Evaluierung der Autophagie in zwei verschiedenen Pankreaszellmodellen mittels LC3-Immunfluoreszenz
Summary
Das Ziel dieses Protokolls ist es, die autophagischen Konzentrationen bei Bauchspeicheldrüsenkrebs und Pankreasazinuszellen durch LC3-Immunfluoreszenz und LC3-Punktquantifizierung zu bestimmen.
Abstract
Autophagie ist ein spezialisierter kataboler Prozess, bei dem zytoplasmatische Komponenten, einschließlich Proteine und beschädigte Organellen, selektiv abgebaut werden. Autophagie ermöglicht es Zellen, physiologisch auf Stressreize zu reagieren und so die zelluläre Homöostase aufrechtzuerhalten. Krebszellen könnten ihre Autophagie modulieren, um sich an widrige Bedingungen wie Hypoxie, Nährstoffmangel oder Schäden durch Chemotherapie anzupassen. Das duktale Pankreas-Adenokarzinom ist eine der tödlichsten Krebsarten. Pankreaskarzinomzellen weisen aufgrund der transkriptionellen Hochregulation und posttranslationalen Aktivierung von Autophagieproteinen eine hohe Autophagieaktivität auf.
Hier wurde die PANC-1-Zelllinie als Modell für menschliche Krebszellen der Bauchspeicheldrüse und die AR42J-Pankreas-Azinuszelllinie als physiologisches Modell für hochdifferenzierte Säugetierzellen verwendet. In dieser Studie wurde die Immunfluoreszenz der Mikrotubuli-assoziierten Protein-Leichtkette 3 (LC3) als Indikator für den Status der Autophagie-Aktivierung verwendet. LC3 ist ein Autophagieprotein, das unter basalen Bedingungen ein diffuses Verteilungsmuster im Zytoplasma aufweist (in diesem Zustand als LC3-I bekannt). Die Autophagie-Induktion löst die Konjugation von LC3 mit Phosphatidylethanolamin auf der Oberfläche neu gebildeter Autophagosomen aus, um LC3-II zu bilden, ein membrangebundenes Protein, das die Bildung und Expansion von Autophagosomen unterstützt. Um die Anzahl der markierten autophagischen Strukturen zu quantifizieren, wurde die Open-Source-Software FIJI mit Hilfe des Tools “3D Objects Counter” eingesetzt.
Die Messung der autophagischen Konzentrationen sowohl unter physiologischen Bedingungen als auch in Krebszellen ermöglicht es uns, die Modulation der Autophagie unter verschiedenen Bedingungen wie Hypoxie, Chemotherapie oder dem Knockdown bestimmter Proteine zu untersuchen.
Introduction
Makroautophagie (allgemein als Autophagie bezeichnet) ist ein spezialisierter kataboler Prozess, bei dem zytoplasmatische Komponenten, einschließlich Proteine und beschädigte Organellen, selektiv abgebaut werden 1,2. Autophagie ermöglicht es Zellen, physiologisch auf Stressreize zu reagieren und so die zelluläre Homöostase aufrechtzuerhalten3. Bei der Autophagie entsteht ein Doppelmembranvesikel: das Autophagosom. Das Autophagosom enthält die Frachtmoleküle und treibt sie zum Abbau in das Lysosom 1,4.
Autophagosomen werden durch das autophagische Protein Mikrotubuli-assoziiertes Protein Light Chain 3 (LC3)5 dekoriert. Wenn keine Autophagie induziert wird, diffundiert LC3 im Zytoplasma und Zellkern in der LC3-I-Konformation. Wenn andererseits Autophagie induziert wird, wird LC3 mit einem Phosphatidylethanolamin in der Membran der autophagischen Strukturenkonjugiert 6. Diese neue LC3-Konformation wird als LC3-II1 bezeichnet. Die Konformationsverschiebung von LC3 führt zu Veränderungen in der zellulären Lokalisation und der Migration der Dodecylnatriumsulfat-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE), die durch Techniken wie Immunfluoreszenz und Western Blot 5,7 nachgewiesen werden können. Auf diese Weise ist die LC3-Konjugation ein Schlüsselereignis im autophagischen Prozess, das zur Messung der autophagischen Aktivität verwendet werden kann.
Die Azinuszelle der Bauchspeicheldrüse ist eine hochdifferenzierte Zelle, die unter gesunden Bedingungen eine geringe Autophagierate aufweist. Unter verschiedenen physiologischen Bedingungen oder unter pharmakologischer Stimulation können sie jedoch die Autophagie aktivieren. Daher ist die Bestimmung der autophagischen Konzentrationen in dieser Zelllinie nützlich, um die möglichen direkten oder indirekten Auswirkungen verschiedener pharmakologischer oder biologischer Wirkstoffe auf die Autophagie zu untersuchen 8,9.
Das duktale Pankreas-Adenokarzinom ist aufgrund seiner späten Diagnose und seiner hohen Chemotherapieresistenz eine der tödlichsten Krebsarten10. Pankreaskarzinomzellen weisen aufgrund der transkriptionellen Hochregulation und posttranslationalen Aktivierung von Autophagie-verwandten Proteinen eine hohe Autophagieaktivität auf11. Bauchspeicheldrüsenkrebszellen können ihre Autophagie als Reaktion auf ungünstige Bedingungen wie Hypoxie, Nährstoffmangel oder Chemotherapie-induzierte Schäden anpassen11. Daher kann die Analyse des Autophagieniveaus in Bauchspeicheldrüsenkrebszellen helfen zu verstehen, wie sie sich an unterschiedliche Umgebungen anpassen, und die Wirksamkeit von autophagiemodulierenden Behandlungen bewerten.
Diese Studie zeigt eine Methode zur Durchführung von LC3-Immunfluoreszenz in zwei verschiedenen zellulären Modellen der Bauchspeicheldrüse. Das erste Modell, PANC-1-Zellen, diente als Modell für das duktale Adenokarzinom der Bauchspeicheldrüse. Diese Zellen wurden mit Gemcitabin behandelt, einem Chemotherapeutikum, von dem bereits gezeigt wurde, dass es Autophagie induziert, insbesondere in Bauchspeicheldrüsenkrebszellen, die das onkogene Kirsten-Rattensarkomvirus-Gen (KRAS) tragen12,13. Das zweite Modell, AR42J-Zellen, diente als physiologischeres Modell exokriner Pankreaszellen. Diese Zellen wurden mit Dexamethason differenziert, um den azinären Pankreaszellen ähnlicher zu werden14. In diesen Zellen wurde die Autophagie pharmakologisch durch die Verwendung von PP242 induziert, das ein potenter mTOR-Inhibitor ist15. In dieser Studie demonstrieren wir die Anwendbarkeit des beschriebenen Protokolls mit zwei verschiedenen Pankreasmodellen und seine Fähigkeit, zwischen Zuständen niedriger und hoher Autophagie zu unterscheiden.
Protocol
Representative Results
Discussion
Die in diesem Protokoll beschriebene Methode ermöglicht es, die endogene LC3-Verteilung in der Zelle zu visualisieren und die autophagischen Konzentrationen unter verschiedenen Bedingungen zu quantifizieren. Eine weitere ähnliche Methode zur Analyse der LC3-Verteilung und zur Bestimmung der Autophagieaktivierung ist die fluoreszenzmarkierte LC3-Transfektion (z. B. RFP-LC3)19. Die RFP-LC3-Transfektion hat den Vorteil, dass keine Fixierung erforderlich ist (was die Anwendung dieser Methode in der …
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde durch Zuschüsse der Universität Buenos Aires (UBACyT 2018-2020 20020170100082BA), des Nationalen Rates für wissenschaftliche Forschung und Technologie (CONICET) (PIP 2021-2023 GI− 11220200101549CO; und PUE 22920170100033) und der Nationalen Agentur für wissenschaftliche und technologische Förderung (PICT 2019-01664) unterstützt.
Materials
| 10x Phosphate-Buffered Saline (PBS) | Corning | 46-013-CM | |
| 12 mm round coverslips | HDA | CBR_OBJ_6467 | |
| 24 Well- Cell Culture Plate | Sorfa | 220300 | |
| Absolute ethanol | Biopack | 2207.10.00 | |
| Alexa Fluor 594 Donkey anti-rabbit IgG (H+L) | Invitrogen | R37119 | |
| Confocal Laser Scanning Microscope | Zeiss | LSM 800 | |
| DAPI (4',6-diamidino-2-phenylindole, dihydrochloride) | Invitrogen | 62248 | |
| Dexamethasone | Sigma Aldrich | D4902 | |
| DMEN | Sartorius | 01-052-1A | |
| Fetal Bovine Serum | NATOCOR | Lintc-634 | |
| Gemcitabina | Eli Lilly | VL7502 | |
| LC3B (D11) XP Rabbit mAb | Cell Signaling Technology | 3868S | |
| Methanol | Anedra | 6197 | |
| Parafilm "M" (Laboratory Sealing Film) | Bemis/Curwood | PM-996 | |
| Pen-Strep Solution | Sartorius | 03-031-1B | |
| PP242 | Santa Cruz Biotechnology | SC-301606 | |
| Trypsin EDTA | Gibco | 11570626 |
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