter at have brudt cellemembranen, skal du aktivere hele celleindstillingen og klikke på Auto-kommandoen, der henviser til hele cellefanen. Cellens SR og wcc beregnes automatisk og vises øjeblikkeligt af softwaren. Disse parametre kan også kontrolleres ved at udføre membrantesten med forstærkeren nævnt i materialetabellen33.
  19. Sørg for at kontrollere cellelevedygtighedsparametre. For kisspeptinneuroner skal du kontrollere, at de elektrofysiologiske målinger er: SR < 25 mΩ, indgangsmodstand > 0,3 GΩ og holder den aktuelle absolutte værdi < 30 pA (personlige observationer og reference21). Middelværdien af wcc af AVPV/PeN Kisspeptin eller ARHkisspeptin neuroner er ≈ 10-12 pF i gonadeintakte mus20.
  20. Overvåg SR og cellens steady-state kapacitans under eksperimenterne. Sørg for, at SR ikke ændres mere end 20% under en optagelse, og at membrankapacitansen er stabil.
  21. Kontroller softwareindstillingerne. Opret specifikke protokoller til optagelserne i henhold til typen af eksperiment. For at registrere membranpotentiale i strømklemmetilstand med udstyr, der er nævnt i materialetabellen, skal lavpasfiltrering af de elektrofysiologiske signaler ved 2-4 kHz og analysere resultater offline i en software (se materialetabellen for softwareinformation).
  22. Når helcellekonfigurationen er opnået korrekt, måles synaptiske strømme i spændingsklemmetilstand (figur 2G). Registrer ændringer i hvilemembranpotentiale (RMP) og inducerede RMP-variationer i strømklemmetilstand (figur 2H). Ændringer i RMP, såsom depolarisering af cellemembranen, kan induceres ved at administrere et kendt lægemiddel / neurotransmitter til badet (beskrevet i trin 3.2), som illustreret i figur 1.
    BEMÆRK: I strømklemmetilstand kan positiv eller negativ strøm injiceres for at holde membranspændingen på en ønsket spænding. For kisspeptinneuroner indstiller vi normalt nulstrømsinjektion (I = 0) for at registrere den spontane variation af membranpotentialet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

For at undersøge de mulige virkninger af humant rekombinant væksthormon (hGH) på aktiviteten af hypothalamus kisspeptinneuroner udførte vi helcelle-patch-clamp-optagelser i hjerneskiver og vurderede, om dette hormon forårsager akutte ændringer i aktiviteten af AVPV / PeN Kisspeptin og ARHkisspeptin neuroner. Voksne Kiss1-Cre/GFP hunmus (diestrus-stadiet) og hanmus36 blev anvendt i dette studie. Gonad-intakte dyr blev udvalgt til forsøgene, da egenskaberne af deres hypothalamus kisspeptinneuroner kan variere afhængigt af kønssteroidniveauer19,20. Selvom det lå uden for rammerne af denne undersøgelse at evaluere forskelle mellem køn, henviser vi læseren til Croft et al. og Frazão et al.19,20 for mere information. Genmodificerede dyr, såsom mus og rotter, repræsenterer spændende værktøjer til denne type forsøg, da celler, der udtrykker et specifikt gen eller en selektiv induceret ablation, kan identificeres ved et fluorescerende protein såsom GFP, blandt andet23,26,36. Brugen af genetisk modificerede mus repræsenterer et gennembrud i forståelsen af kisspeptinneuronaktivitet.

Registrerede neuroner (26 celler ud af 12 dyr) blev bestemt i henhold til neuroanatomiske træk35 og ekspressionen af den endogene GFP20. I strømklemmetilstand blev neuroner registreret under I = 0 i helcelle-patch-clamp-konfiguration. AVPV / PeNKisspeptin-neuronerne (12 celler fra ni dyr) udviste en gennemsnitlig RMP på -59,0 mV ± 3,0 mV (område: -75 mV til -46 mV), indgangsmodstand på 0,9 ± 0,1 GΩ, wcc på 12,3 pF ± 1,6 pF og SR på 19,4 ± 1,9 mΩ. Blandt de registrerede neuroner viste tre ud af 12 AVPV/PeNKisspeptin-celler spontane udladninger af aktionspotentialer (AP'er) i hvile (0,1 Hz ± 0,06 Hz; gennemsnitlig RMP for de spontant aktive celler var -50,7 mV ± 2,7 mV). Den gennemsnitlige RMP af ARHkisspeptinneuroner (14 celler fra 12 dyr) var -50,0 mV ± 1,5 mV (område: -62 mV til -39 mV), den gennemsnitlige indgangsmodstand var 1,7 ± 0,1 GΩ, wcc var 9,2 pF ± 0,7 pF og SR på 16,9 ± 1,7 mΩ. De fleste ARHkisspeptinneuroner var hvilende, mens fire ud af 14 celler viste spontane AP'er i hvile (0,9 Hz ± 0,5 Hz; gennemsnitlig RMP for de spontant aktive celler var -52,7 mV ± 1,4 mV).

