Summary
在这里，我们展示了使用基于细胞的电阻抗（CEI）作为一种非常简单直接的方法来实时研究寨卡病毒感染和人类细胞中的复制。此外，CEI测定可用于评估抗病毒化合物。
Abstract
基于细胞的电阻抗 （CEI） 技术测量由嵌入电极的培养板孔上生长或操纵的贴壁细胞单层引起的阻抗变化。该技术可用于实时监测寨卡病毒（ZIKV）感染和贴壁细胞复制的后果，因为这种病毒具有高度细胞致病性。这是一种简单的检测方法，不需要使用标记或侵入性方法，并且具有提供实时数据的好处。ZIKV感染的动力学高度依赖于所采用的细胞系，病毒株和感染的多重性（MOI），这不能用传统的终点测定轻松研究。此外，CEI测定还可用于评估和表征抗病毒化合物，抗病毒化合物在感染过程中也具有动态抑制特性。本文详细介绍了CEI测定的实际执行及其在ZIKV研究和抗病毒研究中的潜在应用。
Introduction
寨卡病毒 （ZIKV） 暴发与严重疾病并发症有关，例如小头畸形和吉兰-巴雷综合征1，2，3。尽管由于各种风险因素，例如传播蚊媒分布和城市化进程加快，未来的流行病是合理的，但迄今为止，还没有疫苗或抗病毒药物进入市场3，4。因此，传统的ZIKV研究方法应辅以研究该病毒及其潜在抗病毒化合物的新工具。抗病毒研究通常基于表型测定，其中终点是特定参数的存在，例如病毒诱导的细胞病变效应（CPE）的出现或通过报告基因5，6，7产生特定病毒诱导的蛋白质。但是，这些方法具有终点读数，是劳动密集型的，并且可能需要复杂的分析。因此，基于阻抗的方法提供了一种有吸引力的替代方案。
基于电池的电阻抗（CEI）定义为由接种在含电极孔上的贴壁细胞层引起的从一个电极流向另一个电极的电流阻力。该方法中采用的既定CEI技术是电电池基板阻抗传感（ECIS），最初由Giaever和Keese8，9开发。这用于广泛的生物学研究领域，例如癌症转移，毒理学和伤口愈合10，11，12。其原理依赖于由交流电（AC）电压在频率范围内连续扫描产生的电场13。细胞暴露于这些非侵入性电场中，并以预定的间隔测量由细胞生长引起的阻抗变化或细胞粘附或形态的变化14。此外，细胞活力的改变也会导致阻抗变化，使该技术成为监测细胞致病性病毒感染的有用工具15，16，17。由于细胞层的形态变化将在纳米级范围内检测，因此该技术提供了一种高度灵敏的检测工具。本文中描述的CEI测定是一种简单，无创，实时，无标记的方法，用于测量细胞层随时间的变化。
尽管CEI尚未用于评估ZIKV感染的病程或其潜在的抗病毒药物，但在18之前已对其用作诊断工具进行了研究。在最近的一项研究中，首次验证了使用CEI测定法确定A549细胞中几种ZIKV抑制剂的抗病毒活性19。本文更详细地描述了该CEI测定，并将其扩展到各种贴壁细胞系，以及各种感染多重性（MOI）的各种ZIKV菌株。因此，证明了该方法在黄病毒抗病毒研究中的多功能用途。该方法具有实时细胞监测的关键优势，允许检测重要的感染时间点和潜在抗病毒化合物的动态抑制活性。综上所述，CEI技术提供了一个强大而有价值的工具，以补充当前的抗病毒方法范围。
Protocol
所描述的所有步骤均在无菌条件下在生物安全2级实验室的层流柜中进行。根据比利时机构审查委员会（Leefmilieu，Natuur en Energie，协议SBB 219 2011/0011）和鲁汶大学生物安全委员会的规则，所有使用的病毒均按批准获得和使用。
1. 细胞培养维护
注意：该协议是用一系列细胞系执行的，但当然可以适应任何贴壁细胞系，只需要细胞接种密度优化。
- 在加湿培养箱中以37°C和5%CO2 在T75培养瓶中培养A549人肺腺癌细胞系，U87人恶性胶质母细胞瘤细胞系和HEL 299人胚胎肺成纤维细胞。
- 以80%-95%汇合度传代细胞。在培养细胞之前，所有试剂都应在室温（RT）下进行。
- 从细胞中取出条件培养基。使用 5 mL Dulbecco 的磷酸盐缓冲盐水 （DPBS） 洗涤细胞单层一次。
- 将 1 mL 的 0.25% 胰蛋白酶-乙二胺四乙酸 （EDTA） 均匀分布在细胞单层上。然后，在37°C下孵育长达3分钟，直到细胞开始分离。
- 加入 9 mL 新鲜完全生长培养基（详见 材料表 ）。轻轻上下移液以重悬细胞。
- 将所需体积的细胞悬液转移到新的T75培养瓶中，并加入适当体积的新鲜生长培养基以获得15mL的总体积。
注意：根据特定的细胞系，本协议中使用的 体外 细胞系以1：4至1：10稀释度传代培养，以允许理想的生长条件。每3-4天进行一次传代培养，因此所需的细胞悬液体积也可以根据孵育天数而变化。
2. CEI板的制备
- 取带有叉指电极的 96 孔板（参见 材料表），并用 100 μL 生长培养基填充所有孔。
