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Immunology and Infection

वास्तविक समय में जीका वायरस अवरोधकों का मूल्यांकन करने के लिए सेल-आधारित विद्युत प्रतिबाधा मंच

Published: March 24, 2023 doi: 10.3791/65149
Automatic Translation
1, 1, 1
1Department of Microbiology, Immunology and Transplantation, Rega Institute for Medical Research, Laboratory of Virology and Chemotherapy, KU Leuven

Summary

यहां, हम वास्तविक समय में मानव कोशिकाओं में जीका वायरस संक्रमण और प्रतिकृति का अध्ययन करने के लिए एक बहुत ही आसान और सरल विधि के रूप में सेल-आधारित विद्युत प्रतिबाधा (सीईआई) के उपयोग का प्रदर्शन करते हैं। इसके अलावा, सीईआई परख एंटीवायरल यौगिकों के मूल्यांकन के लिए उपयोगी है।

Abstract

सेल-आधारित विद्युत प्रतिबाधा (सीईआई) प्रौद्योगिकी इलेक्ट्रोड के साथ एम्बेडेड कल्चर प्लेट कुओं पर बढ़ते या हेरफेर किए गए अनुयायी सेल मोनोलेयर के कारण प्रतिबाधा में परिवर्तन को मापती है। प्रौद्योगिकी का उपयोग वास्तविक समय में जीका वायरस (जेडआईकेवी) संक्रमण और अनुयायी सेल प्रतिकृति के परिणामों की निगरानी के लिए किया जा सकता है, क्योंकि यह वायरस अत्यधिक साइटोपैथोजेनिक है। यह एक सीधी परख है जिसे लेबल या आक्रामक तरीकों के उपयोग की आवश्यकता नहीं होती है और वास्तविक समय डेटा प्रदान करने का लाभ होता है। जेडआईकेवी संक्रमण के कैनेटीक्स नियोजित सेल लाइन, वायरस स्ट्रेन, और संक्रमण की बहुलता (एमओआई) पर अत्यधिक निर्भर हैं, जिन्हें पारंपरिक समापन बिंदु परख के साथ आसानी से अध्ययन नहीं किया जा सकता है। इसके अलावा, सीईआई परख का उपयोग एंटीवायरल यौगिकों के मूल्यांकन और लक्षण वर्णन के लिए भी किया जा सकता है, जिसमें संक्रमण के दौरान गतिशील निरोधात्मक गुण भी हो सकते हैं। यह विधि लेख सीईआई परख के व्यावहारिक निष्पादन और सामान्य रूप से जेडआईकेवी अनुसंधान और एंटीवायरल अनुसंधान में इसके संभावित अनुप्रयोगों का विस्तृत विवरण देता है।

Introduction

जीका वायरस (जेडआईकेवी) का प्रकोप गंभीर बीमारी जटिलताओं से जुड़ा हुआ है, जैसे कि माइक्रोसेफली और गुइलेन-बैरे सिंड्रोम 1,2,3। यद्यपि भविष्य की महामारियां विभिन्न जोखिम कारकों जैसे मच्छर वेक्टर वितरण और बढ़ते शहरीकरण के कारण प्रशंसनीय हैं, आज तक, किसी भी वैक्सीन या एंटीवायरल दवाने इसे अभी तक बाजार में नहीं बनाया है। इसलिए, पारंपरिक जेडआईकेवी अनुसंधान विधियों को इस वायरस और इसके संभावित एंटीवायरल यौगिकों का अध्ययन करने के लिए नए उपकरणों के साथ पूरक किया जाना चाहिए। एंटीवायरल अनुसंधान अक्सर फेनोटाइपिक परख पर आधारित होता है, जहां समापन बिंदु एक विशिष्ट पैरामीटर की उपस्थिति होती है, जैसे कि वायरस-प्रेरित साइटोपैथिक प्रभाव (सीपीई) की उपस्थिति या रिपोर्टर जीन 5,6,7 के माध्यम से किसी विशेष वायरस-प्रेरित प्रोटीन का उत्पादन। हालांकि, इन विधियों में एंडपॉइंट रीडआउट हैं, श्रम-गहन हैं, और जटिल विश्लेषण की आवश्यकता हो सकती है। इसलिए, प्रतिबाधा-आधारित विधियां एक आकर्षक विकल्प प्रदान करती हैं।

