Summary
Hier beschrijven we in detail het protocol voor het kwantificeren van de telomeerlengte met behulp van niet-radioactieve chemiluminescente detectie, met een focus op de optimalisatie van verschillende prestatieparameters van de TAGGG-telomeerlengtetestkit, zoals bufferhoeveelheden en sondeconcentraties.
Abstract
Telomeren zijn repetitieve sequenties die aanwezig zijn aan chromosomale uiteinden; Hun verkorting is een kenmerkend kenmerk van menselijke somatische cellen. Verkorting treedt op als gevolg van een probleem met eindreplicatie en de afwezigheid van het telomerase-enzym, dat verantwoordelijk is voor het behoud van de telomeerlengte. Interessant is dat telomeren ook korter worden als reactie op verschillende interne fysiologische processen, zoals oxidatieve stress en ontsteking, die kunnen worden beïnvloed door extracellulaire agentia zoals verontreinigende stoffen, infectieuze agentia, voedingsstoffen of straling. Telomeerlengte dient dus als een uitstekende biomarker van veroudering en verschillende fysiologische gezondheidsparameters. De TAGGG telomeerlengtetestkit wordt gebruikt om gemiddelde telomeerlengtes te kwantificeren met behulp van de telomeerrestrictiefragment (TRF) -test en is zeer reproduceerbaar. Het is echter een dure methode en daarom wordt het niet routinematig gebruikt voor grote steekproefaantallen. Hier beschrijven we een gedetailleerd protocol voor een geoptimaliseerde en kosteneffectieve meting van de telomeerlengte met behulp van Southern blots of TRF-analyse en niet-radioactieve chemiluminescentie-gebaseerde detectie.
Introduction
Telomeren zijn de repetitieve DNA-sequenties die aanwezig zijn aan het einde van chromosomen. Ze hebben tandemherhalingen van TTAGGG en behouden de integriteit van het genoom door het chromosoom te beschermen tegen zowel rafels als het eindreplicatieprobleem, wat betekent dat een deel van de 3'-overhang niet kan worden gerepliceerd door DNA-polymerase 1,2. Korte telomeren leiden tot chromosomale afwijkingen in cellen, waardoor cellen permanent worden gestopt in een stadium dat replicatieve senescentie3 wordt genoemd. Korte telomeren veroorzaken ook een groot aantal andere problemen, zoals mitochondriale disfunctie 4,5 en celdisfunctie.
DNA-telomerische herhalingen gaan verloren als en wanneer de cel zich deelt, met een gemiddeld verlies van 25 tot 200 bp per jaar 6, wat resulteert in cellulaire senescentie na een bepaald aantal delingen6. Veroudering is geassocieerd met een hogere frequentie van comorbiditeiten, die wordt gekenmerkt door een verkorting van de telomeerlengte7. Telomere restriction fragment (TRF) analyse, zoals beschreven door Mender, is een zeer dure methode8. Hierdoor wordt het in de meeste onderzoeken niet geïmplementeerd bij het kwantificeren van de telomeerlengte.
Momenteel maken de meeste epidemiologische studies gebruik van kwantitatieve polymerasekettingreactie (qPCR) -gebaseerde metingen van telomeerlengte. De op qPCR gebaseerde methode is echter een relatieve meetmethode, omdat deze de verhouding meet tussen telomeren en single-copy gen-amplificatieproducten, en niet de absolute telomeerlengte. Telomeerlengtemeting met behulp van het TRF-protocol is de gouden standaardmethode, omdat het de telomeerlengteverdeling in het monster kan meten en metingen kunnen worden uitgedrukt in absolute waarden in kilobases (kb). Het gebruik ervan is echter beperkt omdat het omslachtig, arbeidsintensief en duur is. Hier presenteren we een geoptimaliseerd protocol voor telomeerlengtemeting met behulp van op chemiluminescentie gebaseerde TRF's.