- 用DPBS填充孔之间的空间。
注意：这样做是为了减少在96孔板中培养细胞时观察到的蒸发引起的边缘效应。 - 将板在37°C下在具有5%CO2的培养箱中孵育4小时。
3. 细胞接种
- 如第 1 节所述，将细胞从培养瓶中分离，并将它们重悬于 50 mL 管中的新鲜生长培养基中。
- 使用所选方法计数活细胞的数量。
注意：在A549细胞的情况下，活力通常达到~100%。为了确定细胞数量，我们使用基于吖啶橙/碘化丙啶染色的自动细胞分析系统（见 材料表）。其他细胞计数方法同样有效。 - 将细胞重悬于新鲜生长培养基中以获得所需的细胞密度。在本研究中，最佳 A549 细胞密度为 0.15 × 106 （活）细胞/mL。
- 将带有叉指电极的 96 孔板从培养箱中取出，并用多通道移液管去除培养基。
- 在 96 孔板中每孔分配 100 μL 细胞悬液（在这种情况下相当于 15 ×10 3 个细胞）。
- 让细胞在室温下平衡15分钟，然后再将它们放入CEI设备中。
4. 设置和运行 CEI 检测
- 将容纳CEI设备板架的培养箱置于37°C和5%CO2。
- 将96孔板放入设备中。
- 打开设备的软件，然后单击“收集数据”窗格中的“设置”来设置新实验。等待笔记本电脑连接到ECIS设备，并通过检查孔的阻抗来配置板。检查所有孔是否正确配置，如绿色所示。如果没有，请重复步骤 4.2，直到所有孔均为绿色。
- 在 “井配置”窗格中，根据使用的区域性软件选择 阵列类型。
- 选择 多频率/时间模式。
注意：在此模式下，器件测量一定频率范围内的阻抗变化。 - 通过单击 开始开始测量。
注意：可以在软件界面上监控实时阻抗。选择要显示的 所需频率 。在本例中，选择 16 kHz。
5. 化合物制备和孵育
注意：作为抗病毒化合物的一个例子，使用迷宫激素A1（见 材料表）。由于该协议可以推广到所有具有潜在抗病毒活性的化合物，因此我们将其称为“化合物”。
- 允许不添加胎牛血清（FBS）（称为“测定缓冲液”）的完整细胞培养基在室温下平衡。
- 将化合物放在冰上。
- 在 5 mL 聚丙烯管中的测定培养基中制备每种化合物的 10x 浓缩稀释液。
- 在 5 mL 聚丙烯管中的测定培养基中连续稀释化合物以获得所需的 10x 浓度。
- 通过单击数据收集设置窗格中的暂停来暂停 CEI 设备。等待当前时间点完成并取出96孔板。
- 在光学显微镜下验证细胞的粘附和单层形成。
- 用多通道移液管从每个孔中取出 20 μL。
- 在所需孔中加入 20 μL 化合物溶液或载体。准备具有正确移液的特定条件的布局。
- 将板在37°C下用5%CO2孵育15分钟。
注意：此孵育步骤使用普通细胞培养箱代替CEI设备。细胞对照（CC）孔是载体处理的孔。
6. 病毒制备和感染
- 解冻一瓶病毒原液。在本例中，使用ZIKV MR766和ZIKV PRVABC59。
- 以所需的MOI制备病毒稀释液或在15 mL聚丙烯管中的测定培养基中制备稀释液。
注意：在此代表性示例中，使用了MOI 0.5，0.1，0.05，0.01，0.005，0.001，0.005和0.00005。 - 在 96 孔板的指定孔中加入 100 μL 病毒稀释液。向CC孔中加入测定培养基。
- 净化所使用的病毒容器。
- 将板放回CEI设备中，并通过单击“ 恢复实验”连续6天继续测量。
注意：病毒对照（VC）孔是载体处理的感染细胞，而在CC孔中，添加测定培养基而不是病毒稀释。如果评估化合物的细胞毒性，则加入 100 μL 测定缓冲液而不是病毒稀释液。
7. 数据分析
- 通过单击 “完成 ”结束实验，并添加 可选的摘要注释，例如在出现的窗口中提供有关特定实验条件的信息。数据收集完成后单击 确定 。
- 在 “图形”窗格中 选择所需的频率，在该频率中，在实验结束时测量 CC 和 VC 之间的最大阻抗差。
- 为了确定最佳频率，对未感染和感染的细胞进行试点实验，并选择在感染细胞的阻抗下降到其基线水平的时间点导致未感染和感染细胞之间观察到的最大阻抗差异的频率。在 感染ZIKV的A549细胞的情况下，这是 16 kHz。
- 要以电子表格格式导出所有数据，请确保在“ 井配置”窗格中 选择了所有孔，然后单击 “文件”|”导出数据 |图形数据。
- 通过从所有数据点中减去实验结束时测量的平均VC阻抗值并将其除以感染前测量的最后一个时间点的平均CC阻抗值来归一化数据。
- 在时间函数中绘制归一化数据，得到CEI轮廓图。
- 计算每个条件的曲线下归一化面积（AUCn）以确定参数，例如50%抑制浓度（IC50）。
- 例如，计算其他有用的参数，例如CIT50，以比较各种病毒株的感染性。
Representative Results
