Imagerie chimique bioorthogonale du métabolisme cellulaire régulé par les acides aminés aromatiques
Summary
Nous présentons un protocole pour visualiser directement les activités métaboliques dans les cellules régulées par les acides aminés à l’aide de la microscopie à diffusion Raman stimulée sondée (DO-SRS) à oxyde de deutérium (eau lourde D2O), intégrée à la microscopie à fluorescence d’excitation à deux photons (2PEF).
Abstract
Les acides aminés aromatiques essentiels (AAA) sont des éléments constitutifs pour synthétiser de nouvelles biomasses dans les cellules et maintenir des fonctions biologiques normales. Par exemple, un approvisionnement abondant en AAA est important pour que les cellules cancéreuses maintiennent leur croissance et leur division rapides. Avec cela, il y a une demande croissante pour une approche d’imagerie hautement spécifique et non invasive avec une préparation minimale des échantillons pour visualiser directement comment les cellules exploitent les AAA pour leur métabolisme in situ. Ici, nous développons une plate-forme d’imagerie optique qui combine le sondage d’oxyde de deutérium (D2O) avec la diffusion Raman stimulée (DO-SRS) et intègre DO-SRS avec fluorescence d’excitation à deux photons (2PEF) dans un seul microscope pour visualiser directement les activités métaboliques des cellules HeLa sous régulation AAA. Collectivement, la plateforme DO-SRS fournit une résolution spatiale et une spécificité élevées des protéines et des lipides nouvellement synthétisés dans des unités cellulaires HeLa uniques. En outre, la modalité 2PEF peut détecter les signaux d’autofluorescence du nicotinamide adénine dinucléotide (NADH) et de la flavine d’une manière sans marqueur. Le système d’imagerie décrit ici est compatible avec les modèles in vitro et in vivo , ce qui est flexible pour diverses expériences. Le flux de travail général de ce protocole comprend la culture cellulaire, la préparation des milieux de culture, la synchronisation cellulaire, la fixation cellulaire et l’imagerie d’échantillons avec les modalités DO-SRS et 2PEF.
Introduction
Étant des acides aminés aromatiques essentiels (AAA), la phénylalanine (Phe) et le tryptophane (Tryp) peuvent être absorbés par le corps humain pour synthétiser de nouvelles molécules pour maintenir des fonctions biologiques normales1. Phe est nécessaire pour la synthèse des protéines, de la mélanine et de la tyrosine, tandis que Tryp est nécessaire pour la synthèse de la mélatonine, de la sérotonine et de la niacine 2,3. Cependant, une consommation excessive de ces AAA peut réguler positivement la cible mammifère de la voie de la rapamycine (mTOR), inhiber la protéine kinase activée par l’AMP et interférer avec le métabolisme mitochondrial, modifiant collectivement la biosynthèse des macromolécules et conduisant à la production de précurseurs malins, tels que les espèces réactives de l’oxygène (ROS) dans les cellules saines 4,5,6. La visualisation directe de la dynamique métabolique altérée sous une régulation excessive des AAA est essentielle pour comprendre les rôles des AAA dans la promotion du développement du cancer et la croissance des cellules saines 7,8,9.
Les études traditionnelles de l’AAA reposent sur la chromatographie en phase gazeuse (CG)10. D’autres méthodes, telles que l’imagerie par résonance magnétique (IRM), ont des résolutions spatiales limitées, ce qui rend difficile l’analyse cellulaire et sous-cellulaire d’échantillons biologiques11. Récemment, la désorption/ionisation laser assistée par matrice (MALDI) a été développée pour élucider le rôle des AAA dans les synthèses lipidiques et protéiques dans la prolifération du cancer avec des biomarqueurs non invasifs12,13,14. Cependant, cette technique souffre encore de faibles profondeurs d’imagerie, d’une faible résolution spatiale et d’une préparation extensive des échantillons. Au niveau cellulaire, les isotopes stables non toxiques, tels que l’azote 15 et le carbone 13, peuvent être tracés avec l’imagerie multi-isotopique et la spectrométrie de masse d’ions secondaires à l’échelle nanométrique pour comprendre leur incorporation dans les macromolécules. Cependant, ces méthodes sont destructrices pour les échantillons biologiques vivants15,16. La microscopie à force atomique (AFM) est une autre technique puissante qui permet de visualiser la dynamique métabolique17. La vitesse lente de balayage pendant l’imagerie AFM, en revanche, peut provoquer une distorsion de l’image du résultat de la dérive thermique.