Administration af hGH (20 μg / g) til badet inducerede en signifikant hyperpolarisering af RMP af mange af de registrerede neuroner, fem ud af 12 AVPV / PeNKisspeptin-neuroner (≈55% af cellerne fra 9 mus) og ni ud af 14 registrerede ARHkisspeptinneuroner (≈65% af cellerne fra 12 mus, p = 0,0006, Fishers nøjagtige test; Figur 3). AVPV / PeN Kisspeptin og ARHkisspeptin hyperpolariserede neuroner ændrede signifikant RMP sammenlignet med de ikke-reagerende celler (figur 3B, E; Mann-Whitney-testen). Virkningerne på RMP (figur 3C, F; gentagne målinger ANOVA og Tukeys post-test) blev efterfulgt af en signifikant reduktion af helcelleindgangsmodstanden (IR) på AVPV / PeNKisspeptin (0,9 ± 0,1 GΩ til 0,7 ± 0,1 GΩ under hGH-applikation, p = 0,02; Figur 3D) og på ARHkisspeptin (1,7 ± 0,1 GΩ til 1,0 ± 0,1 GΩ under hGH-applikation, p < 0,0001; gentagne foranstaltninger ANOVA og Tukeys post-test; Figur 3G) Neuroner. Derudover faldt frekvensen af spontane AP'er (fAP'er) af hGH-hyperpolariserede neuroner i begge populationer af celler (0,1 Hz ± 0,06 Hz til 0,0 Hz ± 0,0 Hz i AVPV / PeNKisspeptin og 1,0 Hz ± 0,5 Hz til 0,2 Hz ± 0,1 Hz i ARHkisspeptinneuroner). Omfanget af dette fald nåede imidlertid ikke et niveau af statistisk signifikans (p > 0,05, Mann-Whitney-testen). Efter hGH-udvaskningen blev RMP og IR gendannet til baseline (figur 3A, C, D, F, G). De resterende kisspeptinneuroner reagerede ikke på administration af hGH.

Vi har tidligere vist, at pGH ikke inducerer nogen effekt på hypothalamus kisspeptin neuron aktivitet (se Silveira et al.25; Figur 3H). Bemærk, Det er kendt, at hGH kan aktivere prolaktin (PRL) receptorer ud over GH-receptorer37,38. Desuden depolariserer PRL indirekte kun ≈20% af AVPV / PeNKisspeptin-neuroner hos mus24. I modsætning hertil modulerer PRL ikke den hurtige synaptiske transmission af ARHkisspeptincellerne 24. Derfor synes den hGH-inducerede hyperpolariseringseffekt, der rapporteres her, at være uspecifik. De observerede forskelle kan afhænge af variabler såsom lægemiddelkoncentration, artsforskel (menneske vs. mus) eller endda tilstedeværelsen af salte i sammensætningen af de anvendte lægemidler, som tidligere rapporteret28.

Figure 1
Figur 1: Skematisk diagram, der opsummerer helcelle-patch-clamp-teknikkens bidrag til viden om kisspeptinneuronernes aktivitet. Kisspeptinneuroner (vist med grønt) er placeret i de anteroventrale periventrikulære og rostrale periventrikulære kerner (AVPV / PeN) og bueformede kerne i hypothalamus (ARH). AVPV / PeNKisspeptin- og ARH-kisspeptincellerne sender direkte forbindelser til gonadotropinfrigivende hormon (GnRH) neuronernes soma placeret i det præoptiske område (POA) og deres terminaler ved median eminence (ME), der kulminerer i moduleringen af hypothalamus-hypofyse-aksen (HPG). Forskellige neuromodulatorer, såsom hormoner, har vist sig at differentiere aktiviteten af AVPV / PeN Kisspeptin og ARHkisspeptin neuroner. Mulige virkninger på hvilemembranpotentialet påvises skematisk ved repræsentative sporinger opnået ved hjælp af helcellebane-klemme-teknikken og strømklemmeoptagelser. Den røde farve indikerer, at en specifik neurotransmitter inducerer depolarisering af hvilemembranpotentialet (RMP)17,22,24,26,28,29,30,31,32; den blå farve angiver ingen effekt på RMP 24,25,26,27,30. Den stiplede linje angiver RMP. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 2
Figur 2: Grundlæggende trin for at opnå forsegling af den relevante celle ved hjælp af helcelle-patch-clamp-teknikken. (A,B) Repræsentative fotomikrografier af hjerneskiver (250 μm) indeholdende kisspeptinceller ved den anteroventrale periventrikulære kerne (AVPV) og bueformede kerne i hypothalamus (ARH). Kisspeptinneuroner blev identificeret ved ekspression af grønt fluorescerende protein (GFP). (C) Fotomikrografi, der viser en mikropipette (indeholdende elektrolytopløsning [intern opløsning]) tæt nok på cellen til at skabe en fordybning i plasmamembranen til at udføre forseglingen. (D,E) Let undertryk (mundsugning udført på et rør, der er fastgjort til hovedscenen og mikropipetten) er påkrævet for at forsegle cellemembranen til mikropipetten (D). En anden anvendelse af undertryk (mild og kort) er nødvendig for at inducere plasmamembranbrud (E). (F) Registreringen af celleaktiviteten udføres ved hjælp af en mekanisk opsætning, der anvendes til patch-clamp-eksperimenter. Efter at have brudt plasmamembranen kan strømme, der strømmer gennem de ioniske kanaler i den lappede celle, registreres af en elektrode forbundet til en meget følsom forstærker. En feedbackmodstand genererer den strøm, der er nødvendig til spændingsklemme (G) eller strømklemme (H) optagelser. Forkortelser: 3V = tredje ventrikel; ME = median eminens. Skalastænger: A = 130 μm, B = 145 μm, C = 20 μm, D = 15 μm. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 3
Figur 3: Test af lægemiddelspecificitet. (A) Repræsentativ strømklemmeoptagelse, der viser, at humant rekombinant væksthormon (hGH) inducerede en hyperpolarisering af hvilemembranpotentialet (RMP) af kisspeptinneuronerne placeret ved hypothalamusens bueformede kerne (ARHkisspeptin). (B-G) Søjlediagrammer, der viser den gennemsnitlige ændring i hvilemembranpotentialet (RMP) (B, C, E, F) og den gennemsnitlige indgangsmodstand (IR) (D, G) af hGH-responsive kisspeptinneuroner placeret ved de anteroventrale periventrikulære og rostrale periventrikulære kerner (AVPV / PeNKisspeptin) (B-D) eller ARH (E-G). Repræsentativ strømklemmeoptagelse, der viser, at svinevæksthormon (pGH) ikke inducerede nogen effekt på RMP af ARHkisspeptinneuroner, som tidligere rapporteret25 (H). De anvendte signifikanstest er Mann-Whitney-testen for (B) og (E) og gentagne målinger ANOVA og Tukeys post-test for (C, D, F, G). Den stiplede linje angiver RMP. *p = 0,02; **p = 0,004,***p = 0,0003; p < 0,0001. Klik her for at se en større version af denne figur.