在本文中，详细介绍了CEI测定在ZIKV研究中的使用。该测定的工作流程如图 1所示。我们展示了实时监测所需细胞类型中ZIKV感染的便利性，以及通过抗病毒化合物评估感染抑制的便利性。作为抗病毒示例，我们使用描述良好的肽迷宫希望丁A1（Laby A1）;我们将其称为“化合物”，因为它的具体性质超出了本文的方法范围，并在其他地方讨论20，21。值得注意的是，该方法的重现性在结果部分没有讨论，因为我们希望重点介绍使用该方法获得的各个阻抗曲线。但是，这在前面已经描述过19.
在第一组实验中，我们证明了在进行CEI感染测定时细胞密度优化的重要性（图2）。当接种过多的细胞时，细胞单层将完全生长，无法进一步扩散到CEI电极上。这导致CC和VC之间的差异较小，因此分辨率较低，从而降低了抗病毒活性的检测窗口。 这在图2E中得到了很好的体现。对于某些较大的细胞类型，例如U87细胞，在操纵板时，接种细胞密度过大甚至可能导致细胞单层完全脱落，如此处所示（图2F）。这也在显微镜下观察到。
图2还表明该测定对于进行细胞敏感性研究非常有用。从图2A，B可以清楚地看出，感染动力学高度依赖于细胞类型。图2C表明，U87细胞仅在高MOI下易受ZIKV感染。
在第二组实验中，强调了CEI感染测定的多功能用途，使用不同MOI的各种ZIKV菌株并在存在明确描述的抗病毒化合物的情况下（图3）。这些实验是用A549细胞进行的，A549细胞是黄病毒研究中常用的模型22，23。该细胞系也已用于其他研究，这些研究已证明其在CEI测定中的适用性24。首先，将非洲谱系MR766的代表性ZIKV菌株的感染动力学与亚洲谱系PRVABC59的感染动力学进行比较。 图3A 表明，两种菌株具有相似的CEI模式，PRVABC59具有稍慢的CPE诱导特性。CIT50 值也反映了这一点（图 3B）。这个有趣的参数首先由Fang等人提出16 ，并考虑了CEI测量的动力学。它被定义为与电池对照相比，将阻抗降低50%所需的时间。
接下来，在存在或不存在各种化合物浓度的情况下，用ZIKV MR766或PRVABC59的三种不同MOI感染细胞，并监测阻抗曲线。从图3C-H可以看出，某些化合物浓度抑制或延缓由ZIKV感染引起的阻抗下降。这在计算 AUC 值时也会反映出来。CEI测定结果还直观地表明，抗病毒活性取决于MOI和效力评估的时间点。AUCn 计算可用于确定 IC50 值，如图 3I 所示。最后，图3H显示CIT50值也可用于确定和比较化合物效力。非活性化合物或化合物浓度的特征是CEI曲线，AUC和CIT50值与VC相当。
图 1：检测工作流程的示意图。 此处描述了CEI测定的时间表以及不同的处理和孵育步骤。缩写：CEI = 基于电池的电阻抗;寨卡病毒=寨卡病毒;D = 天。 请点击此处查看此图的大图。
图2：不同密度下ZIKV感染细胞的标准化CEI谱。 将（A，D）A549，（B，E）HEL 299或（C，F）U87细胞接种在96孔CEI板中，每孔15，000-20，000（“最佳”）或（D-F）75，000（“次优”）细胞。阻抗监测24小时后，用ZIKV MR766的10倍MOI稀释液感染细胞。连续5天进一步监测阻抗。显示了代表性实验的CEI曲线（两个技术重复的平均±范围）。缩写：CEI = 基于电池的电阻抗;MOI = 感染的多重性;寨卡病毒=寨卡病毒;规范 = 规范化。请点击此处查看此图的大图。
图 3：感染两种 ZIKV 菌株并受抗病毒化合物抑制后 A549 细胞的标准化 CEI 谱。 （A）贴壁A549细胞感染ZIKV MR766或ZIKV PRVABC59的各种MOI，并连续监测阻抗。显示了代表性实验的三个技术重复的平均±SD。（B） CIT50值是根据A的CEI概况计算并进行比较的。显示了执行的三个技术重复的平均±SD。（C-H）贴壁A549细胞用各种化合物浓度处理，随后感染ZIKV MR766（C-E）或ZIKV PRVABC59（F-H）的特定MOI。持续监测阻抗。显示了代表性实验的两个技术重复的平均±范围。（I）为了比较化合物对不同ZIKV菌株和稀释度的抑制，计算AUC n，并通过用CC AUC n减去所有条件并除以VC AUCn来确定抑制百分比。（J）计算C-H所示实验的CIT50值，以比较不同的ZIKV菌株和MOI。显示了两个技术重复的平均±范围。缩写：CEI = 基于电池的电阻抗;MOI = 感染的多重性;寨卡病毒=寨卡病毒;规范 = 规范化;CIT 50 = 阻抗相对于未处理对照降低50% 的时间;AUC = 曲线下面积;CC = 细胞控制;VC = 病毒控制。请点击此处查看此图的大图。
Discussion
