Bioorthogonale chemische Bildgebung des Zellstoffwechsels, der durch aromatische Aminosäuren reguliert wird
Summary
Wir stellen ein Protokoll vor, um metabolische Aktivitäten in Zellen, die durch Aminosäuren reguliert werden, direkt sichtbar zu machen, indem wir Deuteriumoxid (schweres Wasser D2O) mit sondierter stimulierter Raman-Streuung (DO-SRS) verwenden, die in die Zwei-Photonen-Anregungsfluoreszenzmikroskopie (2PEF) integriert ist.
Abstract
Essentielle aromatische Aminosäuren (AAAs) sind Bausteine für die Synthese neuer Biomassen in Zellen und die Aufrechterhaltung normaler biologischer Funktionen. Zum Beispiel ist ein reichliches Angebot an AAAs für Krebszellen wichtig, um ihr schnelles Wachstum und ihre Teilung aufrechtzuerhalten. Damit steigt die Nachfrage nach einem hochspezifischen, nicht-invasiven Bildgebungsansatz mit minimaler Probenvorbereitung, um direkt zu visualisieren, wie Zellen AAAs für ihren Stoffwechsel in situ nutzen. Hier entwickeln wir eine optische Bildgebungsplattform, die Deuteriumoxid (D2O)-Sondierung mit stimulierter Raman-Streuung (DO-SRS) kombiniert und DO-SRS mit Zwei-Photonen-Anregungsfluoreszenz (2PEF) in ein einziges Mikroskop integriert, um die Stoffwechselaktivitäten von HeLa-Zellen unter AAA-Regulierung direkt sichtbar zu machen. Insgesamt bietet die DO-SRS-Plattform eine hohe räumliche Auflösung und Spezifität von neu synthetisierten Proteinen und Lipiden in einzelnen HeLa-Zelleinheiten. Darüber hinaus kann die 2PEF-Modalität Autofluoreszenzsignale von Nicotinamid-Adenin-Dinukleotid (NADH) und Flavin markierungsfrei detektieren. Das hier beschriebene Bildgebungssystem ist sowohl mit In-vitro- als auch mit In-vivo-Modellen kompatibel, was für verschiedene Experimente flexibel ist. Der allgemeine Arbeitsablauf dieses Protokolls umfasst Zellkultur, Nährmedienvorbereitung, Zellsynchronisation, Zellfixierung und Probenbildgebung mit DO-SRS- und 2PEF-Modalitäten.
Introduction
Als essentielle aromatische Aminosäuren (AAAs) können Phenylalanin (Phe) und Tryptophan (Tryp) vom menschlichen Körper aufgenommen werden, um neue Moleküle zur Aufrechterhaltung normaler biologischer Funktionen zu synthetisieren1. Phe wird für die Synthese von Proteinen, Melanin und Tyrosin benötigt, während Tryp für die Synthese von Melatonin, Serotonin und Niacinbenötigt wird 2,3. Ein übermäßiger Konsum dieser AAAs kann jedoch das Säugetierziel des Rapamycin-Signalwegs (mTOR) hochregulieren, die AMP-aktivierte Proteinkinase hemmen und in den mitochondrialen Stoffwechsel eingreifen, wodurch die Biosynthese von Makromolekülen kollektiv verändert und zur Produktion von bösartigen Vorläufern wie reaktiven Sauerstoffspezies (ROS) in gesunden Zellen geführt wird 4,5,6. Die direkte Visualisierung einer veränderten Stoffwechseldynamik unter übermäßiger AAA-Regulation ist unerlässlich, um die Rolle von AAAs bei der Förderung der Krebsentstehung und des Wachstums gesunder Zellen zu verstehen 7,8,9.
Herkömmliche AAA-Studien stützen sich auf die Gaschromatographie (GC)10. Andere Methoden, wie z. B. die Magnetresonanztomographie (MRT), haben eine begrenzte räumliche Auflösung, was die Durchführung zellulärer und subzellulärer Analysen biologischer Proben erschwert11. Kürzlich wurde die matrixgestützte Laserdesorption/Ionisation (MALDI) entwickelt, um die Rolle von AAAs bei der Lipid- und Proteinsynthese bei der Krebsproliferation mit nicht-invasiven Biomarkernaufzuklären 12,13,14. Diese Technik leidet jedoch immer noch unter geringen Abbildungstiefen, schlechter räumlicher Auflösung und umfangreicher Probenvorbereitung. Auf zellulärer Ebene können ungiftige stabile Isotope wie Stickstoff-15 und Kohlenstoff-13 mit Multi-Isotopen-Bildgebung und nanoskaliger Sekundärionen-Massenspektrometrie aufgespürt werden, um ihren Einbau in Makromoleküle zu verstehen. Diese Methoden sind jedoch zerstörerisch für lebende biologische Proben15,16. Die Rasterkraftmikroskopie (AFM) ist eine weitere leistungsstarke Technik, mit der die Stoffwechseldynamik sichtbar gemacht werden kann17. Die langsame Abtastrate während der AFM-Bildgebung kann hingegen zu einer Bildverzerrung des Ergebnisses durch thermische Drift führen.