सेल-आधारित विद्युत प्रतिबाधा (सीईआई) को एक इलेक्ट्रोड से दूसरे इलेक्ट्रोड में वर्तमान प्रवाह के प्रतिरोध के रूप में परिभाषित किया गया है, जो इलेक्ट्रोड युक्त कुओं पर बीजित एक अनुयायी सेल परत के कारण होता है। इस पद्धति में नियोजित स्थापित सीईआई तकनीक इलेक्ट्रिक सेल-सब्सट्रेट इम्पीडेंस सेंसिंग (ईसीआईएस) है, जिसे मूल रूप से जियावर और कीज़ 8,9 द्वारा विकसित किया गया है। इसका उपयोग जैविक अनुसंधान डोमेन के व्यापक क्षेत्र में किया जाता है, जैसे कि कैंसर मेटास्टेसिस, विष विज्ञान, और घाव भरने10,11,12। इसका सिद्धांत एक विद्युत क्षेत्र पर निर्भर करता है जो आवृत्तियों13 की एक सीमा पर वैकल्पिक धारा (एसी) वोल्टेज की निरंतर सफाई से उत्पन्न होता है। कोशिकाओं को इन गैर-आक्रामक विद्युत क्षेत्रों के संपर्क में लाया जाता है, और पूर्व निर्धारित अंतराल पर, सेल वृद्धि या सेल पालन या आकृति विज्ञान में परिवर्तन के कारण प्रतिबाधा परिवर्तनको मापा जाता है। इसके अलावा, परिवर्तित सेल व्यवहार्यता भी प्रतिबाधा परिवर्तन की ओर ले जाती है, जिससे तकनीक साइटोपैथोजेनिक वायरस15,16,17 के साथ संक्रमण की निगरानी के लिए एक उपयोगी उपकरण बन जाती है। चूंकि नैनोस्केल रेंज में सेल परत के रूपात्मक परिवर्तनों का पता लगाया जाएगा, इसलिए तकनीक एक अत्यधिक संवेदनशील पहचान उपकरण प्रदान करती है। इस लेख में वर्णित सीईआई परख समय के साथ सेल परत के प्रतिबाधा परिवर्तनों को मापने के लिए एक आसान, गैर-आक्रामक, वास्तविक समय, लेबल-मुक्त विधि है।

हालांकि सीईआई का उपयोग जेडआईकेवी संक्रमण या इसके संभावित एंटीवायरल के पाठ्यक्रम का मूल्यांकन करने के लिए नहीं किया गया है, लेकिन नैदानिक उपकरण के रूप में इसके उपयोग कीजांच 18 से पहले की गई है। हाल के एक अध्ययन में, ए 549 कोशिकाओं में कई जेडआईकेवी अवरोधकों की एंटीवायरल गतिविधि को निर्धारित करने के लिए सीईआई परख का उपयोगपहली बार मान्य किया गया था। यह विधि लेख इस सीईआई परख का अधिक विस्तार से वर्णन करता है और इसे विभिन्न अनुयायी सेल लाइनों के साथ-साथ संक्रमण (एमओआई) की विभिन्न बहुलता पर विभिन्न प्रकार के जेडआईकेवी उपभेदों तक विस्तारित करता है। इसके द्वारा, फ्लेविवायरस एंटीवायरल अनुसंधान में इस विधि का बहुमुखी उपयोग प्रदर्शित किया जाता है। विधि में वास्तविक समय सेल निगरानी का महत्वपूर्ण लाभ है, जो संभावित एंटीवायरल यौगिकों द्वारा महत्वपूर्ण संक्रमण समय बिंदुओं और गतिशील अवरोधक गतिविधि का पता लगाने की अनुमति देता है। एक साथ लिया गया, सीईआई तकनीक एंटीवायरल पद्धतियों की वर्तमान श्रृंखला के पूरक के लिए एक शक्तिशाली और मूल्यवान उपकरण प्रदान करती है।

Protocol

वर्णित सभी कदम जैव सुरक्षा स्तर 2 प्रयोगशाला के एक लामिनर प्रवाह कैबिनेट में बाँझ परिस्थितियों में किए जाते हैं। बेल्जियम संस्थागत समीक्षा बोर्ड (डिपार्टमेंट लीफमिलियू, नाटुउर एन एनर्जी, प्रोटोकॉल एसबीबी 219 2011/0011) और केयू ल्यूवेन में जैव सुरक्षा समिति के नियमों के अनुसार, सभी उपयोग किए गए वायरस प्राप्त किए गए और अनुमोदित के रूप में उपयोग किए गए।

1. सेल संस्कृति रखरखाव

नोट: यह प्रोटोकॉल सेल लाइनों के चयन के साथ किया जाता है, लेकिन निश्चित रूप से किसी भी अनुयायी सेल लाइन के लिए अनुकूलित किया जा सकता है, केवल सेल सीडिंग घनत्व अनुकूलन की आवश्यकता होती है।

  1. ए 549 मानव फेफड़े के एडेनोकार्सिनोमा सेल लाइन, यू 87 मानव घातक ग्लियोब्लास्टोमा सेल लाइन, और टी 75 कल्चर फ्लास्क में एचईएल 299 मानव भ्रूण फेफड़े फाइब्रोब्लास्ट कोशिकाओं को 37 डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ2 में एक ह्यूमिडिफाइड इनक्यूबेटर में विकसित करें।
  2. 80% -95% कंफ्लुएंसी पर कोशिकाओं को उपसंस्कृति। कोशिकाओं की खेती से पहले सभी अभिकर्मकों को कमरे के तापमान (आरटी) पर होना चाहिए।
  3. कोशिकाओं से वातानुकूलित संस्कृति माध्यम को हटा दें। सेल मोनोलेयर को एक बार धोने के लिए डलबेकको के फॉस्फेट-बफर्ड सेलाइन (डीपीबीएस) के 5 एमएल का उपयोग करें।
  4. सेल मोनोलेयर पर समान रूप से 0.25% ट्रिप्सिन-एथिलीनडायमाइनटेट्राएसिटिक एसिड (ईडीटीए) के 1 एमएल वितरित करें। फिर, 37 डिग्री सेल्सियस पर 3 मिनट तक इनक्यूबेट करें जब तक कि कोशिकाएं अलग न होने लगें।
  5. ताजा पूर्ण विकास माध्यम के 9 एमएल जोड़ें (विवरण के लिए सामग्री की तालिका देखें)। कोशिकाओं को फिर से निलंबित करने के लिए पिपेट धीरे से ऊपर और नीचे।
  6. सेल निलंबन की वांछित मात्रा को एक नए टी 75 कल्चर फ्लास्क में स्थानांतरित करें और 15 एमएल की कुल मात्रा प्राप्त करने के लिए ताजा विकास माध्यम की उचित मात्रा जोड़ें।
    नोट: इस प्रोटोकॉल में उपयोग की जाने वाली इन विट्रो सेल लाइनों को आदर्श विकास स्थितियों की अनुमति देने के लिए विशिष्ट सेल लाइन के आधार पर 1: 4 से 1: 10 कमजोर पड़ने में उपसंस्कृति की जाती है। उपसंस्कृति हर 3-4 दिनों में की जाती है, इसलिए वांछित सेल निलंबन मात्रा इनक्यूबेशन दिनों की संख्या के आधार पर भी भिन्न हो सकती है।

