Summary
현재 프로토콜은 속도, 거리 등의 매개변수를 계산하기 위해 고화질 비디오 녹화를 기반으로 각 프레임의 픽셀을 분할하는 플러그인과 호환되는 오픈 소스 소프트웨어 피지를 사용하여 손으로 만든 경기장에서 파리의 움직임을 추적 및 분석하여 초파리 의 운동 활동을 평가합니다.
Abstract
Drosophila melanogaster 는 풍부한 고급 유전자 조작 기술과 다양한 행동 특징으로 인해 다양한 질병을 연구하는 데 이상적인 모델 유기체입니다. 동물 모델에서 행동 결함을 식별하는 것은 예를 들어 환자가 종종 운동 기능 장애를 경험하는 신경퇴행성 질환에서 질병 중증도의 중요한 척도입니다. 그러나 약물 치료 또는 형질전환 개체와 같은 비행 모델의 운동 결함을 추적하고 평가할 수 있는 다양한 시스템을 사용할 수 있기 때문에 여러 각도에서 정확한 평가를 위한 경제적이고 사용자 친화적인 시스템이 여전히 부족합니다. 피지 이미지 처리 프로그램과 호환되는 AnimalTracker 응용 프로그래밍 인터페이스(API)를 기반으로 하는 방법이 여기에서 개발되어 녹화된 비디오에서 성충과 애벌레 개체의 움직임 활동을 체계적으로 평가하여 추적 행동을 분석할 수 있습니다. 이 방법은 행동을 기록하고 분석하기 위해 고화질 카메라와 컴퓨터 주변 장치 하드웨어 통합만 필요하므로 형질전환 또는 환경적 행동 결함이 있는 파리 모델을 선별하는 데 저렴하고 효과적인 접근 방식입니다. 약리학적으로 처리된 파리를 사용한 행동 테스트의 예는 기술이 성충 파리와 유충 모두의 행동 변화를 매우 반복 가능한 방식으로 감지할 수 있는 방법을 보여주기 위해 제공됩니다.
Introduction
초파리 멜라노가스터(Drosophila melanogaster)는 유전자 변형(gene modification)1, 약물 치료(drug treatment)2, 노화(sagingence)3에 의해 생성된 뉴런 질환 모델에서 세포 및 분자 기능을 조사하기 위한 우수한 모델 유기체를 제공한다. 인간과 초파리 사이의 생물학적 경로, 물리적 특성 및 질병 관련 상동체 유전자의 높은 보존은 초파리를 분자에서 행동 수준까지 이상적인 모방체로 만듭니다4. 많은 질병 모델에서, 행동 결핍은 다양한 인간 신경병증에 대한 유용한 모델을 제공하는 중요한 지표이다 5,6. 초파리는 현재 파킨슨병 및 근위축성 측삭 경화증과 같은 여러 인간 질병, 신경 발달 및 신경퇴행성 질환을 연구하는 데 사용됩니다 7,8. 질병 모델의 운동 능력을 감지하는 것은 병원성 진행을 이해하는 데 중요하며 질병 과정의 기초가 되는 분자 메커니즘에 대한 표현형 상관관계를 제공할 수 있습니다.
최근에, 상업적으로 이용 가능한 소프트웨어 도구 및 비용 효율적인 프로그램이 초파리 운동 탐지 전략을 위해 개발되었는데, 예를 들어 그룹화된 파리 9,10에서의 고처리량 테스트 및 실시간운동 측정(11,12)과 같은 것이다. 이러한 전통적인 접근법 중 하나는 등반 분석이라고도하는 신속한 상호 작용 음성 지오 택시 (RING)로, 동일한 성별과 연령을 가진 많은 파리 개체군을 포함 할 수있는 다중 채널을 포함하여 데이터를 수집하는 동안 변동을 줄입니다 9,13. 운동 거동을 분석하기 위한 또 다른 사전 테스트 방법은 TriKinetics 초파리 활동 모니터(DAM)이며, 이 장치는 얇은 유리관(14) 내에서 비행 활동 이동을 검출하기 위해 다중 빔을 사용하는 장치이다. 이 장치는 위치를 지속적으로 기록하는데, 이는 장기간에 걸쳐 파리의 활동과 일주기 리듬을 연구하기 위해 빔 교차를 계산하여 자동화된 이동을 나타냅니다15. 이러한 방법은 행동 운동의 변화를 결정하기 위해 초파리의 행동 결함을 분석하는 데 널리 사용되었지만 항상 특수 테스트 장비 또는 복잡한 분석 프로세스가 필요하며 제한적이고 간단한 장치로 일부 모델에서는 적용을 제한합니다. FlyGrAM11 및 Drosophila island assay10과 같은 성체 초파리를 테스트하기 위한 동물 추적 그룹 기반 전략은 사전 정의된 영역에서 사회적 모집 및 개별 추적을 구현합니다. 그럼에도 불구하고, 반항적인 지역에서의 사회적 개별적 제한은 파리의 충돌 또는 겹침으로 인해 이미지의 식별에 부정적인 영향을 미칠 수 있습니다. TRex16, MARGO 12 및 FlyPi17과 같은 일부 오픈 소스 재료 기반 방법은 비상 사태가 발생하더라도 행동 테스트에서 유연한 사용으로 파리를 빠르게 추적할 수 있습니다. 이러한 테스트 접근 방식은 정교한 실험 장치 설치, 특수 소프트웨어 요구 사항 또는 전문 컴퓨터 언어와 관련이 있습니다. 유충의 경우, 단위 시간당 격자 경계선의 수를 가로질러 이동한 총 거리를 측정하거나18 개체의 체벽 수축을 수동으로 대략적으로 세는 것19이 운동 능력을 평가하는 주된 방법이다. 장비나 장치 및 분석 방법의 정밀도가 부족하기 때문에 유충의 일부 행동 운동은 탐지되지 않아 행동 움직임, 특히 미세한 움직임을 정확하게 평가하기 어렵다15.