TRF-analyse omvat zeven belangrijke stappen: 1) kweken van cellen voor genomische DNA-extractie, 2) genomische DNA-extractie met behulp van de fenol: chloroform: isoamylalcohol (P: C: I) -methode, 3) restrictievertering van genomisch DNA, 4) agarosegel-elektroforese, 5) Zuidelijk blotting van het DNA-fragment van de restrictievertering, 6) hybridisatie en detectie via chemiluminescentie-de geïmmobiliseerde telomeersonde wordt gevisualiseerd door een zeer gevoelig chemiluminescent substraat voor alkalische fosfatase, dinatrium 2-chloor-5-(4-methoxyspiro[1,2-dioxetane-3,2′-(5-chlorotricyclo[3.3.1.13.7]decan])-4-yl]-1-fenylfosfaat (CDP-Star)-en 7) analyse voor het verkrijgen van gemiddelde telomeerlengte- en bereikinformatie van deze telomerische uitstrijkjes.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
OPMERKING: Zie de materiaaltabel voor meer informatie over alle reagentia die in het onderstaande protocol worden gebruikt. Tabel 1 maakt gebruik van in het laboratorium gemaakte reagentia samen met geoptimaliseerde volumes en tabel 2 toont werkconcentraties van in de handel verkrijgbare reagentia.
1. Celkweek
- Onderhoud cellen waarvan de telomeerlengte moet worden gemeten (hier werden A2780-cellen gebruikt, een cellijn van adenocarcinoom van de eierstokken) in dulbecco's gemodificeerde adelaarmedium (DMEM) compleet medium aangevuld met 10% foetaal runderserum (FBS), streptomycine, penicilline en amfotericine B in een petrischaal van 6 cm. Incubeer bij 37 °C in een bevochtigde en gecontroleerde omgeving met 5% koolstofdioxide totdat de cellen voor 80%-100% samenvloeien.
- Verwijder de media en was met 5 ml 1x fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS).
- Behandel de cellen met 1 ml trypsine-ethyleendiaminetetra-azijnzuur (EDTA) voor het losmaken van de cellen door te broeden bij 37 °C gedurende 3-5 minuten.
- Voeg 2 ml DMEM complete media toe om de trypsine te inactiveren en verzamel de cellen in een centrifugatiebuis.
- Pellet de cellen op 2.348 × g gedurende 5 min.
- Was de pellet met 1x PBS en centrifugeer op 2.348 × g gedurende 5 min.
- Bewaar de pellet bij -80 °C tot verder gebruik.
OPMERKING: Het aantal cellen kan variëren, afhankelijk van de cellijn. We verkregen ongeveer 2,5 × 106 cellen in het geval van de A2780-cellijn, die in verdere stappen wordt gebruikt.
2. Genomische DNA-isolatie
- Voeg 500 μL lysisbuffer (10 mM tris-Cl, pH 8,0; 25 mM EDTA, pH 8,0; 100 mM NaCl; 0,5% m/v natriumdodecylsulfaat) toe aan de celpellet en meng voorzichtig met een gesneden punt (met een openingsdiameter van minimaal 2 mm). Voeg 20 μg/ml vers bereide RNase A toe en meng voorzichtig door inversie.
- Incubeer bij 37 °C gedurende 30 minuten en keer de buis af en toe om tijdens de incubatie.
- Voeg proteïnase K toe tot een eindconcentratie van 100 μg/ml en meng voorzichtig door inversie 10 keer. Incubeer bij 55 °C gedurende 2 uur. Keer de buis met regelmatige tussenpozen (elke 10 minuten) om tijdens de incubatie.
- Voeg 500 μL fenol:chloroform:isoamylalcoholreagens (25:24:1) toe en meng voorzichtig door inversie 20 keer. Centrifugeer bij 9.391 × g gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur (ongeveer 25 °C).
OPMERKING: Figuur 1A toont de drie lagen verkregen na centrifugeren. - Verwijder de viskeuze bovenste waterige laag uit de drie zichtbare lagen, plaats in een verse buis met behulp van een gesneden punt en voeg een gelijke hoeveelheid chloroform toe. Meng door zachte inversie 20 keer.