2. सीईआई प्लेट की तैयारी

  1. इंटरडिजिटेटेड इलेक्ट्रोड के साथ एक 96-वेल प्लेट लें ( सामग्री की तालिका देखें) और सभी कुओं को 100 μL विकास संस्कृति माध्यम से भरें।
  2. डीपीबीएस के साथ कुओं के बीच रिक्त स्थान भरें।
    नोट: यह वाष्पीकरण के कारण किनारे के प्रभाव को कम करने के लिए किया जाता है जो 96-वेल प्लेटों में कोशिकाओं की खेती करते समय देखा जाता है।
  3. 5% सीओ2 के साथ इनक्यूबेटर में 37 डिग्री सेल्सियस पर 4 घंटे के लिए प्लेट को इनक्यूबेट करें।

3. कोशिकाओं का सीडिंग

  1. कल्चर फ्लास्क से कोशिकाओं को अलग करें, जैसा कि अनुभाग 1 में वर्णित है, और उन्हें 50 एमएल ट्यूब में ताजा विकास माध्यम में फिर से निलंबित करें।
  2. पसंद की विधि का उपयोग करके व्यवहार्य कोशिकाओं की संख्या की गणना करें।
    नोट: ए 549 कोशिकाओं के मामले में, व्यवहार्यता आम तौर पर ~ 100% तक पहुंच जाती है। सेल संख्या निर्धारित करने के लिए, हम एक्रिडीन नारंगी / प्रोपिडियम आयोडाइड धुंधला होने के आधार पर एक स्वचालित सेल विश्लेषण प्रणाली का उपयोग करते हैं ( सामग्री की तालिका देखें)। अन्य सेल गिनती विधियां समान रूप से अच्छी तरह से काम करती हैं।
  3. वांछित सेल घनत्व प्राप्त करने के लिए ताजा विकास माध्यम में कोशिकाओं को पुन: निलंबित करें। इस अध्ययन में, इष्टतम ए 549 सेल घनत्व 0.15 × 106 (व्यवहार्य) कोशिकाओं / एमएल है।
  4. इंटरडिजिटाइज्ड इलेक्ट्रोड के साथ 96-वेल प्लेट को इनक्यूबेटर से बाहर निकालें और मल्टीचैनल पाइप के साथ माध्यम को हटा दें।
  5. 96-वेल प्लेट में प्रति कुएं सेल सस्पेंशन के 100 μL (इस मामले में 15 × 103 कोशिकाओं के अनुरूप) वितरित करें।
  6. सीईआई डिवाइस में रखने से पहले कोशिकाओं को कमरे के तापमान पर 15 मिनट के लिए बराबर करने की अनुमति दें।

4. सीईआई परख की स्थापना और संचालन

  1. इनक्यूबेटर रखें जिसमें सीईआई डिवाइस प्लेट धारक 37 डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ2 पर है।
  2. डिवाइस में 96-वेल प्लेट रखें।
  3. डिवाइस का सॉफ़्टवेयर खोलें और डेटा संग्रह फलक में सेटअप क्लिक करके एक नया प्रयोग सेट करें. लैपटॉप को ईसीआईएस डिवाइस से कनेक्ट करने की प्रतीक्षा करें और कुओं के प्रतिबाधा की जांच करके प्लेट को कॉन्फ़िगर करें। जाँचें कि क्या सभी कुएं सही ढंग से कॉन्फ़िगर किए गए हैं, जैसा कि हरे रंग द्वारा इंगित किया गया है। यदि नहीं, तो चरण 4.2 को तब तक दोहराएं जब तक कि सभी कुएं हरे न हो जाएं।
  4. वेल कॉन्फ़िगरेशन फलक में, उपयोग किए गए कल्चर वेयर के अनुसार, सरणी प्रकार का चयन करें.
  5. एकाधिक आवृत्ति/समय मोड का चयन करें.
    नोट: इस मोड में, डिवाइस आवृत्तियों की एक श्रृंखला पर प्रतिबाधा परिवर्तन को मापता है।
  6. प्रारंभ क्लिक करके माप प्रारंभ करें.
    नोट: सॉफ्टवेयर के इंटरफ़ेस पर वास्तविक समय प्रतिबाधा की निगरानी की जा सकती है। दिखाए जाने वाले इच्छित आवृत्ति का चयन करें. इस उदाहरण में, 16 kHz चुना जाता है।