Wir haben eine nicht-invasive biorthogonale Bildgebungsmodalität entwickelt, indem wir Deuteriumoxid (D2O)-Sonden-stimulierte Raman-Streumikroskopie (DO-SRS) und markierungsfreie Zwei-Photonen-Anregungsfluoreszenzmikroskopie (2PEF) gekoppelt haben. Diese Modalität erreicht eine hohe räumliche Auflösung und chemische Spezifität bei der Abbildung biologischer Proben 18,19,20,21,22,23,24. Dieses Protokoll stellt die Anwendungen von DO-SRS und 2PEF vor, um die metabolische Dynamik von Änderungen des Lipid-, Protein- und Redoxverhältnisses während des Fortschreitens von Krebs zu untersuchen. Da es sich beiD2Oum eine stabile Isotopenform von Wasser handelt, können zelluläre Biomoleküle mit Deuterium (D) markiert werden, da es schnell mit dem gesamten Körperwasser in den Zellen kompensiert wird und Kohlenstoff-Deuterium (C-D)-Bindungen (C-D) durch enzymatischen Austausch bildet21. Die C-D-Bindungen in neu synthetisierten Makromolekülen, einschließlich Lipiden, Proteinen, DNA/RNA und Kohlenhydraten, können in der stillen zellulären Region des Raman-Spektrumsnachgewiesen werden 20,21,22,25,26,27. Mit zwei synchronisierten Laserpulsen können C-D-Bindungen von neu synthetisierten Lipiden und Proteinen mittels hyperspektraler Bildgebung (HSI) auf einzelnen Zellen dargestellt werden, ohne dass sie extrahiert oder mit zytotoxischen Wirkstoffen markiert werden müssen. Darüber hinaus ist die SRS-Mikroskopie in der Lage, dreidimensionale (3D) Modelle ausgewählter Regionen von Interesse in biologischen Proben zu erstellen, indem eine Reihe von Querschnittsbildern aufgenommen und kombiniert wird22,26. Mit hyperspektraler und volumetrischer 3D-Bildgebung kann DO-SRS räumliche Verteilungen von neu synthetisierten Makromolekülen in einzelnen Zellen erhalten, zusammen mit der Art von Organellen, die den Prozess der Förderung des Krebswachstums gemäß AAA-Regulation22 erleichtern. Darüber hinaus können wir mit 2PEF Autofluoreszenzsignale von Flavin und Nicotinamid-Adenin-Dinukleotid (NADH) mit hoher Auflösung, tiefer Eindringtiefe und geringer Schädigung in biologischen Proben erhalten21,23,24. Flavin- und NADH-Autofluoreszenzsignale wurden verwendet, um die Redoxhomöostase und Lipidperoxidation in Krebszellen zu charakterisieren22,26. Die Kopplung von DO-SRS und 2PEF ermöglicht somit nicht nur eine subzelluläre Analyse der AAA-regulierten Stoffwechseldynamik in Krebszellen mit hoher räumlicher Verteilung, chemischen Spezifitätsinformationen und minimaler Probenvorbereitung, sondern reduziert auch die Notwendigkeit, endogene Moleküle mit toxischen Reagenzien zu extrahieren oder zu markieren. In diesem Protokoll stellen wir zunächst die Verfahren derD2O– und Aminosäurepräparation sowie der Krebszellkultur vor. Anschließend zeigen wir die Protokolle der DO-SRS-Bildgebung und der 2PEF-Bildgebung. Abschließend präsentieren wir die repräsentativen Ergebnisse der SRS- und 2PEF-Bildgebung, die AAA-regulierte metabolische Veränderungen von Lipiden und Proteinen sowie Änderungen des Redoxverhältnisses in Krebszellen zeigen. Eine detaillierte Darstellung des Prozesses ist in Abbildung 1 dargestellt.
Protocol
Representative Results
Discussion
DO-SRS- und 2PEF-Bildgebung wurden eingesetzt, um die Stoffwechseldynamik in verschiedenen Ex-vivo-Modellen zu untersuchen, darunter Drosophila und menschliches Gewebe 21,22,23,24,26,27,33. Die in dieser Studie verwendete Bildgebungsmodalität integriert DO-SRS und 2PEF-Mikroskopie,…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir danken Dr. Yajuan Li und Anthony Fung für ihre technische Unterstützung und dem Fraley-Labor für die Zelllinie. Wir bedanken uns für die Anschubfinanzierung von UCSD, NIH U54CA132378, NIH 5R01NS111039, NIH R21NS125395, NIHU54DK134301, NIHU54 HL165443 und Hellman Fellow Award.