- Centrifugeer de buizen gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur op 9.391 × g .
- Verzamel de waterige laag en voeg een geschikte hoeveelheid van 5 M NaCl toe, zodat de uiteindelijke concentratie NaCl 0,2 M is.
- Voeg twee volumes 100% ethanol toe. Meng door zachte inversie 20-25 keer. Centrifugeer bij 15.871 × g gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur.
- Verwijder het supernatant en voeg 500 μL 70% ethanol toe om de pellet te wassen. Centrifugeer bij 15.871 × g gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur.
- Verwijder het supernatant, droog de pellet een paar minuten aan de lucht en voeg 50 μL steriel nucleasevrij water toe. Laat het DNA 1-2 dagen rehydrateren bij kamertemperatuur. Meng door pipetteren, met behulp van de snijpunt.
- Meet de concentratie van DNA met behulp van ultraviolette (UV)-spectrofotometrie. Verdun de monsters indien nodig opnieuw met steriel nucleasevrij water om een minimale concentratie van 300-500 ng / μL te krijgen.
- Controleer op de integriteit van het DNA door het uit te voeren op een 1% agarose-gel (figuur 1B).
- Bewaar het verdunde DNA bij -20 °C tot verder gebruik.
3. Vertering van genomisch DNA
- Bereid een enzymmengsel van Rsa1 (20 U) en Hinf1 (20 U) en voeg 2 μL restrictieverteringsbuffer per reactie toe.
- Neem een geschikt volume genomisch DNA, zodat de totale hoeveelheid DNA 1,5 μg is. Vul het volume aan met steriel nucleasevrij water, zodat het totale volume na de enzymtoevoeging 20 μL is.
- Meng goed door te tikken, gevolgd door een pulsspin.
- Incubeer het mengsel bij 37 °C gedurende 2 uur.
4. Agarose gel elektroforese
- Bereid een 10 cm × 15 cm 0,8% agarose gel in 1x tris acetaat EDTA (TAE) buffer met behulp van hoogwaardige agarose.
- Voeg 5 μL ladingskleurstof toe aan elk verteerd genomisch DNA-monster, waardoor het uiteindelijke volume 25 μL wordt en laad de monsters op de gel.
- Bereid een moleculaire markermix met behulp van 1 μL moleculaire marker (ladder), 3 μL steriel nucleasevrij water en 1 μL 5x ladende kleurstof.
- Laad 5 μL moleculair markermengsel aan beide zijden van de genomische DNA-verteerde monsters als er een hoger aantal monsters zijn (~ 10), of slechts aan één kant als er minder dan of gelijk aan vijf monsters zijn.
- Laat de gel 6 uur op 5 V/cm draaien. Zodra de run is voltooid, maakt u een inkeping in een hoek van de gel om de laadvolgorde te markeren.
- Dompel de gel onder in 0,25 M HCl gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur met zachte agitatie.
- Spoel de gel twee keer af met gedestilleerd water.
- Denatureer het DNA door de gel onder te dompelen in een oplossing van 0,5 M NaOH en 1,5 M NaCl tweemaal gedurende 15 minuten elk bij kamertemperatuur met zachte agitatie.
- Spoel de gel twee keer af met gedestilleerd water.
- Neutraliseer het DNA door de gel gedurende 15 minuten onder te dompelen in een oplossing van 0,5 M tris-HCl en 3 M NaCl (pH 7,5) gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur met zachte agitatie.
5. Zuidelijk blotting
- Knip een nylon membraan van 10 cm × 12 cm groot en maak een inkeping in dezelfde positie als de gel.
- Activeer het membraan door het onderdompelen in gedestilleerd water gevolgd door 20x natriumzoutcitraat (SSC) buffer (zie tabel 1).
- Stel de overdracht in.