현재 개발된 방법은 피지(ImageJ) 영상 처리 프로그램과 호환되는 AnimalTracker 응용 프로그래밍 인터페이스(API)를 활용하여 고화질(HD) 비디오에서 추적 행동을 분석하여 성충 파리와 유충 파리의 운동 활동을 체계적으로 평가합니다. Fiji는 강력한 소프트웨어 라이브러리와 수많은 스크립팅 언어를 결합할 수 있는 오픈 소스 소프트웨어 ImageJ 배포판으로, 이미지 처리 알고리즘의 신속한 프로토타이핑을 가능하게 하여 이미지 분석 기능으로 생물학자들 사이에서 인기가 있습니다(20). 현재 접근 방식에서 피지의 AnimalTracker API에 대한 통합은 개인화된 알고리즘 삽입을 통해 고유한 초파리 행동 분석을 개발하는 데 활용되며, 운동 행동의 강력한 분석 기능을 지원하기 위한 자세한 문서 및 자습서를 위한 유용한 단계를 제공합니다(그림 1). 파리의 충돌 또는 겹침으로 인한 이미지에서 객관적인 식별의 복잡성을 피하기 위해 각 경기장은 단 하나의 파리만 호스팅하도록 제한됩니다. 접근법의 추적 정밀도를 평가한 결과, 파킨슨병의 동물 모델에 일반적으로 사용되는 독성 약물 로테논과 함께 투여된 초파리 의 운동 운동을 추적하고 정량화하여 궁극적으로 약물 치료에서 운동 장애를 발견하기 위해 구현되었습니다21. 오픈 소스 및 자유 소프트웨어를 사용하는 이 방법론은 고비용의 계측을 필요로 하지 않으며 초파리 행동 운동을 정확하고 재현 가능하게 분석할 수 있습니다.
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Protocol
W1118 성충 파리와 세 번째 instar 유충이 본 연구에 사용되었습니다.
1. 실험 준비
참고: Drosophila 운동 추적을 위한 오픈 필드 경기장은 무색 및 무취 실리카겔로 만들어집니다.
- 실리카 키트에 대한 제조업체의 지침에 따라 시약 A와 시약 B를 1:10의 비율로 혼합합니다( 재료 표 참조). 색상이 흰색으로 바뀔 때까지 교반하여 중탄산나트륨이 혼합물에 첨가되었는지 확인합니다. 혼합물을 깨끗한 페트리 접시에 옮기고 40°C의 오븐에 넣어 48시간 동안 건조시킵니다.
- HD 카메라( 재료 표 참조)를 삼각대에 놓고 카메라 렌즈가 실리카 경기장 표면에 수직이 되도록 조정합니다. 카메라의 초점 거리와 조리개를 조정하여 카메라가 실리카 표면에 초점을 맞추고 디스플레이의 조명이 적절하게 밝은지 확인하십시오. 실험 설정은 그림 1에 나와 있습니다.
- 파리를 오픈 필드 경기장으로 옮겨 최소 61초의 연속 비디오를 녹화합니다.
참고: 유충의 느린 특성을 고려하여 10분 이상의 비디오 녹화 시간을 권장합니다.- Fiji로 비디오를 열고 진행률 표시 줄을 초기 프레임으로 드래그 한 다음 암묵적으로 승인하십시오. "자유형 선택" 도구를 사용하여 파리의 몸 전체를 선택합니다(그림 2B,C).
- >이미지를 클릭하고 밝기 및 대비> 조정하여 선택한 영역의 회색 값이 넓은 배경에 가까워질 때까지 화이트 밸런스를 조정합니다(그림 2D-F).
참고: 첫 번째 프레임의 배경 균질화를 통해 소프트웨어는 물체가 없는 배경을 구별하고 파리가 있을 때 대비를 생성하여 소프트웨어가 이를 추적할 수 있도록 합니다.
- 25°C 및 60% 상대 습도로 설정된 테스트 환경, 조용하고 밝은 빛에 노출되지 않는 영역에서 전체 실험을 수행합니다.
2. 비디오 녹화 및 전처리
- 95 % 이산화탄소 (CO2)를 사용하여 짧은 마취 후 파리를 오픈 경기장으로 옮기고 카메라 응용 프로그램의 녹화 버튼을 눌러 비디오 녹화를 시작합니다.
알림: 운동에 대한 마취제의 영향을 최소화하려면 비디오 녹화를 시작하기 전에 파리가 10분 동안 회복되도록 하십시오. 냉기에 의한 시원함 마취도 권장됩니다.- 파리가 마취에서 회복되면 파리가 들어있는 경기장 접시를 카메라 아래에 놓고 플레이트를 좌우로 빠르게 흔들어 녹화가 시작될 때 파리가 움직이도록합니다.
- 녹화가 완료되면 중지 버튼을 눌러 동영상 녹화를 종료합니다.