Nous avons développé une modalité d’imagerie biorthogonale non invasive en couplant la microscopie à diffusion Raman stimulée (DO-SRS) à l’oxyde de deutérium (D2O) et la microscopie à fluorescence à excitation à deux photons sans marquage (2PEF). Cette modalité permet d’obtenir une résolution spatiale et une spécificité chimique élevées lors de l’imagerie d’échantillons biologiques 18,19,20,21,22,23,24. Ce protocole introduit les applications de DO-SRS et 2PEF pour examiner la dynamique métabolique des changements de lipides, de protéines et de ratios redox au cours de la progression du cancer. D2Oétant une forme isotopique stable de l’eau, les biomolécules cellulaires peuvent être marquées avec du deutérium (D) en raison de sa compensation rapide avec l’eau corporelle totale dans les cellules, formant des liaisons carbone-deutérium (C-D) par échange enzymatique21. Les liaisons C-D dans les macromolécules nouvellement synthétisées, y compris les lipides, les protéines, l’ADN / ARN et les glucides, peuvent être détectées dans la région silencieuse cellulaire du spectre Raman 20,21,22,25,26,27. Avec deux impulsions laser synchronisées, les liaisons C-D des lipides et des protéines nouvellement synthétisés peuvent être affichées sur des cellules individuelles via l’imagerie hyperspectrale (HSI) sans les extraire ou les marquer avec des agents cytotoxiques. En outre, la microscopie SRS a la capacité de construire des modèles tridimensionnels (3D) de régions d’intérêt sélectionnées dans des échantillons biologiques en capturant et en combinant un ensemble d’images en coupe transversale22,26. Grâce à l’imagerie volumétrique hyperspectrale et 3D, DO-SRS peut obtenir des distributions spatiales de macromolécules nouvellement synthétisées dans des cellules individuelles, ainsi que le type d’organites qui facilitent le processus de promotion de la croissance du cancer en vertu de la réglementation AAA22. De plus, en utilisant 2PEF, nous pouvons obtenir des signaux d’autofluorescence de flavine et de nicotinamide adénine dinucléotide (NADH) avec une haute résolution, une profondeur de pénétration profonde et des dommages de faible niveau dans des échantillons biologiques21,23,24. Les signaux d’autofluorescence flavine et NADH ont été utilisés pour caractériser l’homéostasie redox et la peroxydation lipidique dans les cellules cancéreuses22,26. En tant que tel, non seulement le couplage de DO-SRS et 2PEF fournit une analyse subcellulaire de la dynamique métabolique régulée par l’AAA dans les cellules cancéreuses avec une distribution spatiale élevée, des informations de spécificité chimique et une préparation minimale des échantillons, mais la méthode réduit également le besoin d’extraire ou de marquer des molécules endogènes avec des réactifs toxiques. Dans ce protocole, nous présentons d’abord les procédures de préparation de D2O et d’acides aminés, ainsi que la culture de cellules cancéreuses. Ensuite, nous montrons les protocoles d’imagerie DO-SRS et d’imagerie 2PEF. Enfin, nous présentons les résultats représentatifs de l’imagerie SRS et 2PEF, qui démontrent des changements métaboliques régulés par l’AAA des lipides et des protéines, et des changements de ratio redox dans les cellules cancéreuses. Une illustration détaillée du processus est mise en évidence à la figure 1.
Protocol
Representative Results
Discussion
L’imagerie DO-SRS et 2PEF a été appliquée pour étudier la dynamique métabolique dans divers modèles ex vivo, y compris la drosophile et les tissus humains 21,22,23,24,26,27,33. La modalité d’imagerie utilisée dans cette étude intègre la microscopie DO-SRS et 2PEF, qui …
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nous remercions le Dr Yajuan Li et Anthony Fung pour leur soutien technique, et le laboratoire Fraley pour la lignée cellulaire. Nous reconnaissons les fonds de démarrage de UCSD, NIH U54CA132378, NIH 5R01NS111039, NIH R21NS125395, NIHU54DK134301, NIHU54 HL165443 et Hellman Fellow Award.