Intern opløsning (100 ml)
Salt FW (g/mol) Koncentration Vægt (g)
K-gluconat 234.2 120 mM 2.81
NaCl 58.4 1,0 mM 0.006
KCl 74.5 10 mM 0.074
HEPES 238.3 10 mM 0.24
EGTA 380.3 5,0 mM 0.19
CaCl2 Annoncer 147.0 1,0 mM 0.015
MgCl2 203.0 1,0 mM 0.02
KOH 56.11 3,0 mM 0.017
ATP 507.18 4,0 mM 0.20
pH = 7,3 / osmolaritet = 275 - 280 mOsm

Tabel 1: Reagenser til fremstilling af den interne opløsning. Tabellen indeholder molekylvægten (FW), ønskede koncentrationer og den beregnede vægt af saltene til fremstilling af 100 ml opløsning.

aCSF/skiveløsning (250 ml)
Salt FW Koncentration Vægt (g)
Saccharose 342.3 238 mM 18.5
KCL 74.5 2,5 mM 0.046
NaHCO3 84.0 26 mM 0.546
NaH2PO4 120.0 1,0 mM 0.03
MgCl2 203.0 5 mM 0.254
D-glukose 180.2 10 mM 0.450
CaCl2 Annoncer 147.0 1,0 mM 0.037
pH = 7,3 / osmolaritet = 290 - 295 mOsm

Tabel 2: Reagenser til fremstilling af udskæringsopløsningen. Tabellen indeholder molekylvægten (FW), ønskede koncentrationer og beregnet vægt af saltene til fremstilling af 250 ml opløsning. Hjernen er nedsænket i denne opløsning, der skal skæres.

aCSF til optagelse (1 L)
Salt FW Koncentration Vægt (g)
NaCl 58.4 135 mM 7.88
KCL 74.5 3,5 mM 0.261
NaHCO3 84.0 26 mM 2,184
NaH2PO4 120.0 1,25 mM 0.150
MgSO4 246.5 1,2 mM 0.296
D-glukose 180.2 10 mM 1,802
CaCl2 Annoncer 147.0 1,0 mM 0.148
pH = 7,3 / osmolaritet = 290-300 mOsm

Tabel 3: Reagenser til forberedelse af en CSF til optagelser. Tabellen indeholder molekylvægten (FW), ønskede koncentrationer og beregnet vægt af saltene til fremstilling af 1 liter opløsning.