참고: 비디오 녹화 시간이 대상 추적 시간을 약간 초과하는지 확인하십시오. 또한 실험 효율성을 높이기 위해 여러 파리를 자발적으로 추적 할 수 있습니다. 이것은 고품질 비디오 자르기를 가능하게 하는 카메라의 해상도에 따라 다릅니다. - 녹화된 비디오를 MJPEG 인코딩을 사용하여 AVI 형식으로 변환하여 피지를 사용하여 열고 분석할 수 있습니다. 한편, 비디오의 초당 프레임 속도(fps)를 성충의 경우 15fps, 유충의 경우 12fps로 설정합니다.
3. 비디오 분석
- Fiji로 비디오를 열 때 팝업 창의 두 가지 옵션인 "가상 스택 사용" 및 "회색조로 변환"으로 변환된 비디오를 엽니다(그림 2A).
- 위에서 언급 한 것처럼 빈 첫 번째 프레임을 만듭니다.
- AnimalTracker 플러그 인의 "활성 이미지 설정" 도구를 사용하여 처리 창을 가져오고 "타원형" 도구를 사용하여 원본 비디오 창에서 경기장을 도는 추적 영역을 만듭니다(그림 3A).
- 처리 창의 첫 번째 빈 프레임에 대해 필터(그림 3A,3)와 두 필터의 매개변수(그림 4A-G)를 설정합니다. 그런 다음 원본 비디오 창에서 다음 프레임을 선택하고 처리 창의 필터링된 표면을 선택합니다(그림 5A-C).
참고: 필터링 단계는 이미지 노이즈를 줄이거나 배경을 제거하는 역할을 하므로 프레임의 이진화에서 전경과 배경을 더 쉽게 분리할 수 있습니다. - 필터링된 처리 창이 선택되면 "임계값 설정" 도구를 사용하여 처리 창에 가려진 빨간색 프로필로 추적 플라이를 돌립니다(그림 3A, 4, 그림 5D-E 및 그림 6A).
- "set blob-detector"를 사용하여 컴퓨터가 처리 창에 빨간색 프로파일이 있는 파리를 인식하도록 합니다(그림 3A, 5 및 그림 6B).
- 프레임(901)을 비디오의 녹화 지속 시간 및 fps에 의해 계산된 성인 파리의 마지막 프레임으로 설정합니다(그림 3A, 6, 그림 6C).
참고: 유충에 대한 다음 실험은 10분 동안 추적되었으므로 프레임 7200이 마지막 프레임으로 설정됩니다. - "얼룩 표시" 도구를 사용하여 원본 비디오 창에 추적 사각형을 표시합니다(그림 3A, 7 및 그림 6D, E). 그런 다음 추적을 시작하고 모니터링이 완료된 후 추적 파일을 내보냅니다(그림 3A, 8,9 및 그림 7A, B).
4. 추적 파일 분석
- Animal 추적기 > 추적 분석기 플러그인을 사용하여 트랙 및 영역 파일을 로드합니다(그림 8A).
- 영역 설정을 사용하여 원하는 인덱스를 선택하고 매개변수 설정을 변경합니다(그림 8). 프레임 속도를 사용하여 프레임 간격의 시간을 계산합니다.
참고: 이 조건에서 프레임 속도는 15fps이고 프레임 간격은 기본 설정인 약 0.067초입니다(그림 8D). - 추적 분석기에서 분석한 후 스프레드시트 소프트웨어와 GraphPad Prism을 사용하여 정량 분석 차트를 생성합니다(그림 9).
5. 프레임당 분석
- 프레임 간격당 속도 분석을 수행합니다. 더 자세한 조사가 필요한 경우 피지 없이 트랙 파일을 분석합니다.
- 트랙 파일을 열고 모든 좌표를 Microsoft Office Excel로 복사한 다음 스페이스 키를 사용하여 셀을 분할합니다.
참고: 예를 들어, 파일이 "C" 및 "D" 열로 분할되면 프레임 간격당 초파리 의 속도는 "E" 열에 표시된 공식 SQRT((C5-C4)^ 2+(D5-D4)^2)로 계산됩니다(그림 10A). 열 "E"의 데이터는 파리가 두 프레임 간에 이동한 픽셀 수를 나타내며 첫 번째 프레임은 고려되지 않습니다. 계산된 모든 결과를 선택하고 꺾은선형 차트를 삽입하여 프레임 간격당 직관적인 비행 이동 속도를 나타내며 꺾은선형 차트에 피크가 표시됩니다(그림 10B).
- 트랙 파일을 열고 모든 좌표를 Microsoft Office Excel로 복사한 다음 스페이스 키를 사용하여 셀을 분할합니다.
- 프레임 간격당 움직이지 않는 시간을 계산합니다. 파일을 "C" 및 "D" 열로 분할한 후 "E" 열에 표시된 IF(SQRT((C6-C5)^2+(D6-D5)^2) <20, 0, 1) 공식을 사용하여 프레임 간격당 초파리의 부동 상태를 계산합니다. (그림 10C).
참고: 속도 분석과 달리 첫 번째 프레임의 결과가 정의되었습니다. 20픽셀 미만으로 이동한 파리는 움직이지 않는 것으로 간주되어 열 "E"에 "0"으로 기록되었습니다.- 계산된 결과를 모두 선택하고 세로 막대형 차트를 삽입하여 전체 세로 막대형 차트의 여백만큼 움직이지 않는 시간을 시각적으로 표시합니다(그림 10D).
- 방향 각도가 변경되는지 확인하십시오.