- Neem een schone glazen bak en plaats er een andere bak in een omgekeerde positie. Maak een lont met gewoon filtreerpapier, zodat de uiteinden de basis van de buitenste lade raken.
- Leg de gel op het filterpapier. Plaats het geactiveerde nylon membraan voorzichtig over de gel, waarbij de inkepingen elkaar overlappen, en verwijder eventuele luchtbellen door over een glazen staaf te rollen.
- Plaats een hoop van 2 cm van 9,5 cm × 11,5 cm cellulosefilterpapier, gevolgd door een hoop gewoon filtreerpapier van 6 cm van dezelfde afmetingen. Plaats een gewicht bovenop deze opstelling zodat er een gelijke gewichtsverdeling onder is. Vul de buitenste lade met 20x SSC-buffer (zie figuur 2).
- Verlaat de installatie voor 's nachts overdracht.
- Na de zuidelijke overdracht fixeert u het overgedragen DNA op het membraan door UV-crosslinking op een UV-transilluminator of UV-crosslinker. Gebruik een lamp van 302 nm van 8 W gedurende 5 minuten of een lamp van 254 nm van 8 W gedurende 2 minuten, wat overeenkomt met ongeveer 120 mJ. Zorg ervoor dat de membraanzijde waarop het DNA wordt overgebracht naar de lamp is gericht.
- Was het membraan twee keer met 25 ml 2x SSC buffer.
- Pauzeer het protocol, indien nodig, door de vlek volledig te drogen en te bewaren bij 2-8 °C na losjes in folie te hebben gewikkeld, tot verdere verwerking.
6. Hybridisatie en chemiluminescentiedetectie
- Verwarm de voorhybridisatiebuffer voor op 42 °C.
OPMERKING: De volgende stappen omvatten volumes van oplossingen/buffers die per 100 cm2 vlek moeten worden gebruikt. - Incubeer het membraan in 10 ml prehybridisatiebuffer gedurende 1 uur bij 42 °C met zachte agitatie voor prehybridisatie.
- Voeg 0,5 μl telomeersonde per 5 ml voorverwarmde prehybridisatiebuffer toe om de hybridisatieoplossing te maken.
- Incubeer de vlek in 10 ml hybridisatieoplossing bij 42 °C gedurende 3 uur met zacht roeren.
- Was de vlek met strenge buffer 1 (tabel 1) tweemaal gedurende 10 minuten (elk 25 ml) op kamertemperatuur met zacht schudden.
- Verwarm strenge buffer 2 (tabel 1) gedurende 30 minuten bij 50 °C.
- Was de vlek met een strenge buffer 2 tweemaal gedurende 15 minuten (elk 25 ml) op 50 °C met zacht schudden.
- Spoel af met 15 ml wasbuffer gedurende 5 minuten met zacht roeren bij RT.
- Incubeer het membraan in 10 ml vers bereide 1x blokkerende oplossing gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur met zacht schudden.
- Incubeer het membraan in 10 ml anti-digioxigenine geconjugeerd met alkalische fosfatase-werkoplossing (zie tabel 2) gedurende 30 minuten bij RT met zacht schudden.
- Was de dep tweemaal met wasbuffer op kamertemperatuur gedurende 15 minuten met zacht schudden.
- Incubeer in 10 ml detectiebuffer gedurende 5 minuten bij RT met zacht schudden.
- Verwijder de overtollige detectiebuffer en houd het membraan met het DNA naar boven gericht op een hybridisatiezak of acetaatblad. Voeg ~ 1-1,5 ml substraatoplossing druppelsgewijs toe aan het membraan, plaats er onmiddellijk een ander vel op en incubeer gedurende 5 minuten bij RT.
- Knijp de overtollige substraatoplossing uit voor beeldvorming.
- Maak de vlek gedurende ongeveer 20 minuten in beeld in een geldocumentatiebeeldvormingssysteem en verzamel meerdere afbeeldingen op verschillende tijdstippen. Selecteer onverzadigde afbeeldingen voor verdere analyse.