5. यौगिक तैयारी और इनक्यूबेशन

नोट: एक एंटीवायरल यौगिक के एक उदाहरण के रूप में, भूलभुलैया का उपयोग किया जाता है ए 1 ( सामग्री की तालिका देखें)। चूंकि इस प्रोटोकॉल को संभावित एंटीवायरल गतिविधि वाले सभी यौगिकों के लिए सामान्यीकृत किया जा सकता है, इसलिए हम इसे 'यौगिक' के रूप में संदर्भित करते हैं।

  1. आरटी में समानता के लिए भ्रूण गोजातीय सीरम (एफबीएस) (जिसे 'परख बफर' कहा जाता है) को जोड़ने के बिना पूर्ण सेल कल्चर माध्यम की अनुमति दें।
  2. यौगिकों को बर्फ पर रखें।
  3. 5 एमएल पॉलीप्रोपाइलीन ट्यूबों में परख माध्यम में प्रत्येक यौगिक का 10 x केंद्रित कमजोर पड़ने की तैयारी करें।
  4. वांछित 10x सांद्रता प्राप्त करने के लिए 5 एमएल पॉलीप्रोपाइलीन ट्यूबों में परख माध्यम में यौगिकों को क्रमिक रूप से पतला करें।
  5. डेटा संग्रह सेटअप फलक में विराम क्लिक करके CEI डिवाइस को रोकें. वर्तमान समय बिंदु पूरा होने की प्रतीक्षा करें और 96-वेल प्लेट को बाहर निकालें।
  6. एक प्रकाश माइक्रोस्कोप के तहत कोशिकाओं के पालन और मोनोलेयर गठन को सत्यापित करें।
  7. मल्टीचैनल पाइप के साथ प्रत्येक कुएं से 20 μL निकालें।
  8. वांछित कुओं में 20 μL यौगिक घोल या वाहन जोड़ें। उचित पाइपिंग के लिए विशिष्ट शर्तों के साथ एक लेआउट तैयार करें।
  9. 5%CO2 के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर 15 मिनट के लिए प्लेट को इनक्यूबेट करें।
    नोट: सीईआई डिवाइस के बजाय इस इनक्यूबेशन चरण के लिए एक सामान्य सेल इनक्यूबेटर का उपयोग किया जाता है। सेल नियंत्रण (सीसी) कुएं वाहन-उपचारित कुएं हैं।

6. वायरस की तैयारी और संक्रमण

  1. वायरस स्टॉक की एक शीशी को पिघलाएं। इस उदाहरण में, ZIKV MR766 और ZIKV PRVABC59 का उपयोग किया जाता है।
  2. वांछित एमओआई पर वायरस को कमजोर करने या 15 एमएल पॉलीप्रोपाइलीन ट्यूब में परख माध्यम में कमजोर पड़ने की तैयारी करें।
    नोट: इस प्रतिनिधि उदाहरण में, MOI 0.5, 0.1, 0.05, 0.01, 0.005, 0.001, 0.005 और 0.00005 का उपयोग किया जाता है।
  3. 96 कुएं प्लेट के निर्दिष्ट कुओं में 100 μL वायरस कमजोर पड़ने जोड़ें। सीसी कुओं में परख माध्यम जोड़ें।
  4. नियोजित वायरस कंटेनरों को नष्ट करें।
  5. प्लेट को सीईआई डिवाइस में वापस रखें और रिज्यूम एक्सपेरिमेंट पर क्लिक करके लगातार 6 दिनों तक माप जारी रखें।
    नोट: वायरस नियंत्रण (वीसी) कुएं वाहन-उपचारित संक्रमित कोशिकाएं हैं, जबकि सीसी कुओं में, वायरस कमजोर पड़ने के बजाय परख माध्यम जोड़ा जाता है। यदि यौगिकों की साइटोटॉक्सिसिटी का मूल्यांकन किया जाता है, तो वायरस कमजोर पड़ने के बजाय परख बफर के 100 μL जोड़ें।

7. डेटा विश्लेषण

  1. समाप्त करें क्लिक करके प्रयोग समाप्त करें और वैकल्पिक सारांश टिप्पणियाँ जोड़ें, जैसे कि प्रकटन विंडो में विशिष्ट प्रयोगात्मक स्थितियों के बारे में जानकारी. डेटा संग्रह पूर्ण होने पर ठीक क्लिक करें.
  2. ग्राफ़ फलक में वांछित आवृत्ति का चयन करें जहां प्रयोग के अंत में सीसी और वीसी के बीच सबसे बड़ा प्रतिबाधा अंतर मापा जाता है।
    1. सबसे अच्छी आवृत्ति निर्धारित करने के लिए, असंक्रमित और संक्रमित कोशिकाओं के साथ एक पायलट प्रयोग चलाएं और आवृत्ति चुनें कि उस समय जहां संक्रमित कोशिकाओं की प्रतिबाधा अपने बेसलाइन स्तर तक गिर गई है - असंक्रमित और संक्रमित कोशिकाओं के बीच सबसे बड़ा देखा गया प्रतिबाधा अंतर की ओर जाता है। जेडआईकेवी से संक्रमित ए 549 कोशिकाओं के मामले में, यह 16 किलोहर्ट्ज है।
  3. स्प्रेडशीट प्रारूप में सभी डेटा निर्यात करने के लिए, सुनिश्चित करें कि सभी कुएं वेल कॉन्फ़िगरेशन फलक में चयनित हैं और फ़ाइल क्लिक करें | निर्यात डेटा | ग्राफ़ डेटा.
  4. सभी डेटा बिंदुओं से प्रयोग के अंत में मापा गया औसत वीसी प्रतिबाधा मान घटाकर और संक्रमण से पहले मापा गया अंतिम समय बिंदु के औसत सीसी प्रतिबाधा मूल्य से विभाजित करके डेटा को सामान्य करें।
  5. सीईआई प्रोफ़ाइल ग्राफ़ प्राप्त करने के लिए समय के कार्य में सामान्यीकृत डेटा को प्लॉट करें।
  6. 50% निरोधात्मक सांद्रता (आईसी50) जैसे मापदंडों को निर्धारित करने के लिए प्रत्येक स्थिति के वक्र (एयूसीएन) के तहत सामान्यीकृत क्षेत्र की गणना करें।
  7. अन्य उपयोगी मापदंडों की गणना करें, जैसे कि सीआईटी50, उदाहरण के लिए, विभिन्न वायरस उपभेदों की संक्रामकता की तुलना करें।