Supplerende figur 1: Eksempel på et internt fremstillet genvindingskammer. (A,B) Et internt genvindingskammer kan fremstilles som følger: Skær en 24-brønds plade, så ni brønde er tilgængelige. Lim en nylonskærm til bunden af de ni brønde. Med resten af brøndpladen laves en base, så den nederste del af nylon er fri. (C) Denne tilpassede base kan placeres inde i et 500 ml bægerglas indeholdende kunstig cerebrospinalspinalvæske (aCSF), der konstant er mættet med carbogen (95% O2 og 5% CO2). D) Bægerglasset, der holder genvindingskammeret, opbevares i vandbadet under forsøgene. (E,F) En akryloverførselspipette bruges til at overføre hjerneskiverne til genopretningskammeret. Klik her for at downloade denne fil.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Udviklingen af helcelle-patch-clamp-teknikken havde en betydelig indvirkning på det videnskabelige samfund, idet den blev betragtet som af afgørende betydning for udviklingen af videnskabelig forskning og muliggørelsen af flere opdagelser. Dens indvirkning på videnskaben var nok til at kulminere i Nobelprisen i medicin i 1991, da denne opdagelse åbnede døren til en bedre forståelse af, hvordan ionkanaler fungerer under fysiologiske og patologiske tilstande samt identifikation af potentielle mål for terapeutiske midler 11,39,40,41. Inden for medicin var et af de fremragende resultater, der blev gjort ved hjælp af denne teknik, at flere stoffer, der anvendes klinisk, interagerer direkte med ionkanaler (f.eks. lokalbedøvelsesmidler, antiarytmika, antidiabetika og muskelafslappende midler)42. Derfor er dens anvendelighed tydelig i kliniske institutter og grundforskningsafdelinger. Denne artikel beskriver protokollen for det grundlæggende præparat til at udføre helcelle patch-clamp eksperimenter på hjerneskiver indeholdende hypothalamus kisspeptin neuroner. Vi skitserer de grundlæggende trin og fremhæver bemærkelsesværdige parametre, der skal kontrolleres for at opnå væv og forberede løsninger til patch-clamp-teknikken. Denne artikel kan imidlertid ikke fuldt ud beskrive kompleksiteten af denne teknik og de mekanismer, der er involveret i hver type optagelse, især analysen. For yderligere teoretisk læring anbefales nogle bøger og anmeldelser om patch-clamp-teknikken 10,43,44,45,46.

Hver løsning, der anvendes i patch-clamp-metoden, har et specifikt formål; Derfor skal dets specifikke sammensætninger og kriterier vedtages strengt under forberedelsen. For eksempel bør den interne opløsnings sammensætning bestemmes i henhold til eksperimentets mål, da det varierer afhængigt af den type strøm, der skal måles. Den kloridbaserede opløsning, der er nævnt her, hvor Cl- (15 mM) efterligner den fysiologiske koncentration af cellecytoplasma47, anvendes til at studere aktive og passive neuronale egenskaber eller reaktioner på synaptisk input. Det er vigtigt at understrege, at chloridindholdet i den interne opløsning holder chloridligevægtspotentialet på optimale niveauer for celleoptagelse (i den nævnte opløsning ECL er det ca. -59 mV). Den intracellulære chloridkoncentration kan estimeres ved at evaluere reverseringspotentialet for GABA-induceret strøm (EGABA), forudsat at al strøm gennem GABA A-receptoren bæres af Cl-21,48. Til undersøgelse af hypothalamus kisspeptinneuroner skal man overveje, at den intracellulære Cl-koncentration for ARHkisspeptin er højere end for AVPV / PeNKisspeptin-celler 21. Denne egenskab skal overvejes ved planlægning af et eksperiment. Osmolariteten af den interne opløsning anbefales at være mindst 5% lavere end for aCSF til optagelser for at undgå tab af forsegling på grund af mulig hævelse og / eller cellesvækkelse33,47. Hvis der er behov for at tilføje en intracellulær forbindelse, der yderligere kan anvendes som cellemarkør til den interne opløsning, såsom biocytin eller et intracellulært farvestof (f.eks. Alexa Fluor 594), kan K + -niveauer reduceres, så osmolariteten konstant kan opretholdes 20,47,49,50.

Det er afgørende at udføre en hurtig hjernedissektion og opretholde en lav temperatur (0-2 °C) under udskæring med en passende udskæringsopløsning. Udskæringsopløsningerne kan variere alt efter celletype og/eller hjerneområde, der evalueres 33,47. Den aCSF-opløsning, der bruges til at opnå hjerneskiverne (dvs. udskæringsopløsning), har normalt en anden sammensætning end aCSF til optagelser (til sammenligning, se tabel 2 og tabel 3). Kationkoncentrationerne (Ca 2+ og Mg2+) kan justeres for at ændre neuronernes excitabilitet, hvilket også kan påvirke affyringstærsklen og neurotransmitterfrigivelsen47. Medier med lav Ca 2+ og høj Mg2+ anvendes i vid udstrækning til minimering af mulige excitotoksiske processer (for mere information, se51). Derudover kan lave Ca 2+ og høje Mg2+ medier stimulere hypothalamus neuronaktivitet52. Med hensyn til aCSF for optagelser er nogle egenskaber ens. Buffersystemet er baseret på NaHCO3, høje NaCl-koncentrationer (generelt >100 mM) og lave KCl-koncentrationer (generelt <5 mM), relative koncentrationer af Ca 2+ og Mg2+ (2: 1 bruges ofte) er normalt omkring 2 mM, og glukoseniveauer kan variere fra 1 til 10 mM47. Ud over variationer i opløsningernes osmolaritet, pH eller temperaturændringer (digitalt styret til at være mellem 30-32 °C) er det vigtigt at fremhæve, at der kan opstå andre problemer under forsøgsprotokollen, som i væsentlig grad forstyrrer forsøget. Elektrofysiologiske målinger skal være stabile under optagelserne, og eventuelle variationer skal have en kritisk aflæsning. For eksempel tager SR-ændringer højde for cellulær adgang i helcelletilstand og har betydelige konsekvenser for målte strømme og potentialer. Desuden er det vigtigt at understrege, at en relevant begrænsning relateret til patch-clamp-metoden, der skal overvejes, er mekanisk overstimulering af cellen ved overdreven sugning / trykprotokoller, der kan fremkalde morfologiske og funktionelle ændringer53. Denne bias er ofte vanskelig at kontrollere i protokoller, hvor sugning udføres gennem munden snarere end en enhed, der præcist kan kontrollere den anvendte sugeintensitet. Derudover kan vævsrelaterede problemer, der kulminerer med en høj procentdel af celledødelighed, forekomme på grund af utilstrækkelig dissektion, hypoxi eller musens helbredstilstand, som en forsker ikke kan identificere ved observation.