Materials
| 10 mL Serological Pipettes | Avantor (by VWR) | 75816-100 | https://us.vwr.com/store/product?keyword=75816-100 |
| 15 mL Conical Centrifuge Tube | VWR | 89039-664 | https://mms.mckesson.com/product/1001859/VWR-International-89039-664 |
| 16% Formaldehyde, Methanol-free | ThermoFisher Scientific | 28906 | https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/28906 |
| 24-well plate | Fisherbrand | FB0112929 | https://www.fishersci.com/shop/products/24-well-tc-multidish-100-cs/FB012929#?keyword=FB012929 |
| 25 mm Syringe Filter, 2 μm PES | Foxx Life Sciences | 381-2216-OEM | https://www.foxxlifesciences.com/collections/pes-syringe-filters/products/381-2216-oem?variant=16274336003 |
| 460 nm Filter Cube | Olympus | OCT-ET460/50M32 | |
| AC Adapters of the Power Supply for LD OBIS 6 Laser Remote | Olympus | Supply power to the laser | |
| Band-pass Filter | KR Electronics | KR2724 | 8 MHz |
| BNC 50 Ohm Terminator | Mini Circuits | STRM-50 | |
| BNC Cable | Thorlabs | 2249-C | Coaxial Cable, BNC Male/Male |
| Broadband Dielectric Mirror | Thorlabs | BB1-E03 | 750 – 1100 nm |
| Centrifuge | |||
| Condenser | Olympus | ||
| Cover Glass | Corning | 2850-25 | https://ecatalog.corning.com/life-sciences/b2b/NL/en/Glassware/Cover-Glass/Corning%C2%AE-Square-%231%C2%BD-Cover-Glass/p/2850-25 |
| DC power supply | TopWard | 6302D | |
| Dichroic Mount | Thorlabs | KM100CL | |
| Dimethyl Sulfoxide Cell Culture Reagent | mpbio | 196055 | https://www.mpbio.com/0219605525-dimethyl-sulfoxide-cf |
| Dulbecco's Modified Eagle’s Medium without Methionine, Threonine, and Sodium Pyruvate | MilliporeSigma | 38210000 | https://www.usbio.net/media/D9800-22/dulbeccorsquos-mem-dmem-wsodium-bicarbonate-wo-methionine-threonine-sodium-pyruvate-powder With Sodium Bicarbonate and without Methionine, Threonine, and Sodium Pyruvate |
| Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium | Corning | MT10027CV | https://www.fishersci.com/shop/products/dmem-dulbecco-s-modified-eagle-s-medium-4/MT10027CV#:~:text=Dulbecco's%20Modified%20Eagle's%20Medium%20 |
| FIJI ImageJ | ImageJ | Version 1.53t 24 August 2022 | https://imagej.net/software/fiji/downloads |
| Heavy Water (Deuterium Oxide) | Cambridge Isotope Laboratories, Inc. | 7732-18-5 | https://shop.isotope.com/productdetails.aspx?itemno=DLM-4-1L |
| Hela Cells | ATCC | CCL-2 | https://www.atcc.org/products/ccl-2 |
| Hemocymeter | MilliporeSigma | Z359629-1EA | https://www.sigmaaldrich.com/US/en/product/sigma/z359629?gclid=Cj0KCQiA37KbBhDgARIsAI zce15A5FIy0WS7I6ec2KVk QPXVMEqlAnYis_bKB6P6lr SIZ-wAXOyAELIaAhhEEAL w_wcB&gclsrc=aw.ds |
| High O.D. Bandpass Filter | Chroma Technology | ET890/220m | Filter the Stokes beam and transmit the pump beam |
| HyClone Fetal Bovine Serum (FBS) | Cytiva | SH300880340 | https://www.fishersci.com/shop/products/hyclone-fetal-bovine-serum-u-s-standard-4/SH300880340 |
| HyClone Trypsin 0.25% (1x) Solution | Cytiva | SH30042.02 | https://www.cytivalifesciences.com/en/us/shop/cell-culture-and-fermentation/reagents-and-supplements/cell-disassociation-reagents/hyclone-trypsin-protease-p-00445 |
| Integrated SRS Laser System | Applied Physics & Electronics, Inc. | picoEMERALD | picoEMERALD provides an output pulse at 1031 nm with 6-ps pulse width and 80-MHz repetition rate, which serves as the Stokes beam. The frequency doubled beam at 532 nm is used to synchronously seed a picosecond optical parametric oscillator (OPO) to produce a mode-locked pulse train with five~6 ps pulse width (the idler beam of the OPO is blocked with an,interferometric filter). The output wavelength of the OPO is tunable from 720–950 nm, which serves as the pump beam. The intensity of the 1031 nm Stokes beam is modulated sinusoidally by a built-in EOM at 8 MHz with a modulation depth of more than 90%. The pump beam is spatially overlapped with the Stokes beam by using a dichroic mirror inside picoEMERALD. The temporal overlap between pump and Stokes pulses are achieved with a built-in delay stage and optimized by the SRS signal of pure D2O at the microscope. |