참고: 방향 변경 각도 분석은 파리의 방향 선택을 나타냅니다. 파일이 "C" 및 "D" 열로 분할되면 방향 변경 각도는 "E" 열에 표시되는 ACOS(((SQRT((C7-C6)^2+(D7-D6)^2))^2+(SQRT((C6-C5)^2))^2-(SQRT((C7-C5)^2+(D7-D5)^2))^2)/(2*SQRT((C6-C5)^2+(D6-D5)^2))*( SQRT((C7-C6)^2+(D7-D6)^2)*180/PI()로 계산되며, 이는 "E" 열에 표시됩니다(그림 10E). 계산된 결과는 세 좌표 사이의 각도를 나타냅니다.- 계산된 결과를 모두 선택하고 파리의 움직임에 따른 방향 변경 각도를 설명하기 위해 분산형 다이어그램을 삽입합니다(그림 10F).
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Representative Results
본 연구에서는 로테논으로 처리된 성충 파리와 세 번째 유충의 운동 결손을 조사하고 운동 활동을 약물 용매 디메틸 설폭사이드(DMSO)를 먹인 대조군 파리의 운동 활동과 비교했습니다. 초파리에서 로테논으로 치료하면 뇌에서 도파민성 뉴런 손실이 발생하고22 상당한 운동 장애를 유발하는 것으로 나타났다23. 그림 11 및 그림 12에서 볼 수 있듯이 로테논으로 처리된 성충 파리와 세 번째 instar 유충은 DMSO를 먹인 대조군 파리에 비해 상당한 운동 장애가 있습니다. 그림 11 및 그림 12B-E는 로테논을 사용하거나 사용하지 않고 처리된 파리 사이의 이동 매개변수에 대한 거리, 속도 및 부동 시간의 상대적 변화를 보여줍니다. 그림 11 및 그림 12F-K는 성충 및 유충에서 로테논 처리 유무에 관계없이 속도, 부동 시간 및 방향 선택의 매개변수에 대한 대표적인 분석을 보여줍니다. 약물 공급 그룹의 성체 파리(그림 11)와 세 번째 유충(그림 12)에서 피지 소프트웨어를 사용하여 거리, 부동 시간 및 속도의 매개변수를 정량적으로 분석하면 로테논 치료가 신경퇴행성 질환을 포함한 인간 질병의 운동 결손을 조사하고 인간과 포유류에서 관찰되는 일부 행동 특성을 복제하는 데 사용할 수 있음을 추가로 검증합니다.
그림 1: 초파리 움직임 추적 분석을 위한 장비 설정 및 실험 절차를 요약한 순서도. 운동 추적 경기장은 컴퓨터에 통합되고 제어되는 오버헤드 HD 카메라로 이미지화됩니다. 초파리 의 운동 분석 절차는 비디오 녹화, 움직임 추적, 추적 파일 분석, 데이터 처리 및 파라메트릭 분석으로 구성됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: 첫 번째 프레임의 배경 균질화. (A) 변환된 비디오를 여는 동안 "그레이스케일로 변환" 옵션을 선택하여 비디오를 그레이스케일로 변환하고 색상 간섭을 피하십시오. (B) 빨간색 상자에 표시된 "자유형 선택" 도구를 사용하여 초파리 의 윤곽을 그립니다. (C) 분석 선택으로 파리의 윤곽을 묘사하기 위해 노란색 선을 사용했습니다. 노란색 선을 파리의 윤곽에 가깝게 유지하면 파리가 차지하지 않는 영역을 선택할 가능성이 줄어 듭니다. 스케일 바 = 1cm. (D) 노란색 상자 영역이 배경과 동일한 회색조로 바뀔 때까지 첫 번째 프레임의 밝기와 대비를 조정합니다. (E) "스택" 창에서 "아니오"를 클릭하여 첫 번째 프레임에 대한 밝기 및 대비 조정을 완료하되 모든 프레임에 대해 완료하지는 않습니다. (F) 궁극적으로 첫 번째 프레임은 균일하고 흠집이 없는 배경을 만들기 위해 조정됩니다. 스케일 바 = 1cm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: 추적 창 및 추적 영역 설정 (A) 동물 추적 창에 표시된 순서대로 트래커 플러그인을 클릭하여 추적 분석을 완료합니다. (B) 그림 A,1에서 활성 이미지를 설정하면 현재 프레임만 표시하는 처리 창이 표시됩니다. 기본 비디오 창과 처리 창은 명확하게 구별되며 서로 다른 상황에서 사용됩니다. 현재 프레임을 변경하려면 기본 비디오 창에서 변경이 실행되는지 확인하십시오. 변경 사항은 두 창 모두에서 볼 수 있습니다. 스케일 바 = 1cm. (C) 컴퓨터 인식을 위한 "타원형" 도구를 사용하여 경기장을 도는 추적 영역을 만듭니다. 추적 영역 선택은 처리 창이 아닌 열려 있는 비디오 창의 원으로 표시된 경기장에 있어야 합니다. (D) 외부 조명의 방해를 최소화하기 위해 경기장에 최대한 맞도록 노란색 선으로 추적 영역의 윤곽을 그립니다. 스케일 바 = 1cm. ( E ) 추적 영역에서 관심 영역(ROI)을 설정하려면 "영역 디자이너" 창에 표시된 숫자로 표시된 순서 다음에 있는 버튼을 클릭합니다. 이 단계에서는 선택한 비디오 창이 열린 후 전체 작업을 완료해야합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4: 첫 번째 프레임에 대한 필터 설정. (A) 트래킹 영역에 대한 ROI 설정을 완료하면 경기장을 둘러싸는 노란색 선이 열린 비디오 창과 처리 창 모두에서 녹색으로 변경됩니다. 