本文介绍了CEI测定在ZIKV抗病毒研究中的使用。该测定具有实时监测的优点，因此可用于评估ZIKV感染的动力学和选择性化合物的抗病毒抑制。用这种方法获得的数据可以客观和目视地观察病毒诱导的CPE和潜在抗病毒化合物的效力。
由于CEI是一种非常灵敏的方法，因此在进行这种细胞测定时必须格外小心。进行精确的移液以尽可能避免移液变化至关重要。此外，可能影响实验结果的其他因素，如细胞数量和使用的病毒储备，必须在实验重复之间保持恒定。这些因素高度影响细胞生长和感染的动力学，因此可能导致计算的CIT50 值和/或其他参数的变化。
当在存在（潜在）抗病毒化合物的情况下进行CEI测定时，重要的是要确定它们是否在没有病毒的情况下影响细胞的阻抗。该技术非常敏感，以至于阻抗变化的测量值可能远低于化合物的细胞毒性浓度19。
虽然本文仅显示ZIKV数据，但该测定可以很容易地应用于其他细胞致病性（黄）病毒，只需最少的优化工作，例如最佳CEI监测频率测定。CEI测定的适应性已用于各种人类和动物病毒，例如基孔肯雅热，甲型流感以及人类和马疱疹病毒25，26，27，28。在这里，它也被用作病毒滴度定量或抗病毒化合物鉴定的简单方法。这些研究使用实时细胞分析，这是一种替代CEI方法。
CEI技术的使用仅限于贴壁细胞类型，因为该测定的原理依赖于贴壁细胞的特性，以扩散到电极嵌入的孔中。孔表面涂层如纤连蛋白可用于改善细胞附着29。该方法还有其他一些缺点，第一个缺点与其成本有关。除了对CEI监控设备以及随附的硬件和软件的投资外，耗材也有些昂贵。此外，由于该方案需要监测病毒感染数天，因此可以每周评估一个96孔板。再加上成本高，这限制了对中低通量设置的使用。
由于这些吞吐量问题，该技术不适合抗病毒筛选设置。然而，它在初始实验阶段非常有吸引力，例如，在评估细胞敏感性以研究某种疾病相关环境中的ZIKV感染时。该技术还可用于转染或敲除细胞系，以轻松观察感染动力学的变化，例如，是否存在某些进入受体。在研究细胞因子参与ZIKV感染时，这很有趣。此外，在后期的临床前阶段，当选择了某种先导候选药物时，CEI测定可用于对所选化合物进行进一步深入表征。CEI生物传感器也可以通过固定某些生物识别元件（例如病毒特异性抗体）来修改，以检测病毒18。总之，这突出了CEI在病毒学环境中的多功能性。
Disclosures
提交人确认不存在利益冲突。
Acknowledgments
作者感谢Clément Heymann和Gorrit Lootsma校对手稿。该研究得到了病毒学和化疗实验室（鲁汶大学雷加研究所）的内部资助。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| A549 cells | American Type Culture Collection (ATCC) | CCL-185 | These cells are cultured in MEM Rega-3 supplemented with 10% FBS, 2 mM L-glutamine, 0.075% sodium bicarbonate. |
| Acridine Orange/Propidium Iodide Stain | Logos Biosystems | F23001 | Live/dead stain |
| Cellstar polypropylene tubes, 15 mL | Greiner bio-one | 1,88,271 | |
| Cellstar polypropylene tubes, 50 mL | Greiner bio-one | 2,27,261 | |
| Dulbecco's Modified Essential Medium (DMEM) | Gibco, Thermo Fisher Scientific | 41965-039 | Cell culture medium for U87 and HEL 299 cells |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (DPBS) | Gibco, Thermo Fisher Scientific | 14190-094 | |
| ECIS cultureware 96W20idf | Applied BioPhysics | 96W20idf PET | Assay plate for CEI device |