| Inverted Laser-scanning Microscope | Olympus | FV1200MPE | |
| IX3-CBH Control box | Olympus | Control the laser-scanning microscope | |
| Kinematic Mirror Mount | Thorlabs | POLARIS-K1-2AH | 2 Low-Profile Hex Adjusters |
| L-Phenalynine | Sigma | P5482-25G | https://www.sigmaaldrich.com/US/en/product/sigma/p5482 |
| L-Tryptophan | Sigma | T8941-25G | https://www.sigmaaldrich.com/US/en/product/sigma/t8941 |
| LabSpec 6 | Horiba XploRA | N/A | https://www.horiba.com/gbr/scientific/products/detail/action/show/Product/labspec-6-spectroscopy-suite-software-1843/ |
| Lock-In Amplifier | Zurich Instruments | N/A | https://www.zhinst.com/americas/en/products/shfli-lock-in-amplifier |
| Long-pass Dichroic Beam Splitter | Semrock | Di02-R980-25×36 | 980 nm laser BrightLine single-edge laser-flat dichroic beamsplitter |
| MATLAB | MathWorks | Version: R2022b | https://www.mathworks.com/products/new_products/latest_features.html |
| Microscope Slides | Fisherbrand | 12-550-003 | https://www.fishersci.com/shop/products/fisherbrand-selectfrost-microscope-slides-9/12550003#?keyword=12-550-003 |
| Microscopy Imaging Software | Olympus | FluoView | |
| MPLN 100x, Olympus | Olympus | MPLAPON | https://www.olympus-ims.com/en/microscope/mplapon/#!cms[focus]=cmsContent11364 |
| MPLN 50x, Olympus | Olympus | MPLAPON | https://www.olympus-ims.com/en/microscope/mplapon/#!cms[focus]=cmsContent11363 |
| NA Oil Condenser | Olympus | 6-U130 | https://www.hitechinstruments.com/Product-Details/olympus-achromatic-aplanatic-high-na-condneser |
| Nail Polish | Wet n Wild | B01EO2G5O4 | https://www.amazon.com/dp/B01EO2G5O4/ref=cm_sw_r_api_i_E609VVDWW HHQP38FXXDC_0 |
| Origin | OriginLab | Origin 2022b (9.95) | https://www.originlab.com/index.aspx?go=PRODUCTS/Origin |
| Parafilm | Fisher Scientific | S37440 | https://www.fishersci.com/shop/products/parafilm-m-wrapping-film-3/p-2379782 |
| PBS 1x (Dulbecco's Phosphate Buffered Saline) | Thermofischer – Gibco | 14040117 | https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/14040117?SID=srch-hj-14040117 |
| Penicillin/Streptomycin | Thermofischer – Gibco | 15140122 | https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/15140122 |
| Periscope Assembly | Thorlabs | RS99 | Includes the top and bottom units, Ø1" post, and clamping fork. |
| picoEmerald System | A.P.E | N/A | https://www.ape-berlin.de/en/cars-srs/ |
| Shielded Box with BNC Connectors | Pomona Electronics | 2902 | Aluminum Box with Cover, BNC Female/Female |
| Si Photodiode Detector | Home Built | N/A | DYI series |
| Silicon Wafer | |||
| Spacers | Grace Bio-Labs | 654008 | https://gracebio.com/product/secureseal-imaging-spacers-654008/ |
| Spontaneous Raman spectroscopy | Horiba XploRA | N/A | https://www.horiba.com/int/products/detail/action/show/Product/xploratm-plus-1528/ |
| Stimulated Raman Scattering Microscopy | Home Built | N/A | |
| Touch Panel Controller | Olympus | Control the X-Y direction of the laser-scanning microscope | |
| Trypan Blue 0.4% (0.85% NaCl) | Lonza | 17-942E | https://bioscience.lonza.com/lonza_bs/US/en/Culture-Media-and-Reagents/p/000000000000181876/Trypan-Blue%2C-0-4%25-Solution" |
| Tweezers | Kaverme – Amazon | B07RNVXXV1 | https://www.amazon.com/Precision-Anti-Static-Electronics-Laboratory-Jewelry-Making/dp/B07RNVXXV1" |
| Two Photon Excitation Fluorescence Microscopy | Home Built | N/A | |
| Weighing Paper | VWR | 12578-165 | https://us.vwr.com/store/product/4597617/vwr-weighing-paper |
| Zurich LabOneQ Software | Zurich Instruments | Control the Zurich lock-in amplifier |
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