Representative Results

इस लेख में, जेडआईकेवी अनुसंधान में सीईआई परख का उपयोग विस्तार से वर्णित है। इस परख का वर्कफ़्लो चित्र 1 में चित्रित किया गया है। हम वांछित सेल प्रकार में जेडआईकेवी संक्रमण की वास्तविक समय की निगरानी की सुविधा का प्रदर्शन करते हैं, साथ ही एक एंटीवायरल यौगिक द्वारा संक्रमण निषेध का मूल्यांकन भी करते हैं। एक एंटीवायरल उदाहरण के रूप में, हम अच्छी तरह से वर्णित पेप्टाइड लेबिरिंथोप्टिन ए 1 (लैबी ए 1) का उपयोग करते हैं; हम इसे 'यौगिक' के रूप में संदर्भित करते हैं, क्योंकि इसके विशिष्ट गुण इस विधि लेख के दायरे से परे हैं और कहीं और चर्चा की गई है20,21. ध्यान दें, परिणाम अनुभाग में विधि की प्रजनन क्षमता पर चर्चा नहीं की गई है, क्योंकि हम पद्धति का उपयोग करके प्राप्त व्यक्तिगत प्रतिबाधा प्रोफाइल पर ध्यान केंद्रित करना चाहते हैं। हालाँकि, यह पहले19 वर्णित किया गया है।

प्रयोगों के पहले सेट में, हम सीईआई संक्रमण परख करते समय सेल घनत्व अनुकूलन के महत्व को प्रदर्शित करते हैं (चित्रा 2)। जब बहुत अधिक कोशिकाओं को बीज दिया जाता है, तो सेल मोनोलेयर पूरी तरह से विकसित हो जाएगा और सीईआई इलेक्ट्रोड में आगे फैलने में असमर्थ होगा। यह सीसी और वीसी के बीच एक छोटा अंतर की ओर जाता है, और इस प्रकार एक कम रिज़ॉल्यूशन, एंटीवायरल गतिविधि की पहचान खिड़की को कम करता है। यह चित्र 2E में अच्छी तरह से उदाहरण दिया गया है। कुछ बड़े सेल प्रकारों के लिए, जैसे कि यू 87 कोशिकाएं, सीडिंग कोशिकाएं प्लेट में हेरफेर करते समय सेल मोनोलेयर की पूर्ण टुकड़ी का कारण बन सकती हैं, जैसा कि यहां दिखाया गया है (चित्रा 2 एफ)। यह सूक्ष्म रूप से भी देखा जाता है।

चित्रा 2 यह भी दर्शाता है कि परख सेल संवेदनशीलता अध्ययन करने के लिए बहुत उपयोगी है। चित्रा 2 ए, बी से यह स्पष्ट है कि संक्रमण कैनेटीक्स सेल प्रकार पर अत्यधिक निर्भर हैं। चित्रा 2 सी दर्शाता है कि यू 87 कोशिकाएं केवल उच्च एमओआई पर जेडआईकेवी संक्रमण के लिए अतिसंवेदनशील होती हैं।

प्रयोगों के दूसरे सेट में, सीईआई संक्रमण परख के बहुमुखी उपयोग को विभिन्न एमओआई पर विभिन्न जेडआईकेवी उपभेदों का उपयोग करके और एक अच्छी तरह से वर्णित एंटीवायरल यौगिक (चित्रा 3) की उपस्थिति में उजागर किया गया है। ये प्रयोग ए 549 कोशिकाओं के साथ किए जाते हैं, एक मॉडल जो आमतौर पर फ्लेविवायरस अनुसंधान22,23 में उपयोग किया जाता है। इस सेल लाइन का उपयोग अन्य अध्ययनों में भी किया गया है जिन्होंने सीईआई परख24 में इसकी उपयुक्तता का प्रदर्शन किया है। सबसे पहले, अफ्रीकी वंश एमआर 766 के प्रतिनिधि जेडआईकेवी स्ट्रेन द्वारा संक्रमण कैनेटीक्स की तुलना एशियाई वंश PRVABC59 से की जाती है। चित्रा 3 ए दर्शाता है कि दोनों उपभेदों में तुलनीय सीईआई पैटर्न हैं, जिसमें पीआरवीएबीसी 59 में थोड़ा धीमा सीपीई-उत्प्रेरण गुण हैं। यह सीआईटी50 मानों (चित्रा 3 बी) द्वारा भी परिलक्षित होता है। यह दिलचस्प पैरामीटर पहली बार फेंग एट अल .16 द्वारा पेश किया गया था और सीईआई माप के कैनेटीक्स को ध्यान में रखता है। इसे सेल नियंत्रण की तुलना में प्रतिबाधा को 50% तक कम करने के लिए आवश्यक समय के रूप में परिभाषित किया गया है।