스케일 바 = 1cm. (B) 필터의 용도를 추가하면 검은색 배경이 설정되어 처리 창의 첫 번째 프레임에서 대상 개체가 더 선명해집니다. 전체 작업은 열려 있는 비디오 창이 아닌 처리 창 내에서 수행되어야 합니다. (씨, 디) "필터 설정" 창에 "배경 빼기" 및 "가우시안 흐림" 필터를 추가하면 처리 창의 첫 번째 프레임이 검은색으로 바뀝니다. 전체 필터 설정 프로세스는 첫 번째 프레임에서 완료되어야 합니다. (E) 매개변수는 "배경 빼기" 창에서 숫자와 빨간색 사각형으로 표시된 버튼을 클릭하여 단계별로 설정됩니다. "이미지 설정" 단계는 처리 창을 선택한 후 조작해야 합니다. (F) 스케일 바 = 1cm. "중간 이미지" 창은 "E4"에서 "필터 표시" 버튼을 클릭하고 아무 조작 없이 창을 직접 닫으면 표시됩니다. (G) 가우시안 블러의 매개변수는 기본 시그마 값 2.0으로 설정됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 5: 두 번째 프레임의 임계값 설정. (A) 아래쪽 진행률 표시줄을 클릭하여 비디오 창을 두 번째 프레임으로 진행합니다. 파리는 화면 중앙에서 반복되며 피지로 식별됩니다. 스케일 바 = 1cm. (B,C) 필터링 전후의 처리 창을 표시합니다. (B) 빨간색 직사각형으로 표시된 모드를 선택하여 필터링된 처리 창을 표시합니다. (C) "필터링된" 모드가 선택된 후 빨간색 사각형이 있는 처리 창의 예. 스케일 바 = 1cm. (D) 그림 3A,4에서 "임계값 설정" 도구를 선택한 후 "임계값 설정" 창에 표시된 기본 임계값 방법인 "그레이스케일 임계값 생성기"를 선택하여 임계값을 설정합니다. (E) 추적 플라이가 보이고 빨간색 프로로 가려질 때까지 가운데에 있는 진행률 표시줄 상자를 밀어 매개변수를 조정합니다.file. 아래 빨간색 사각형에 있는 매개 변수에 대한 기본 설정을 변경하지 않는 것이 좋습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 6: 물방울 감지기, 마지막 프레임 설정 및 동물 추적 선택. (A) 도 5E에 명시된 임계치에 도달하면, 처리 윈도우는 제2 프레임에서 플라이에 이어 상당한 적색 프로파일을 나타낸다. 파리를 덮고 있는 빨간색 프로파일을 만들어 파리를 추적합니다. 스케일 바 = 1cm. (B) 기본 Blob 감지기 방법인 "기본 Blob 감지기"를 선택하여 빨간색 프로파일로 덮인 파리를 추적 대상으로 정의합니다. (C) 그림 901A,3의 "마지막 프레임 설정" 도구를 사용하여 프레임 6을 마지막 프레임으로 설정합니다. 총 프레임 수는 "프레임 수 = fps * 녹화 시간" 공식으로 계산됩니다. (D) 추적은 열린 비디오 창(왼쪽 패널 섹션)에 얼룩을 표시한 후 상자가 있는 노란색 사각형으로 날아갑니다. 확대 된 왼쪽 패널에서 초파리는 빨간색 (오른쪽 패널 섹션)으로 부착됩니다. 스케일 바 = 1cm. ( E) "D"(상단 패널 섹션)에서 빨간색 사각형을 클릭하여 선택한 후 상자가 있는 빨간색 사각형이 있는 추적 플라이. 상부 패널 확대에서 초파리는 빨간색으로 부착됩니다 (하단 패널 섹션). 열린 비디오 창에서 추적 플라이 주위의 노란색 사각형 선택이 완료되었는지 확인합니다. 열린 비디오 창에서 선택을 완료하면 모든 프레임에서 피지가 파리를 식별합니다. 스케일 바 = 1cm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 7: 추적 추적 결과 추적 추적은 열린 비디오 창 (A )과 처리 창 (B)에 별도로 표시됩니다. 추적 추적 프로필을 가져오려면 원본 비디오 창에서 진행률 표시줄을 클릭하고 진행률 표시줄을 밀어 추적의 연속성을 확인합니다. 추적 추적은 파리의 크롤링 거리를 직관적으로 표시합니다. 스케일 바 = 1cm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 8: AnimalTracker 플러그인을 사용한 추적 파일 분석. (A) 추적 분석기는 추적 파일의 상세한 분석을 용이하게 합니다. 빨간색 직사각형으로 표시된 각 단계는 숫자로 표시됩니다. (B) A,4에서 "영역 설정" 매개변수를 설정합니다. 네 개의 매개변수, 즉 시간, 거리, 부동 시간, 속도 벡터가 빨간색 직사각형에 표시됩니다. 매개변수는 원하는 결과에 따라 선택됩니다. (씨지) A,5의 "매개변수 설정" 창에서 구성 매개변수를 개별적으로 설정합니다. (C) "구성 매개변수 설정" 창에는 4개의 조정 가능한 매개변수가 설명되어 있으며, (D-G) 각각 "시간 설정", "부동 시간 설정", "거리 설정" 및 "속도 벡터 설정" 창이 표시됩니다. 매개변수 설정의 기본값을 수정하는 것은 권장되지 않습니다. 