Den største fordel ved helcelle-patch-clamp-teknikken er evnen til at registrere neuroner i specifikke hjerneområder af interesse præcist. Denne teknik har haft enorm gavn af skabelsen af genetisk modificerede dyr. Vores gruppe arbejder typisk med en musemodel, der udtrykker hrGFP under Kiss1-genpromotoren eller en anden, der udtrykker Cre-rekombinase under Kiss1-genpromotoren og GFP under Cre-betinget ekspression. Der er dog mange validerede dyremodeller i dag23,26,36. Derudover repræsenterer fraværet af blod-hjernebarrieren og det faktum, at det ekstracellulære og intracellulære miljø let kan kontrolleres og manipuleres, fordele ved denne metode; De repræsenterer dog ikke nødvendigvis en fysiologisk tilstand. Blandt begrænsningerne ved denne teknik sammenlignet med in vivo-præparater eller andre registreringstyper, der sigter mod at bevare den cytoplasmatiske ionkoncentration, såsom optagelser på celle eller perforeret plaster, er det vigtigt at nævne, at invasiviteten af helcellekonfigurationen forårsager dialyse af cytoplasmaindholdet54. Dialyse kan forårsage afbrydelse af molekylære aspekter, der er nødvendige for, at nogle fænomener kan udvikle sig eller udtrykkes. Ved at optage fra skiver skal det huskes, at de fleste af neuronernes fremskrivninger er sektioneret. Det er således uden for teknikkens anvendelsesområde at evaluere, hvor meget denne forstyrrelse påvirker de observerede virkninger eller en fysiologisk tilstand. Som nævnt udføres koronale hjerneskiver på 200-300 μm normalt for at studere aktiviteten af hypothalamus kisspeptinneuroner 17,19,20,21,34. Begrænsningen ved at bruge en tykkere hjerneskivesektion til at studere kisspeptinceller og forskellige skivevinkler, der opretholder specifik AVPV/PeN- eller ARH-forbindelse55, kræver yderligere undersøgelse. Ved at teste effekten af et hormon/lægemiddel, syntetisk eller ej, på RMP for en neuron, er flere undersøgelser desuden baseret på lægemidlet EC50 (hvis det er kendt) eller på offentliggjorte data, der viser, at en specifik koncentration er effektiv til at aktivere affyringshastighed eller ændre [Ca2+]i-niveauer. Man bør dog være opmærksom på sammensætningen/specificiteten af det lægemiddel, der skal anvendes i forsøgene, da det er muligt, at oprensede syntetiske stoffer sammenlignet med andre lignende stoffer kan have antagonistiske virkninger28. Som tidligere påvist25, mens renset pGH ikke inducerer nogen effekt på hypothalamus kisspeptin neuron aktivitet, hGH produceret kontroversielle data (se figur 3). Lignende resultater blev påvist, når insulineffekter på ARH blev vurderet28. Derfor bør lægemiddelspecificitet overvejes ved planlægning af et eksperiment og fortolkning af de opnåede resultater.

Patch-clamp-teknikken er et fremragende værktøj til at opnå data om neuronelektrisk aktivitet og har bidraget væsentligt til kendskabet til flere neuronale populationer, såsom kisspeptinneuronerne. De fleste af detaljerne her bruges generelt til optagelser af hypothalamus neuroner, som vi tidligere har rapporteret 25,50,56,57,58,59,60. Det er vigtigt, at for at registrere andre neuronale populationer udover kisspeptinneuroner, skal man kende eller bestemme de elektrofysiologiske målinger, der kan hjælpe med at identificere celletyper, såsom cellekapacitans, SR, inputmodstand, cellefyringsmønster og andre parametre. Disse egenskaber varierer mellem forskellige hjerneceller, hjernekerner og fysiologiske eller inducerede tilstande, såsom cirkulerende kønssteroidniveauer 16,19,20,21,61, hvilket i væsentlig grad kan forstyrre den kritiske analyse af resultaterne. Derudover er det nødvendigt at forstå de mulige variabler involveret i vævsforberedelse og deres tilknyttede fordele og begrænsninger for at arbejde med denne teknik. Alle de trin, der er beskrevet her, skal udføres med omtanke, da enhver ændring i de variabler, der er involveret i protokollen, drastisk kan forstyrre resultaterne.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Der skal ikke erklæres nogen interessekonflikter.