इसके बाद, कोशिकाओं को विभिन्न यौगिक सांद्रता की उपस्थिति या अनुपस्थिति में जेडआईकेवी एमआर 766 या पीआरवीएबीसी 59 के तीन अलग-अलग एमओआई से संक्रमित किया गया था, और प्रतिबाधा प्रोफाइल की निगरानी की गई थी। जैसा कि चित्रा 3 सी-एच से देखा जा सकता है, कुछ यौगिक सांद्रता जेडआईकेवी संक्रमण के कारण प्रतिबाधा गिरावट को रोकती है या देरी करती है। यह तब भी परिलक्षित होता है जब एयूसी मूल्यों की गणना की जाती है। सीईआई परख के परिणाम यह भी प्रदर्शित करते हैं कि एंटीवायरल गतिविधि एमओआई और शक्ति मूल्यांकन के समय बिंदु पर निर्भर करती है। एयूसीएन गणना का उपयोग आईसी50 मूल्यों को निर्धारित करने के लिए किया जा सकता है, जैसा कि चित्रा 3 आई में दिखाया गया है। अंत में, चित्रा 3 एच से पता चलता है कि सीआईटी50 मूल्यों का उपयोग यौगिक शक्ति को निर्धारित करने और तुलना करने के लिए भी किया जा सकता है। निष्क्रिय यौगिकों या यौगिक सांद्रता को सीईआई प्रोफाइल, एयूसी और सीआईटी50 मूल्यों की विशेषता है जो वीसी के बराबर हैं।

Figure 1
चित्रा 1: परख के वर्कफ़्लो का योजनाबद्ध अवलोकन। सीईआई परख की समयरेखा और विभिन्न हैंडलिंग और इनक्यूबेशन चरणों को यहां दर्शाया गया है। संक्षेप: सीईआई = सेल-आधारित विद्युत प्रतिबाधा; जेडआईकेवी = जीका वायरस; D = दिन कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्रा 2: विभिन्न घनत्वों पर जेडआईकेवी-संक्रमित कोशिकाओं के सामान्यीकृत सीईआई प्रोफाइल। (ए, डी) ए 549, (बी, ई) एचईएल 299, या (सी, एफ) यू 87 कोशिकाओं को 96-वेल सीईआई प्लेट में प्रति अच्छी तरह से (ए-सी) 15,000-20,000 ("इष्टतम") या (डी-एफ) 75,000 ("सबऑप्टिमल") कोशिकाओं पर बीज दिया गया था। प्रतिबाधा निगरानी के 24 घंटे के बाद, कोशिकाओं को जेडआईकेवी एमआर 766 के दस गुना एमओआई कमजोर पड़ने से संक्रमित किया गया था। प्रतिबाधा की लगातार 5 दिनों तक निगरानी की गई। एक प्रतिनिधि प्रयोग के सीईआई प्रोफाइल (दो तकनीकी प्रतिकृतियों की औसत ± सीमा) दिखाए गए हैं। संक्षेप: सीईआई = सेल-आधारित विद्युत प्रतिबाधा; एमओआई = संक्रमण की बहुलता; जेडआईकेवी = जीका वायरस; मानक = सामान्यीकृत। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 3
चित्रा 3: दो जेडआईकेवी उपभेदों और एक एंटीवायरल यौगिक द्वारा अवरोध के संक्रमण के बाद ए 549 कोशिकाओं के सामान्यीकृत सीईआई प्रोफाइल। (क) अनुगामी ए549 कोशिकाएं या तो जेडआईकेवी एमआर766 अथवा जेडआईकेवी पीआरवीएबीसी 59 के विभिन्न एमओआई से संक्रमित थीं और प्रतिबाधा की लगातार निगरानी की गई। एक प्रतिनिधि प्रयोग के तीन तकनीकी प्रतिकृतियों का औसत ± एसडी दिखाया गया है। (बी) सीआईटी50 मूल्यों की गणना ए के सीईआई प्रोफाइल के आधार पर की गई थी और तुलना की गई थी। प्रदर्शन किए गए तीन तकनीकी प्रतिकृतियों का औसत ± एसडी दिखाया गया है। (C-H) अनुयायी ए 549 कोशिकाओं को विभिन्न यौगिक सांद्रता के साथ इलाज किया गया था और बाद में जेडआईकेवी एमआर 766 (सी-ई) या जेडआईकेवी पीआरवीएबीसी 59 (एफ-एच) के एक विशिष्ट एमओआई से संक्रमित किया गया था। प्रतिबाधा की लगातार निगरानी की गई। एक प्रतिनिधि प्रयोग के दो तकनीकी प्रतिकृतियों की औसत ± सीमा दिखाई गई है। (I) विभिन्न जेडआईकेवी उपभेदों और कमजोर पड़ने के खिलाफ यौगिक अवरोध की तुलना करने के लिए, एयूसी एन की गणना की गई थी, और निरोधात्मक प्रतिशत सीसी एयूसी एन द्वारा सभी स्थितियों को घटाकर और वीसी एयूसी एन द्वारा विभाजित करके निर्धारित किए गए थे। (जे) सी-एच में दिखाए गए प्रयोग के सीआईटी50 मूल्यों की गणना विभिन्न जेडआईकेवी उपभेदों और एमओआई की तुलना करने के लिए की गई थी। दो तकनीकी प्रतिकृतियों की औसत ± सीमा दिखाई गई है। संक्षेप: सीईआई = सेल-आधारित विद्युत प्रतिबाधा; एमओआई = संक्रमण की बहुलता; जेडआईकेवी = जीका वायरस; आदर्श = सामान्यीकृत; सीआईटी 50 = वह समय जिस पर अनुपचारित नियंत्रण के सापेक्ष प्रतिबाधा में50% की कमी आई है; एयूसी = वक्र के नीचे का क्षेत्र; सीसी = सेल नियंत्रण; VC = वायरस नियंत्रण. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Discussion