Materials
| 10 mL Serological Pipettes | Avantor (by VWR) | 75816-100 | https://us.vwr.com/store/product?keyword=75816-100 |
| 15 mL Conical Centrifuge Tube | VWR | 89039-664 | https://mms.mckesson.com/product/1001859/VWR-International-89039-664 |
| 16% Formaldehyde, Methanol-free | ThermoFisher Scientific | 28906 | https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/28906 |
| 24-well plate | Fisherbrand | FB0112929 | https://www.fishersci.com/shop/products/24-well-tc-multidish-100-cs/FB012929#?keyword=FB012929 |
| 25 mm Syringe Filter, 2 μm PES | Foxx Life Sciences | 381-2216-OEM | https://www.foxxlifesciences.com/collections/pes-syringe-filters/products/381-2216-oem?variant=16274336003 |
| 460 nm Filter Cube | Olympus | OCT-ET460/50M32 | |
| AC Adapters of the Power Supply for LD OBIS 6 Laser Remote | Olympus | Supply power to the laser | |
| Band-pass Filter | KR Electronics | KR2724 | 8 MHz |
| BNC 50 Ohm Terminator | Mini Circuits | STRM-50 | |
| BNC Cable | Thorlabs | 2249-C | Coaxial Cable, BNC Male/Male |
| Broadband Dielectric Mirror | Thorlabs | BB1-E03 | 750 – 1100 nm |
| Centrifuge | |||
| Condenser | Olympus | ||
| Cover Glass | Corning | 2850-25 | https://ecatalog.corning.com/life-sciences/b2b/NL/en/Glassware/Cover-Glass/Corning%C2%AE-Square-%231%C2%BD-Cover-Glass/p/2850-25 |
| DC power supply | TopWard | 6302D | |
| Dichroic Mount | Thorlabs | KM100CL | |
| Dimethyl Sulfoxide Cell Culture Reagent | mpbio | 196055 | https://www.mpbio.com/0219605525-dimethyl-sulfoxide-cf |
| Dulbecco's Modified Eagle’s Medium without Methionine, Threonine, and Sodium Pyruvate | MilliporeSigma | 38210000 | https://www.usbio.net/media/D9800-22/dulbeccorsquos-mem-dmem-wsodium-bicarbonate-wo-methionine-threonine-sodium-pyruvate-powder With Sodium Bicarbonate and without Methionine, Threonine, and Sodium Pyruvate |
| Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium | Corning | MT10027CV | https://www.fishersci.com/shop/products/dmem-dulbecco-s-modified-eagle-s-medium-4/MT10027CV#:~:text=Dulbecco's%20Modified%20Eagle's%20Medium%20 |
| FIJI ImageJ | ImageJ | Version 1.53t 24 August 2022 | https://imagej.net/software/fiji/downloads |
| Heavy Water (Deuterium Oxide) | Cambridge Isotope Laboratories, Inc. | 7732-18-5 | https://shop.isotope.com/productdetails.aspx?itemno=DLM-4-1L |
| Hela Cells | ATCC | CCL-2 | https://www.atcc.org/products/ccl-2 |
| Hemocymeter | MilliporeSigma | Z359629-1EA | https://www.sigmaaldrich.com/US/en/product/sigma/z359629?gclid=Cj0KCQiA37KbBhDgARIsAI zce15A5FIy0WS7I6ec2KVk QPXVMEqlAnYis_bKB6P6lr SIZ-wAXOyAELIaAhhEEAL w_wcB&gclsrc=aw.ds |
| High O.D. Bandpass Filter | Chroma Technology | ET890/220m | Filter the Stokes beam and transmit the pump beam |
| HyClone Fetal Bovine Serum (FBS) | Cytiva | SH300880340 | https://www.fishersci.com/shop/products/hyclone-fetal-bovine-serum-u-s-standard-4/SH300880340 |
| HyClone Trypsin 0.25% (1x) Solution | Cytiva | SH30042.02 | https://www.cytivalifesciences.com/en/us/shop/cell-culture-and-fermentation/reagents-and-supplements/cell-disassociation-reagents/hyclone-trypsin-protease-p-00445 |
| Integrated SRS Laser System | Applied Physics & Electronics, Inc. | picoEMERALD | picoEMERALD provides an output pulse at 1031 nm with 6-ps pulse width and 80-MHz repetition rate, which serves as the Stokes beam. The frequency doubled beam at 532 nm is used to synchronously seed a picosecond optical parametric oscillator (OPO) to produce a mode-locked pulse train with five~6 ps pulse width (the idler beam of the OPO is blocked with an,interferometric filter). The output wavelength of the OPO is tunable from 720–950 nm, which serves as the pump beam. The intensity of the 1031 nm Stokes beam is modulated sinusoidally by a built-in EOM at 8 MHz with a modulation depth of more than 90%. The pump beam is spatially overlapped with the Stokes beam by using a dichroic mirror inside picoEMERALD. The temporal overlap between pump and Stokes pulses are achieved with a built-in delay stage and optimized by the SRS signal of pure D2O at the microscope. |
| Inverted Laser-scanning Microscope | Olympus | FV1200MPE | |
| IX3-CBH Control box | Olympus | Control the laser-scanning microscope | |
| Kinematic Mirror Mount | Thorlabs | POLARIS-K1-2AH | 2 Low-Profile Hex Adjusters |
| L-Phenalynine | Sigma | P5482-25G | https://www.sigmaaldrich.com/US/en/product/sigma/p5482 |
| L-Tryptophan | Sigma | T8941-25G | https://www.sigmaaldrich.com/US/en/product/sigma/t8941 |
| LabSpec 6 | Horiba XploRA | N/A | https://www.horiba.com/gbr/scientific/products/detail/action/show/Product/labspec-6-spectroscopy-suite-software-1843/ |
| Lock-In Amplifier | Zurich Instruments | N/A | https://www.zhinst.com/americas/en/products/shfli-lock-in-amplifier |
| Long-pass Dichroic Beam Splitter | Semrock | Di02-R980-25×36 | 980 nm laser BrightLine single-edge laser-flat dichroic beamsplitter |
| MATLAB | MathWorks | Version: R2022b | https://www.mathworks.com/products/new_products/latest_features.html |
| Microscope Slides | Fisherbrand | 12-550-003 | https://www.fishersci.com/shop/products/fisherbrand-selectfrost-microscope-slides-9/12550003#?keyword=12-550-003 |
| Microscopy Imaging Software | Olympus | FluoView | |
| MPLN 100x, Olympus | Olympus | MPLAPON | https://www.olympus-ims.com/en/microscope/mplapon/#!cms[focus]=cmsContent11364 |
| MPLN 50x, Olympus | Olympus | MPLAPON | https://www.olympus-ims.com/en/microscope/mplapon/#!cms[focus]=cmsContent11363 |
| NA Oil Condenser | Olympus | 6-U130 | https://www.hitechinstruments.com/Product-Details/olympus-achromatic-aplanatic-high-na-condneser |
| Nail Polish | Wet n Wild | B01EO2G5O4 | https://www.amazon.com/dp/B01EO2G5O4/ref=cm_sw_r_api_i_E609VVDWW HHQP38FXXDC_0 |
| Origin | OriginLab | Origin 2022b (9.95) | https://www.originlab.com/index.aspx?go=PRODUCTS/Origin |
| Parafilm | Fisher Scientific | S37440 | https://www.fishersci.com/shop/products/parafilm-m-wrapping-film-3/p-2379782 |
| PBS 1x (Dulbecco's Phosphate Buffered Saline) | Thermofischer – Gibco | 14040117 | https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/14040117?SID=srch-hj-14040117 |
| Penicillin/Streptomycin | Thermofischer – Gibco | 15140122 | https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/15140122 |
| Periscope Assembly | Thorlabs | RS99 | Includes the top and bottom units, Ø1" post, and clamping fork. |
| picoEmerald System | A.P.E | N/A | https://www.ape-berlin.de/en/cars-srs/ |
| Shielded Box with BNC Connectors | Pomona Electronics | 2902 | Aluminum Box with Cover, BNC Female/Female |
| Si Photodiode Detector | Home Built | N/A | DYI series |
| Silicon Wafer | |||
| Spacers | Grace Bio-Labs | 654008 | https://gracebio.com/product/secureseal-imaging-spacers-654008/ |
| Spontaneous Raman spectroscopy | Horiba XploRA | N/A | https://www.horiba.com/int/products/detail/action/show/Product/xploratm-plus-1528/ |
| Stimulated Raman Scattering Microscopy | Home Built | N/A | |
| Touch Panel Controller | Olympus | Control the X-Y direction of the laser-scanning microscope | |
| Trypan Blue 0.4% (0.85% NaCl) | Lonza | 17-942E | https://bioscience.lonza.com/lonza_bs/US/en/Culture-Media-and-Reagents/p/000000000000181876/Trypan-Blue%2C-0-4%25-Solution" |
| Tweezers | Kaverme – Amazon | B07RNVXXV1 | https://www.amazon.com/Precision-Anti-Static-Electronics-Laboratory-Jewelry-Making/dp/B07RNVXXV1" |
| Two Photon Excitation Fluorescence Microscopy | Home Built | N/A | |
| Weighing Paper | VWR | 12578-165 | https://us.vwr.com/store/product/4597617/vwr-weighing-paper |
| Zurich LabOneQ Software | Zurich Instruments | Control the Zurich lock-in amplifier |
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