Acknowledgments

Denne undersøgelse blev støttet af São Paulo Research Foundation [FAPESP-tilskudsnumre: 2021/11551-4 (JNS), 2015/20198-5 (TTZ), 2019/21707/1 (RF); og af Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) - Finance Code 001" (HRV).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Compounds for aCSF, internal and slicing solutions
ATP Sigma Aldrich/various A9187
CaCl2 Sigma Aldrich/various C7902
D-(+)-Glucose Sigma Aldrich/various G7021
EGTA Sigma Aldrich/various O3777
HEPES Sigma Aldrich/various H3375
KCL Sigma Aldrich/various P5405
K-gluconate Sigma Aldrich/various G4500
KOH Sigma Aldrich/various P5958
MgCl2 Sigma Aldrich/various M9272
MgSO4 Sigma Aldrich/various 230391
NaCl Sigma Aldrich/various S5886
NaH2PO4  Sigma Aldrich/various S5011
NaHCO3 Sigma Aldrich/various S5761
nitric acid Sigma Aldrich/various 225711 CAUTION
Sucrose Sigma Aldrich/various S1888
Equipments
Air table TMC 63-534
Amplifier Molecular Devices Multiclamp 700B
Computer various -
DIGIDATA 1440 LOW-NOISE DATA ACQUISITION SYSTEM Molecular Devices DD1440
Digital peristaltic pump Ismatec ISM833C 
Faraday cage TMC 81-333-03
Imaging Camera Leica DFC 365 FX
Micromanipulator Sutter Instruments Roe-200
Micropipette Puller Narishige PC-10
Microscope Leica DM6000 FS
Osteotome Bonther equipamentos & Tecnologia/various 128
Recovery chamber Warner Instruments/Harvard apparatus - can be made in-house
Recording chamber Warner Instruments 640277
Spatula Fisher Scientific /various FISH-14-375-10; FISH-21-401-20
Vibratome  Leica VT1000 S
Water Bath  Fisher Scientific /various Isotemp
Software and systems
AxoScope 10 software Molecular Devices - Commander Software
LAS X wide field system Leica - Image acquisition and analysis
MultiClamp 700B Molecular Devices MULTICLAMP 700B Commander Software
PCLAMP 10 SOFTWARE FOR WINDOWS Molecular Devices Pclamp 10 Standard
Tools
Ag/AgCl electrode, pellet, 1.0 mm Warner Instruments 64-1309
Curved hemostatic forcep various -
cyanoacrylate glue LOCTITE/various -
Decapitation scissors various -
Filter paper various -
Glass capillaries (micropipette) World Precision Instruments, Inc TW150F-4
Iris scissors Bonther equipamentos & Tecnologia/various 65-66
Pasteur glass pipette  Sigma Aldrich/various CLS7095B9-1000EA
Petri dish various -
Polyethylene tubing  Warner Instruments 64-0756
Razor blade for brain dissection TED PELLA TEDP-121-1
Razor blade for the vibratome TED PELLA TEDP-121-9
Scissors Bonther equipamentos & Tecnologia/various 71-72, 48,49; 
silicone teat various -
Slice Anchor  Warner Instruments 64-0246
Syringe filters Merck Millipore Ltda SLGVR13SL Millex-GV 0.22 μm
Tweezers Bonther equipamentos & Tecnologia/various 131, 1518