यह आलेख ZIKV एंटीवायरल अनुसंधान में CEI परख के उपयोग का वर्णन करता है। परख में वास्तविक समय की निगरानी का लाभ है और इसलिए इसका उपयोग चुनिंदा यौगिकों के साथ जेडआईकेवी संक्रमण और एंटीवायरल निषेध के कैनेटीक्स का मूल्यांकन करने के लिए किया जा सकता है। इस विधि के साथ प्राप्त डेटा वायरस-प्रेरित सीपीई और संभावित एंटीवायरल यौगिक की शक्ति के उद्देश्य और दृश्य अवलोकन की अनुमति देता है।

चूंकि सीईआई एक बहुत ही संवेदनशील विधि है, इसलिए इस सेलुलर परख को करते समय बहुत सावधानी बरतनी चाहिए। यह महत्वपूर्ण है कि जितना संभव हो उतना पाइपिंग भिन्नता से बचने के लिए सटीक पाइपिंग की जाए। इसके अलावा, अन्य कारक जो प्रयोगात्मक परिणामों को प्रभावित कर सकते हैं, जैसे कि सेल नंबर और उपयोग किए गए वायरल स्टॉक, को प्रयोग दोहराव के बीच स्थिर रखा जाना चाहिए। ये ऐसे कारक हैं जो कोशिका वृद्धि और संक्रमण के कैनेटीक्स को अत्यधिक प्रभावित करते हैं और इसलिए गणना किए गए सीआईटी50 मूल्यों और / या अन्य मापदंडों में भिन्नता पैदा कर सकते हैं।

(संभावित) एंटीवायरल यौगिकों की उपस्थिति में सीईआई परख करते समय, यह निर्धारित करना महत्वपूर्ण है कि क्या वे वायरस की अनुपस्थिति में कोशिकाओं के प्रतिबाधा को प्रभावित करते हैं। तकनीक इतनी संवेदनशील है कि प्रतिबाधा परिवर्तन को यौगिक के साइटोटोक्सिक सांद्रता19 से नीचे मापा जा सकता है।

यद्यपि इस लेख में केवल जेडआईकेवी डेटा दिखाया गया है, परख को आसानी से अन्य साइटोपैथोजेनिक (फ्लेवी) वायरस पर लागू किया जा सकता है, केवल न्यूनतम अनुकूलन प्रयास के साथ, जैसे कि इष्टतम सीईआई निगरानी आवृत्ति निर्धारण। सीईआई परख के अनुकूलन को विभिन्न मानव और पशु वायरस, जैसे चिकनगुनिया, इन्फ्लूएंजा ए, और मानव और घोड़े के हर्पीसवायरस25,26,27,28 के साथ नियोजित किया गया है। यहां, इसका उपयोग वायरल टिटर्स के परिमाणीकरण या एंटीवायरल यौगिकों की पहचान के लिए एक सरल विधि के रूप में भी किया जाता है। इन अध्ययनों ने वास्तविक समय सेल विश्लेषण, एक वैकल्पिक सीईआई विधि का उपयोग किया।

सीईआई तकनीक का उपयोग अनुयायी सेल प्रकारों तक सीमित है, क्योंकि परख का सिद्धांत इलेक्ट्रोड-एम्बेडेड कुओं में फैलने के लिए अनुयायी कोशिकाओं के गुणों पर निर्भर करता है। सेल अटैचमेंट29 में सुधार के लिए फाइब्रोनेक्टिन जैसे अच्छी तरह से सतह कोटिंग्स का उपयोग किया जा सकता है। कार्यप्रणाली में कुछ अन्य कमियां हैं, पहला इसकी लागत से संबंधित है। सीईआई निगरानी उपकरण और हार्ड और सॉफ्टवेयर के साथ निवेश के अलावा, उपभोग्य वस्तुएं भी कुछ महंगी हैं। इसके अलावा, चूंकि प्रोटोकॉल को कई दिनों तक वायरल संक्रमण की निगरानी की आवश्यकता होती है, इसलिए प्रति सप्ताह एक 96-वेल प्लेट का मूल्यांकन किया जा सकता है। उच्च लागत के साथ, यह उपयोग को कम से मध्यम-थ्रूपुट सेटिंग्स तक सीमित करता है।