그러나 "프레임 간격"의 경우 비디오의 fps가 변경될 때 "프레임 간격 = 1/fps" 공식을 사용하여 매개변수를 계산해야 합니다. 또한, 파리의 추적과 함께 기록된 픽셀을 유형의 가치와 연관시킴으로써 실제 거리 및 속도를 확인하기 위해 알려진 스케일을 사용할 수 있습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 9: 추적 파일 분석을 표시하는 결과 (A) 그림 8A,6의 설정. 데이터를 표시하는 두 가지 모드를 사용할 수 있습니다 : "영역별로 그룹화"및 "매개 변수로 그룹화". (B) 추적 파일 분석 결과는 "A,6.1"에서 "영역별 그룹화"로 표시됩니다. (C-F) 추적 파일 분석 결과는 A,6.2에서 "매개변수로 그룹화"로 표시되며 "부동 시간"(C), "속도 벡터"(D), "시간"(E) 및 "거리"(F)를 별도로 나타냅니다. 부동 시간 및 거리의 결과는 "s"와 "픽셀"로 정량화됩니다. 속도 벡터의 단위는 "pixel/s"로 정의되어야 하며 주석 "length"로 출력되어야 합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 10: fps당 속도에 대한 데이터 분석 결과. (A, C 및 E) 내보내기 데이터에는 가로(열 "C") 및 세로(열 "D") 파티션의 픽셀 좌표와 픽셀 이동, 움직이지 않음 및 두 프레임 간격(각각 A, C 및 E의 열 "E") 간의 방향 변경 각도가 포함되며, 이는 컨텍스트에 설명된 수식에 따라 자동으로 계산됩니다. 피지에서 내보낸 결과는 텍스트 문서이므로 Microsoft Office Excel에서 파일을 열고 그 사이에 공백을 추가하여 데이터를 세 개의 열로 분할하는 것이 좋습니다. (B, D 및 F) 꺾은선형 차트는 픽셀 이동(B)의 데이터 세트에서 계산된 결과를 표시합니다. 전역 피크 값은 움직임을 나타내는 속도를 나타냅니다. 세로 막대형 차트는 부동성(D)의 데이터 세트에서 계산된 결과를 표시합니다. 세로 막 대형 차트의 희소성 정도는 파리의 운동 능력 결함을 나타내는 부동성을 나타냅니다. 분산형 다이어그램은 방향 변경 각도(F)의 데이터 세트에서 계산된 결과를 표시합니다. 산점도에 표시된 스플래시의 풍부화는 파리가 선택한 방향을 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 11: 로테논을 사용하거나 사용하지 않고 처리된 파리 간의 움직임에 대한 비교 분석. (A) 500μM 로테논 또는 대조군용 DMSO를 함유한 표준 식품을 먹인 W1118 성체 파리의 추적 추적에 대한 대표적인 그래프가 표시됩니다. W1118 파리를 채취한 다음 500μM 로테논 또는 DMSO, 25°C 및 60% 습도의 표준 식품으로 구성된 통제된 환경에 배치했습니다. 48시간 후에 각 그룹으로부터 6마리의 파리를 분석에 사용하였다. 그 결과 로테논을 먹인 추적 파리의 이동 거리가 대조군에 비해 현저히 감소한 것으로 나타났습니다. 그 결과 로테논을 먹인 파리에서 운동 능력에 결함이 있는 것으로 나타났습니다. (B-E) 평균 이동 거리, 부동 시간, 평균 속도 및 최대 속도에 대한 로테논 처리의 정량 분석은 피지를 사용하여 수행됩니다. 로테논 처리의 결과는 이동 거리와 평균 속도의 현저한 감소와 부동 시간의 현저한 증가를 보여주었습니다. (에프케이) 로테논(G,I,K) 또는 DMSO(F,H,J)로 처리된 파리 사이의 프레임당 픽셀 수(F,G), 프레임당 움직이지 않는 시간(H,I) 및 방향 변화각(J,K) 분석. 로테논이 이동 속도에 미치는 영향을 보여주는 예제 그래프는 대조군(F)에 비해 로테논을 먹인 파리(G)의 프레임 간격당 이동 속도를 나타내는 피크가 더 적다는 것을 보여주며, 이는 운동 활동 결함(F,G)의 심각도를 나타냅니다. 프레임당 이동된 픽셀의 직관적 부동 열은 더 낮으며, 대조군 파리(H)에 비해 로테논 먹이 파리(I)의 경우 1분 이내에 훨씬 적은 움직임을 보여줍니다. 로테논을 먹인 동물(K)과 대조군(J) 동물의 방향 변화의 이동 각도 변화에 대한 예제 그래프는 파리가 선택한 방향의 변화를 보여줍니다. 데이터는 1분 동안 모니터링된 6마리의 수컷 파리의 평균 ± SEM입니다. 별표는 그룹 간에 유의한 차이를 나타냅니다(***p < 0.001; unpaired t-test, p = 0.05). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 12: 로테논을 사용하거나 사용하지 않고 처리된 유충 간의 움직임에 대한 비교 분석. (A) 로테논 또는 DMSO를 먹인 W1118 세 번째 인스타 유충의 흔적을 추적하여 운동 활동을 비교한 대표적인 결과. 간략히 설명하면, W1118 제3 인스타 유충을 수집하여 습도 60%의 25°C 환경에서 10% 수크로오스 또는 500μM 로테논을 함유하는 10% 수크로오스에서 배양하였다. 그룹당 6마리의 유충을 분석에 사용했습니다. 