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Bezanilla, F. Single sodium channels from the squid giant axon. Biophysical Journal. 52 (6), 1087-1090 (1987).
  2. Clay, J. R. Potassium current in the squid giant axon. International Review of Neurobiology. 27, 363-384 (1985).
  3. Gandini, M. A., Sandoval, A., Felix, R. Patch-clamp recording of voltage-sensitive Ca2+ channels. Cold Spring Harbor Protocols. 2014 (4), 329-325 (2014).
  4. Hodgkin, A. L., Huxley, A. F. A quantitative description of membrane current and its application to conduction and excitation in nerve. The Journal of Physiology. 117 (4), 500-544 (1952).
  5. Perkins, K. L. Cell-attached voltage-clamp and current-clamp recording and stimulation techniques in brain slices. Journal of Neuroscience Methods. 154 (1-2), 1-18 (2006).
  6. Suk, H. J., Boyden, E. S., van Welie, I. Advances in the automation of whole-cell patch clamp technology. Journal of Neuroscience Methods. 326, 108357 (2019).
  7. Cole, K. S., Curtis, H. J. Electric impedance of the squid giant axon during activity. The Journal of General Physiology. 22 (5), 649-670 (1939).
  8. Bernstein, J. Ueber den zeitlichen Verlauf der negativen Schwankung des Nervenstroms. Pflüger, Archiv für die Gesammte Physiologie des Menschen und der Thiere. 1 (1), 173-207 (1868).
  9. Hamill, O. P., Marty, A., Neher, E., Sakmann, B., Sigworth, F. J. Improved patch-clamp techniques for high-resolution current recording from cells and cell-free membrane patches. Pflugers Archiv. 391 (2), 85-100 (1981).
  10. Hill, C. L., Stephens, G. J. An introduction to patch clamp recording. Methods in Molecular Biology. 2188, 1-19 (2021).
  11. Neher, E., Sakmann, B. Single-channel currents recorded from membrane of denervated frog muscle fibres. Nature. 260 (5554), 799-802 (1976).
  12. Sakmann, B., Neher, E. Patch clamp techniques for studying ionic channels in excitable membranes. Annual Review of Physiology. 46, 455-472 (1984).
  13. Gottsch, M. L., et al. A role for kisspeptins in the regulation of gonadotropin secretion in the mouse. Endocrinology. 145 (9), 4073-4077 (2004).
  14. Smith, J. T., Cunningham, M. J., Rissman, E. F., Clifton, D. K., Steiner, R. A. Regulation of Kiss1 gene expression in the brain of the female mouse. Endocrinology. 146 (9), 3686-3692 (2005).
  15. Smith, J. T., et al. Differential regulation of KiSS-1 mRNA expression by sex steroids in the brain of the male mouse. Endocrinology. 146 (7), 2976-2984 (2005).
  16. Ducret, E., Gaidamaka, G., Herbison, A. E. Electrical and morphological characteristics of anteroventral periventricular nucleus kisspeptin and other neurons in the female mouse. Endocrinology. 151 (5), 2223-2232 (2010).
  17. Qiu, J., Fang, Y., Bosch, M. A., Rønnekleiv, O. K., Kelly, M. J. Guinea pig kisspeptin neurons are depolarized by leptin via activation of TRPC channels. Endocrinology. 152 (4), 1503-1514 (2011).
  18. Gottsch, M. L., et al. Molecular properties of Kiss1 neurons in the arcuate nucleus of the mouse. Endocrinology. 152 (11), 4298-4309 (2011).
  19. de Croft, S., et al. Spontaneous kisspeptin neuron firing in the adult mouse reveals marked sex and brain region differences but no support for a direct role in negative feedback. Endocrinology. 153 (11), 5384-5393 (2012).
  20. Frazão, R., et al. Shift in Kiss1 cell activity requires estrogen receptor alpha. The Journal of Neuroscience. 33 (7), 2807-2820 (2013).
  21. DeFazio, R. A., Elias, C. F., Moenter, S. M. GABAergic transmission to kisspeptin neurons is differentially regulated by time of day and estradiol in female mice. The Journal of Neuroscience. 34 (49), 16296-16308 (2014).
  22. Mansano, N. D. S., et al. Vasoactive intestinal peptide exerts an excitatory effect on hypothalamic kisspeptin neurons during estrogen negative feedback. Molecular and Cellular Endocrinology. 542, 111532 (2022).
  23. Jamieson, B. B., Piet, R. Kisspeptin neuron electrophysiology: Intrinsic properties, hormonal modulation, and regulation of homeostatic circuits. Frontiers in Neuroendocrinology. 66, 101006 (2022).
  24. Silveira, M. A., et al. STAT5 signaling in kisspeptin cells regulates the timing of puberty. Molecular and Cellular Endocrinology. 448, 55-65 (2017).
  25. Silveira, M. A., et al. Acute effects of somatomammotropin hormones on neuronal components of the hypothalamic-pituitary-gonadal axis. Brain Research. 1714, 210-217 (2019).
  26. Cravo, R. M., et al. Leptin signaling in Kiss1 neurons arises after pubertal development. PLoS One. 8 (3), e58698 (2013).
  27. Manfredi-Lozano, M., et al. Defining a novel leptin-melanocortin-kisspeptin pathway involved in the metabolic control of puberty. Molecular Metabolism. 5 (10), 844-857 (2016).
  28. Qiu, J., et al. Insulin excites anorexigenic proopiomelanocortin neurons via activation of canonical transient receptor potential channels. Cell Metabolism. 19 (4), 682-693 (2014).
  29. de Croft, S., Boehm, U., Herbison, A. E. Neurokinin B activates arcuate kisspeptin neurons through multiple tachykinin receptors in the male mouse. Endocrinology. 154 (8), 2750-2760 (2013).
  30. Frazao, R., et al. Estradiol modulates Kiss1 neuronal response to ghrelin. American Journal of Physiology. Endocrinology and Metabolism. 306 (6), E606-E614 (2014).
  31. True, C., Verma, S., Grove, K. L., Smith, M. S. Cocaine- and amphetamine-regulated transcript is a potent stimulator of GnRH and kisspeptin cells and may contribute to negative energy balance-induced reproductive inhibition in females. Endocrinology. 154 (8), 2821-2832 (2013).