इन थ्रूपुट मुद्दों के कारण, तकनीक एंटीवायरल स्क्रीनिंग सेटिंग्स के लिए अनुपयुक्त है। हालांकि, यह प्रारंभिक प्रयोगात्मक चरणों में अत्यधिक आकर्षक है, उदाहरण के लिए, जब एक निश्चित बीमारी से संबंधित सेटिंग में जेडआईकेवी संक्रमण के अध्ययन के लिए सेल संवेदनशीलता का मूल्यांकन किया जाता है। प्रौद्योगिकी संक्रमण कैनेटीक्स में परिवर्तन ों का आसानी से निरीक्षण करने के लिए ट्रांसक्रिप्टेड या नॉकआउट सेल लाइनों के साथ भी उपयोगी है, उदाहरण के लिए, कुछ प्रवेश रिसेप्टर्स की उपस्थिति या अनुपस्थिति में। जेडआईकेवी संक्रमण में सेलुलर कारकों की भागीदारी की जांच करते समय यह दिलचस्प है। इसके अलावा, बाद के प्रीक्लिनिकल चरणों में, जब एक निश्चित लीड उम्मीदवार का चयन किया गया है, तो सीईआई परख का उपयोग चयनित यौगिक के गहन लक्षण वर्णन के लिए किया जा सकता है। वायरस18 का पता लगाने के लिए वायरस-विशिष्ट एंटीबॉडी जैसे कुछ बायोरिकॉग्निशन तत्वों को स्थिर करके सीईआई बायोसेंसर को भी संशोधित किया जा सकता है। कुल मिलाकर, यह एक वायरोलॉजी सेटिंग में सीईआई के बहुमुखी उपयोग पर प्रकाश डालता है।

Disclosures

लेखक इस बात की पुष्टि करते हैं कि हितों का कोई टकराव नहीं है।

Acknowledgments

लेखक पांडुलिपि को प्रूफरीडिंग के लिए क्लेमेंट हेमन और गोरिट लूटस्मा को धन्यवाद देते हैं। अध्ययन को वायरोलॉजी और कीमोथेरेपी प्रयोगशाला (रेगा इंस्टीट्यूट, केयू लिउवेन) के आंतरिक अनुदान द्वारा समर्थित किया गया था।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
A549 cells American Type Culture Collection (ATCC) CCL-185 These cells are cultured in MEM Rega-3 supplemented with 10% FBS, 2 mM L-glutamine, 0.075% sodium bicarbonate.
Acridine Orange/Propidium Iodide Stain Logos Biosystems F23001 Live/dead stain
Cellstar polypropylene tubes, 15 mL Greiner bio-one 1,88,271
Cellstar polypropylene tubes, 50 mL Greiner bio-one 2,27,261
Dulbecco's Modified Essential Medium (DMEM) Gibco, Thermo Fisher Scientific 41965-039 Cell culture medium for U87 and HEL 299 cells
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (DPBS) Gibco, Thermo Fisher Scientific 14190-094
ECIS cultureware 96W20idf Applied BioPhysics 96W20idf PET Assay plate for CEI device
Electric cell-substrate impedance sensing (ECIS) Z array station Applied BioPhysics CEI device, including 96 well station, external control module and laptop with control, acquisition and display software. The necessary software is installed before shipment. NOTE: this device is currently out of production and has been replaced by the more advanced ECIS Z-Theta device
Falcon polystyrene tubes, 5 mL Corning 352054
Fetal Bovine Serum (FBS) Cytiva SV30160.03 Cell culture medium additive for all used cells
HEL 299 cells ATCC CCL-137 These cells are cultured in DMEM supplemented with 10% FBS and 0.01 M HEPES.
HEPES buffer, 1 M Gibco, Thermo Fisher Scientific 15630-056 Cell culture medium additive for U87 cells
Labyrinthopeptin A1 Kind gift from Prof. Dr. Roderich Süssmuth, Technische Universität Berlin, Germany Antiviral compound used as an example in this protocol. It is dissolved in DMSO.
L-Glutamine, 200 mM Gibco, Thermo Fisher Scientific 25030-024 Cell culture medium additive for A549 cells
Luna cell counting slides Logos Biosystems L12001
Luna-FL dual fluoresence cell counter Logos Biosystems L20001 Cell viability counter
Minimum Essential Medium Rega-3 (MEM Rega-3) Gibco, Thermo Fisher Scientific 19993013 Cell culture medium for A549 cells
Sodium Bicarbonate, 7.5% Gibco, Thermo Fisher Scientific 25080-060 Cell culture medium additive for A549 cells
Tissue culture flask T75 TPP Y9076
Trypsin-EDTA, 0.25% Gibco, Thermo Fisher Scientific 25200-056 Dissociation reagent
U87 cells ATCC HTB-14 These cells are cultured in DMEM supplemented with 10% FBS and 0.01 M HEPES.
 Virkon Rely+On tablets Lanxess 115-0020 Disinfectant sollution
Zika virus (ZIKV) MR766 ATCC VR-84 ZIKV prototype strain, isolated from sentinel Rhesus monkey in Uganda in 1968
ZIKV PRVABC59 ATCC VR-1843 ZIKV strain isolated from patient in Puerto Rico in 2015

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Oeyen, M., Meyen, E., Schols, D. Cell-Based Electrical Impedance Platform to Evaluate Zika Virus Inhibitors in Real Time. J. Vis. Exp. (193), e65149, doi:10.3791/65149 (2023).

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