유충의 느린 움직임을 고려하여 5분 동안 기록된 데이터를 정량화하고 분석하여 로테논이 운동에 미치는 영향을 평가했습니다. (B-E) 피지에서 분석된 두 그룹의 평균 거리, 부동 시간, 평균 속도 및 최대 속도를 정량적으로 분석합니다. 정량적 결과는 로테논을 먹인 유충에서 이동 거리, 평균 속도 및 최대 속도가 유의하게 감소하고 로테논을 먹인 유충에서 부동 시간이 유의하게 증가함을 보여줍니다. (에프케이) 성충 파리와 유사하게 프레임당 픽셀 수, 부동 시간, 로테논을 투여한 파리(G,I,K)와 로테논을 투여하지 않은 파리(F,H,J)의 방향각 변화를 분석한 결과, 로테논으로 처리한 유충은 이동 속도가 더 낮고 움직이지 않는 시간이 더 많으며 방향이 번갈아 나타납니다. 결과는 로테논을 먹인 추적 유충의 행동 움직임이 대조군에 비해 현저히 손상되었음을 보여줍니다. 결과는 로테논을 먹인 파리의 결함 있는 운동 활동을 보여줍니다. 데이터는 5분 동안 모니터링된 6마리의 3일령 유충의 평균 ± SEM입니다. 별표는 그룹 간에 유의한 차이를 나타냅니다(*p < 0.05; **p < 0.01; ***p < 0.001; unpaired t-검정, p = 0.05). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
표 1: 초파리의 운동 활동 정량화를 위한 동물 추적 기반 방법론 비교. 이 표를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
우리는 피지 이미지 처리 프로그램과 호환되는 오픈 소스 자료 AnimalTracker API를 기반으로 연구자들이 성충 파리와 개별 유충 파리를 모두 추적하여 운동 활동을 체계적으로 평가할 수 있는 방법을 설계했습니다. AnimalTracke 는 자바로 작성된 도구로, 애플리케이션-설계된 동물 추적 행동의 분석을 용이하게 하기 위해 기존 데이터베이스 또는 다른 툴에 쉽게 통합될 수 있다24. 성충과 유충의 운동 활동을 정량화하는 소프트웨어 계산 공식에 의한 프레임별 분석을 통해 이동 속도, 이동 거리, 부동성 및 방향 변화 각도를 포함한 여러 매개변수를 유연하게 분석할 수 있습니다. 행동 운동의 다양한 측면을 나타내는 이러한 매개변수는 시간 경과에 따른 운동 변화를 설명하기 위해 플롯할 수 있습니다. 또한 그래픽 사용자 인터페이스를 만들고 사용법에 대한 자세한 문서를 제공하며 응용 프로그래밍 인터페이스를 제공하여 프로그래밍 경험이 부족한 연구원과 맞춤형 실험 패러다임을 만드는 숙련된 사용자가 이 방법에 액세스할 수 있도록 하는 것을 목표로 합니다.
이 방법이 행동을 정확하게 모니터링 할 수 있는지 확인하기 위해 로테 논으로 처리 된 성충 파리 및 유충의 운동 테스트와 약물 용매를 먹인 대조군 파리의 운동 활동과 운동 활동을 비교했습니다. 플러그인이 포함된 피지 소프트웨어는 움직임의 비디오 녹화에서 각 프레임의 픽셀 좌표를 분석하는 데 사용되어 실험 파리의 속도, 거리 및 기타 매개변수를 계산할 수 있습니다. 우리는 로테논 투여에서 시간이 지남에 따라 이동한 거리가 크게 감소하는 것을 관찰했으며(그림 11), 이는 보고된 결과23과 일치합니다. 한편, 오름차순 이동 속도와 선택된 비정상적인 방향은 파리의 행동 결핍에 대한 자세한 내용을 설명하는 데 도움이 되도록 약물을 섭취한 그룹에서 관찰되었습니다. 성충의 운동 활동을 감지하는 데 성공한 것을 감안할 때, 우리는 유충의 이동성을 평가하려고 했습니다(그림 12). 대조군과 비교하여, 로테 논을 먹인 추적 유충의 결과는 약물을 먹인 성인 파리의 결과와 유사하게 현저하게 손상되었다. 로테논을 먹인 성충과 유충을 대상으로 한 실험은 이 방법이 대조군에 비해 운동 결손을 일으킨 파리의 감소를 정확하게 기록할 수 있음을 시사합니다. 이 보고서는 동물 실험 모델 또는 약리학 연구에서 초파리의 운동 능력 및 행동 결함의 기타 측면을 정량화하고 분석하는 현재 방법의 적용을 성공적으로 입증했습니다.
비디오 및 추적 분석이 성공적이고 재현 가능한 결과를 얻을 수 있도록 하려면 다음 지침을 따르는 것이 좋습니다. 먼저 비디오 프레임 속도를 선택하려면 녹화된 비디오를 초당 15프레임(fps) 형식으로 변환하는 것이 좋습니다. 이것은 좋은 모션 추적을 유지할 수 있을 뿐만 아니라 방대한 양의 데이터로 인한 컴퓨터 분석의 속도 저하를 피할 수 있습니다. 비디오 프레임 속도를 개선하여 모션 궤적 분석이 더욱 상세해집니다. 둘째, 공식의 매개변수는 두 프레임 사이의 정적 모션을 분석할 때 해당 실험 방식에 맞게 조정할 수도 있습니다. 유충 운동 모니터링의 경우 응고된 실리카겔이 단단하고 유충이 들어갈 수 없기 때문에 한천보다는 실리카겔을 사용하는 것이 필수적입니다. 또한 실리카겔은 투명하고 색상 물질을 추가하여 염색하여 최적의 배경을 생성할 수 있어 원하는 광학 효과를 촉진하여 이미지 품질을 향상시킵니다.
동물 추적 시스템은 병인학, 신경 과학 및 행동 유전학 커뮤니티에 포괄적인 솔루션을 제공하기 위해 발전하고 있습니다. 표 1은 현재 이용가능한 다수의 추적 프로그램(10,11,12,16,17,25,26)의 특징의 비교를 제공한다. 이 접근 방식은 비용이 많이 드는 소프트웨어 및 장비 없이도 매우 비용 효율적이고 배우기 쉽고 운동 행동을 정확하게 측정할 수 있습니다. 이 방법이 다른 초파리와 유사한 동물 모델, 심지어 쥐와 생쥐와 같은 더 큰 동물까지 편리하게 확장될 수 있다는 것은 의심의 여지가 없습니다. AnimalTracker API의 구조는 독립적인 ImageJ 애플리케이션 또는 플러그인을 통해 쉽게 확장할 수 있으며, 맞춤형 행동 연구 및 분석을 위한 다양한 유용한 툴킷을 제공합니다24. 그럼에도 불구하고 이 연구에는 몇 가지 제한 사항이 있습니다. 이미지 녹화를 위해 오픈 필드 경기장에 단일 플라이를 배치하고 비디오 추적이 개별적으로 수행되기 때문에이 방법은 비효율적이고 시간이 많이 걸립니다. 여러 경기장을 동시에 녹화할 수 있는 용량을 확장하여 최대 6개의 개별 녹화를 허용했습니다. 이론적으로 더 많은 수의 초파리를 동시에 기록하는 것이 가능합니다. 이것은 경기장의 크기와 카메라 구성에 따라 다릅니다. 또는 사용자가 그룹화된 초파리를 기록하는 것으로 확장하려는 경우 제한된 수의 단일 기록과 파리 간의 충돌 및 겹침을 식별하기에 충분한 품질의 구성을 고려하는 것이 좋습니다. 기계 학습에 의한 테스트 효율성의 향상은 ID를 시각적으로 구별하고 모델을 정확하게 추적하기 위해 현재 시스템과 통합할 수 있는 저렴하고 호환 가능한 접근 방식이 파악되지 않았기 때문에 연구에서 고려되지 않았습니다.
요약하면, 여기에 설명된 방법은 시간 소비를 줄이고 유충 및 성충 단계에서 초파리 운동을 정량적으로 표시하고 분석하기 위한 실험 기술을 개선하도록 설계된 무료 오픈 소스 소프트웨어를 기반으로 효율적이고 간단한 접근 방식을 개발하고 검증합니다. 체계적인 분석을 통해 이 방법은 이동 중 시간이 지남에 따라 동물의 속도가 어떻게 변하는지와 방향 선택의 특성을 이해하는 데 도움이 될 수 있습니다. 따라서 일반적으로 사용되는 디지털 장치에 오픈 소스 소프트웨어를 통합하면 다양한 비행 모델에서 운동 활동을 테스트할 수 있는 신뢰할 수 있는 방법이 제공됩니다. 이것은 초파리 및 다른 동물의 약리학적 치료 및 형질전환 변형에서 파생된 신경퇴행성 질환 모델을 테스트할 때 생리학적 및 병리학적 운동 출력을 평가하는 데 유용할 수 있습니다.
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Disclosures
저자는 경쟁하는 재정적 이익이 없다고 선언합니다.
Acknowledgments
이 연구는 Soochow University와 중국 국립 과학 재단 (NSFC) (82171414)의 특별 출시 기금으로 지원되었습니다. Chunfeng Liu 교수의 연구실 구성원들의 토론과 의견에 감사드립니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Animal tracker | Hungarian Brain Research Program | version: 1.7 | pfficial website: http://animaltracker.elte.hu/main/downloads |
| Camera software | Microsoft | version: 2021.105.10.0 | built-in windows 10 system |
| Computer | DELL | Vostro-14-5480 | a comupter running win 10 system is available |
| Drosophila carbon dioxide anesthesia workstation | Wu han Yihong technology | #YHDFPCO2-018 | official website: http://www.yhkjwh.com/ |
| Fiji software | Fiji team | version: 1.53v | official website: https://fiji.sc/ |
| Format factory software | Pcfreetime | version: X64 5.4.5 | official website: http://www.pcfreetime.com/formatfactory/CN/index.html |
| Graph pad prism | GraphPad Software | version: 8.0.2 | official website: https://www.graphpad-prism.cn |
| Hight definition camera | TTQ | Jingwang2 (HD1080P F1.6 6-60mm) | official website: http://www.ttq100.com/product_show.php?id=35 |
| Office software | Microsoft | version: office 2019 | official website: https://www.microsoftstore.com.cn/software/office |
| Petri dish | Bkman | 110301003 | size: 60 mm |
| Silica gel | DOW | SYLGARD 184 Silicone Elastomer Kit | Mix well according to the instructions |
| Sodium bicarbonate | Macklin | #144-55-8 | Mix well with silica gel |
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