  32. Navarro, V. M., et al. Regulation of NKB pathways and their roles in the control of Kiss1 neurons in the arcuate nucleus of the male mouse. Endocrinology. 152 (11), 4265-4275 (2011).
  33. Segev, A., Garcia-Oscos, F., Kourrich, S. Whole-cell patch-clamp recordings in brain slices. Journal of Visualized Experiments. (112), e54024 (2016).
  34. Gibson, A. G., Jaime, J., Burger, L. L., Moenter, S. M. Prenatal androgen treatment does not alter the firing activity of hypothalamic arcuate kisspeptin neurons in female mice. eNeuro. 8 (5), (2021).
  35. Paxinos, G., Franklin, K. B. J. The Mouse Brain. Stereotaxic Coordinates. 2nd edition. , Academic Press. (2001).
  36. Cravo, R. M., et al. Characterization of Kiss1 neurons using transgenic mouse models. Neuroscience. 173, 37-56 (2011).
  37. Emane, M. N., Delouis, C., Kelly, P. A., Djiane, J. Evolution of prolactin and placental lactogen receptors in ewes during pregnancy and lactation. Endocrinology. 118 (2), 695-700 (1986).
  38. Fuh, G., Colosi, P., Wood, W. I., Wells, J. A. Mechanism-based design of prolactin receptor antagonists. The Journal of Biological Chemistry. 268 (8), 5376-5381 (1993).
  39. Barinaga, M. Ion channel research wins physiology Nobel. Science. 254 (5030), 380 (1991).
  40. Colquhoun, D. Neher and Sakmann win Nobel Prize for patch-clamp work. Trends in Pharmacological Sciences. 12 (12), 449 (1991).
  41. Greger, R. Nobel Prize for Medicine and Physiology 1991. Analysis of the function of single ion channel. Deutsche Medizinische Wochenschrift. 116 (48), 1849-1851 (1991).
  42. Brau, M. E., Vogel, W., Hempelmann, G. Possible applications of the "patch-clamp" method in anesthesiologic research; comment. Anasthesiologie, Intensivmedizin, Notfallmedizin, Schmerztherapie. 31 (9), 537-542 (1996).
  43. Cahalan, M., Neher, E. Patch clamp techniques: an overview. Methods in Enzymology. 207, 3-14 (1992).
  44. Kornreich, B. G. The patch clamp technique: principles and technical considerations. Journal of Veterinary Cardiology. 9 (1), 25-37 (2007).
  45. Neher, E., Sakmann, B. The patch clamp technique. Scientific American. 266 (3), 44-51 (1992).
  46. Sachs, F., Auerbach, A. Single-channel electrophysiology: use of the patch clamp. Methods in Enzymology. 103, 147-176 (1983).
  47. Dallas, M., Bell, D. Patch Clamp Electrophysiology: Methods and Protocols. 1st edition. , (2021).
  48. Robinson, R. A., Stokes, R. H. Electrolyte Solutions. 2nd edition. , Butterworths Scientific. (1959).
  49. de Souza, G. O., et al. Gap junctions regulate the activity of AgRP neurons and diet-induced obesity in male mice. The Journal of Endocrinology. 255 (2), 75-90 (2022).
  50. Houades, V., Koulakoff, A., Ezan, P., Seif, I., Giaume, C. Gap junction-mediated astrocytic networks in the mouse barrel cortex. The Journal of Neuroscience. 28 (20), 5207-5217 (2008).
  51. Richerson, G. B., Messer, C. Effect of composition of experimental solutions on neuronal survival during rat brain slicing. Experimental Neurology. 131 (1), 133-143 (1995).
  52. Pan, J. T., Li, C. S., Tang, K. C., Lin, J. Y. Low calcium/high magnesium medium increases activities of hypothalamic arcuate and suprachiasmatic neurons in brain tissue slices. Neuroscience Letters. 144 (1-2), 157-160 (1992).
  53. Hamill, O. P., McBride, D. W. Induced membrane hypo/hyper-mechanosensitivity: a limitation of patch-clamp recording. Annual Review of Physiology. 59, 621-631 (1997).
  54. Herbison, A. E., Moenter, S. M. Depolarising and hyperpolarising actions of GABA(A) receptor activation on gonadotrophin-releasing hormone neurones: towards an emerging consensus. Journal of Neuroendocrinology. 23 (7), 557-569 (2011).
  55. Qiu, J., et al. High-frequency stimulation-induced peptide release synchronizes arcuate kisspeptin neurons and excites GnRH neurons. eLife. 5, e16246 (2016).
  56. Chaves, F. M., Mansano, N. S., Frazão, R., Donato, J. Tumor necrosis factor α and interleukin-1β acutely inhibit AgRP neurons in the arcuate nucleus of the hypothalamus. International Journal of Molecular Sciences. 21 (23), 8928 (2020).
  57. Chaves, F. M., et al. Effects of the isolated and combined ablation of growth hormone and IGF-1 receptors in somatostatin neurons. Endocrinology. 163 (5), 045 (2022).
  58. Wasinski, F., et al. Growth hormone receptor in dopaminergic neurones regulates stress-induced prolactin release in male mice. Journal of Neuroendocrinology. 33 (3), e12957 (2021).
  59. Furigo, I. C., Ramos-Lobo, A. M., Frazao, R., Donato, J. Brain STAT5 signaling and behavioral control. Molecular and Cellular Endocrinology. 438, 70-76 (2016).
  60. Zampieri, T. T., et al. Postnatal overnutrition induces changes in synaptic transmission to leptin receptor-expressing neurons in the arcuate nucleus of female mice. Nutrients. 12 (8), 2425 (2020).
  61. Furigo, I. C., et al. Growth hormone regulates neuroendocrine responses to weight loss via AgRP neurons. Nature Communication. 10 (1), 662 (2019).

Tags

Denne måned i JoVE hjerneskive strømklemmeoptagelser Kiss1 hypothalamus
Hypothalamus kisspeptin neuroner som et mål for helcelle patch-clamp optagelser
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Silva, J. d. N., Zampieri, T. T.,… More

Silva, J. d. N., Zampieri, T. T., Vieira, H. R., Frazao, R. Hypothalamic Kisspeptin Neurons as a Target for Whole-Cell Patch-Clamp Recordings. J. Vis. Exp. (193), e64989, doi:10.3791/64989 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter