Valutazione dei livelli di autofagia in due diversi modelli di cellule pancreatiche utilizzando l'immunofluorescenza LC3
Summary
L’obiettivo di questo protocollo è determinare i livelli autofagici nel cancro del pancreas e nelle cellule acinose pancreatiche attraverso l’immunofluorescenza LC3 e la quantificazione dei punti LC3.
Abstract
L’autofagia è un processo catabolico specializzato che degrada selettivamente i componenti citoplasmatici, comprese le proteine e gli organelli danneggiati. L’autofagia consente alle cellule di rispondere fisiologicamente agli stimoli di stress e, quindi, mantenere l’omeostasi cellulare. Le cellule tumorali potrebbero modulare i loro livelli di autofagia per adattarsi a condizioni avverse come ipossia, carenza di nutrienti o danni causati dalla chemioterapia. L’adenocarcinoma pancreatico duttale è uno dei tipi più mortali di cancro. Le cellule tumorali pancreatiche hanno un’elevata attività autofagica a causa della sovraregolazione trascrizionale e dell’attivazione post-traduzionale delle proteine dell’autofagia.
Qui, la linea cellulare PANC-1 è stata utilizzata come modello di cellule tumorali umane pancreatiche e la linea cellulare acinosa pancreatica AR42J è stata utilizzata come modello fisiologico di cellule di mammifero altamente differenziate. Questo studio ha utilizzato l’immunofluorescenza della catena leggera 3 (LC3) della proteina associata ai microtubuli come indicatore dello stato di attivazione dell’autofagia. LC3 è una proteina autofagica che, in condizioni basali, mostra un modello diffuso di distribuzione nel citoplasma (noto come LC3-I in questa condizione). L’induzione dell’autofagia innesca la coniugazione di LC3 alla fosfatidiletanolammina sulla superficie degli autofagosomi appena formati per formare LC3-II, una proteina legata alla membrana che aiuta nella formazione e nell’espansione degli autofagosomi. Per quantificare il numero di strutture autofagiche etichettate, il software open source FIJI è stato utilizzato con l’aiuto dello strumento “3D Objects Counter”.
La misura dei livelli autofagici sia in condizioni fisiologiche che nelle cellule tumorali ci permette di studiare la modulazione dell’autofagia in diverse condizioni come l’ipossia, il trattamento chemioterapico o l’abbattimento di alcune proteine.
Introduction
La macroautofagia (comunemente indicata come autofagia) è un processo catabolico specializzato che degrada selettivamente i componenti citoplasmatici, comprese le proteine e gli organelli danneggiati 1,2. L’autofagia consente alle cellule di rispondere fisiologicamente agli stimoli di stress e, quindi, mantenere l’omeostasi cellulare3. Durante l’autofagia, si forma una doppia vescicola di membrana: l’autofagosoma. L’autofagosoma contiene le molecole di carico e le guida al lisosoma per la degradazione 1,4.
Gli autofagosomi sono decorati dalla proteina autofagica microtubule-associated protein microtubule-associated protein light chain (LC3)5. Quando l’autofagia non è indotta, la CL3 è diffusa nel citoplasma e nel nucleo nella conformazione LC3-I. D’altra parte, quando viene indotta l’autofagia, LC3 è coniugata con una fosfatidiletanolammina nella membrana delle strutture autofagiche6. Questa nuova conformazione LC3 è nota come LC3-II1. Lo spostamento della conformazione di LC3 provoca cambiamenti nella sua localizzazione cellulare e nella sua migrazione di elettroforesi su gel di sodio solfato-poliacrilammide (SDS-PAGE), che può essere rilevata con tecniche come l’immunofluorescenza e il western blot 5,7. In questo modo, la coniugazione LC3 è un evento chiave nel processo autofagico che può essere utilizzato per misurare l’attività autofagica.
La cellula acinosa pancreatica è una cellula altamente differenziata che, in condizioni di salute, ha un basso tasso di autofagia. Tuttavia, in diverse condizioni fisiologiche o sotto stimolazione farmacologica, possono attivare l’autofagia. Pertanto, la determinazione dei livelli autofagici in questa linea cellulare è utile per studiare i potenziali effetti diretti o indiretti di diversi agenti farmacologici o biologici sull’autofagia 8,9.
L’adenocarcinoma pancreatico duttale è uno dei tipi più letali di cancro, data la sua diagnosi tardiva e la sua elevata resistenza alla chemioterapia10. Le cellule tumorali pancreatiche hanno un’elevata attività autofagica a causa della sovraregolazione trascrizionale e dell’attivazione post-traduzionale delle proteine correlate all’autofagia11. Le cellule tumorali pancreatiche possono regolare i loro livelli di autofagia in risposta a condizioni sfavorevoli come ipossia, privazione di nutrienti o danni indotti dalla chemioterapia11. Quindi, l’analisi dei livelli di autofagia nelle cellule tumorali pancreatiche può aiutare a capire come si adattano a diversi ambienti e valutare l’efficacia dei trattamenti che modulano l’autofagia.
Questo studio mostra un metodo per eseguire l’immunofluorescenza LC3 in due distinti modelli cellulari pancreatici. Il primo modello, le cellule PANC-1, è servito come modello per l’adenocarcinoma duttale pancreatico. Queste cellule sono state trattate con gemcitabina, un agente chemioterapico che ha precedentemente dimostrato di indurre l’autofagia, in particolare nelle cellule tumorali pancreatiche portatrici del gene oncogeno del virus del sarcoma di ratto Kirsten (KRAS)12,13. Il secondo modello, le cellule AR42J, è servito come modello più fisiologico delle cellule pancreatiche esocrine. Queste cellule sono state differenziate con desametasone per diventare più simili alle cellule pancreatiche acinose14. In queste cellule, l’autofagia è stata farmacologicamente indotta attraverso l’uso di PP242, che è un potente inibitore mTOR15. In questo studio, dimostriamo l’applicabilità del protocollo descritto con due diversi modelli pancreatici e la sua capacità di discriminare tra stati di autofagia bassa e alta.
Protocol
Representative Results
Discussion
Il metodo descritto in questo protocollo consente di visualizzare la distribuzione endogena di LC3 nella cellula e quantificare i livelli autofagici in diverse condizioni. Un altro metodo simile utilizzato per analizzare la distribuzione di LC3 e determinare l’attivazione dell’autofagia coinvolge la trasfezione LC3 marcata con fluorescenza (come RFP-LC3)19. La trasfezione RFP-LC3 ha il vantaggio di non aver bisogno di fissazione (che consente di applicare questo metodo nell’imaging di cellule vive…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato sostenuto da sovvenzioni dell’Università di Buenos Aires (UBACyT 2018-2020 20020170100082BA), del Consiglio nazionale per la ricerca scientifica e la tecnologia (CONICET) (PIP 2021-2023 GI− 11220200101549CO; e PUE 22920170100033) e dell’Agenzia nazionale per la promozione scientifica e tecnologica (PICT 2019-01664).
Materials
| 10x Phosphate-Buffered Saline (PBS) | Corning | 46-013-CM | |
| 12 mm round coverslips | HDA | CBR_OBJ_6467 | |
| 24 Well- Cell Culture Plate | Sorfa | 220300 | |
| Absolute ethanol | Biopack | 2207.10.00 | |
| Alexa Fluor 594 Donkey anti-rabbit IgG (H+L) | Invitrogen | R37119 | |
| Confocal Laser Scanning Microscope | Zeiss | LSM 800 | |
| DAPI (4',6-diamidino-2-phenylindole, dihydrochloride) | Invitrogen | 62248 | |
| Dexamethasone | Sigma Aldrich | D4902 | |
| DMEN | Sartorius | 01-052-1A | |
| Fetal Bovine Serum | NATOCOR | Lintc-634 | |
| Gemcitabina | Eli Lilly | VL7502 | |
| LC3B (D11) XP Rabbit mAb | Cell Signaling Technology | 3868S | |
| Methanol | Anedra | 6197 | |
| Parafilm "M" (Laboratory Sealing Film) | Bemis/Curwood | PM-996 | |
| Pen-Strep Solution | Sartorius | 03-031-1B | |
| PP242 | Santa Cruz Biotechnology | SC-301606 | |
| Trypsin EDTA | Gibco | 11570626 |
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