| Electric cell-substrate impedance sensing (ECIS) Z array station | Applied BioPhysics | CEI device, including 96 well station, external control module and laptop with control, acquisition and display software. The necessary software is installed before shipment. NOTE: this device is currently out of production and has been replaced by the more advanced ECIS Z-Theta device | |
| Falcon polystyrene tubes, 5 mL | Corning | 352054 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Cytiva | SV30160.03 | Cell culture medium additive for all used cells |
| HEL 299 cells | ATCC | CCL-137 | These cells are cultured in DMEM supplemented with 10% FBS and 0.01 M HEPES. |
| HEPES buffer, 1 M | Gibco, Thermo Fisher Scientific | 15630-056 | Cell culture medium additive for U87 cells |
| Labyrinthopeptin A1 | Kind gift from Prof. Dr. Roderich Süssmuth, Technische Universität Berlin, Germany | Antiviral compound used as an example in this protocol. It is dissolved in DMSO. | |
| L-Glutamine, 200 mM | Gibco, Thermo Fisher Scientific | 25030-024 | Cell culture medium additive for A549 cells |
| Luna cell counting slides | Logos Biosystems | L12001 | |
| Luna-FL dual fluoresence cell counter | Logos Biosystems | L20001 | Cell viability counter |
| Minimum Essential Medium Rega-3 (MEM Rega-3) | Gibco, Thermo Fisher Scientific | 19993013 | Cell culture medium for A549 cells |
| Sodium Bicarbonate, 7.5% | Gibco, Thermo Fisher Scientific | 25080-060 | Cell culture medium additive for A549 cells |
| Tissue culture flask T75 | TPP | Y9076 | |
| Trypsin-EDTA, 0.25% | Gibco, Thermo Fisher Scientific | 25200-056 | Dissociation reagent |
| U87 cells | ATCC | HTB-14 | These cells are cultured in DMEM supplemented with 10% FBS and 0.01 M HEPES. |
| Virkon Rely+On tablets | Lanxess | 115-0020 | Disinfectant sollution |
| Zika virus (ZIKV) MR766 | ATCC | VR-84 | ZIKV prototype strain, isolated from sentinel Rhesus monkey in Uganda in 1968 |
| ZIKV PRVABC59 | ATCC | VR-1843 | ZIKV strain isolated from patient in Puerto Rico in 2015 |
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