OPMERKING: In het geval dat het signaal zwak is, kan beeldvorming gedurende een langere periode worden uitgevoerd.
7. Analyse
- Nadat u de afbeeldingsbestanden hebt verkregen, exporteert u ze voor publicatie in .tif formaat met de hoogst mogelijke resolutie (600 dpi in dit geval).
- Installeer Telotool software. Dit vereist een specifieke versie (R2012a) van MATLAB (vrij beschikbaar) om te kunnen draaien.
- Open de software en klik op de knop Afbeeldingsbestand laden in de rechterbovenhoek.
- Nadat de afbeelding is geladen, klikt u op Afbeelding omkeren, zodat de achtergrond van de afbeelding zwart is en de vegen/banden wit.
- Snijd de afbeelding bij met de bovenhoeken vanaf de putjes. Nadat de bijsnijdselectie is gemaakt, klikt u er met de rechtermuisknop in en selecteert u Afbeelding bijsnijden.
- Nadat de afbeelding is bijgesneden, klikt u op Rijstroken berekenen en laat u rijstrookdetectie automatisch plaatsvinden.
- Als de rijstroken niet goed zijn gedetecteerd, bijvoorbeeld als bepaalde rijstroken helemaal niet zijn gedetecteerd, of als er extra of gedeeltelijke rijstroken zijn gedetecteerd, voert u rijstrookaanpassing uit zoals hieronder beschreven.
- Klik op Rijstroken aanpassen en in het pop-upvenster dat wordt geopend, rijstroken toevoegen en / of aanpassen als dat nodig is, en klik op Toepassen en sluiten.
- Nadat u de rijstroken hebt aangepast, moet u ervoor zorgen dat er op elk van de rijstroken een rode stip te zien is en past u de ladders aan met de knop Ladder Fit , zodat het aantal pieken in beide ladderbanen zich in dezelfde positie bevindt. Verwijder eventuele externe pieken met de knop Extremum verwijderen .
- Nadat de ladders zijn aangepast, selecteert u Lane Profiles, klikt u op Ladder Fit en selecteert u Polynomial Fit.
- Klik op Trendline, zoals aanbevolen door de software, en selecteer vervolgens Gecorrigeerd in de volgende optie.
- Klik op Resultaten ophalen om de resultaten weer te geven als een tabel, waarin de rij Gemiddelde TRF de telomeerlengtemeting van de respectievelijke rijstrookmonsters is.
- Klik op Alles opslaan om de resultaten op te slaan in de vorm van een spreadsheet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Het geëxtraheerde genomische DNA (gDNA), dat werd uitgevoerd op een 1% agarose-gel, vertoonde een goede integriteit, zoals weergegeven in figuur 1B, wat aangeeft dat het monster kon worden gebruikt voor verdere downstream-verwerking van TRF's. De TRF-test werd vervolgens uitgevoerd door de volumes van de oplossingen die bij elke stap nodig waren, te wijzigen (zie tabel 1 en tabel 2). Het TRF-signaal was duidelijk zichtbaar (figuur 3). Door de oplossingsvolumes en -concentraties te wijzigen, konden dus meer monsters worden verwerkt zonder enig negatief effect op de resultaten en kon de telomeerlengte met succes worden bepaald met behulp van vrij beschikbare software zoals Telotool10.
Figuur 1: Isolatie en kwaliteitscontrole van genomisch DNA. (A) Drie verschillende scheidingsfasen verkregen bij centrifugatie na toevoeging van fenol:chloroform:isoamylalcohol. De bovenste waterige laag bevat het gDNA, de interfase bevat de eiwitten en de onderste, organische fase bevat het afgebroken RNA, celresten en lipiden. (B) Een afbeelding van een 1% agarosegel met intact onverteerd gDNA. Baan 1 toont een ladder van 1 kb en baan 2 toont onverteerd gDNA van de kankercellijn A2780. Afkorting: gDNA = genomisch DNA. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Illustratie van southern blotting transfer setup. Representatief diagram met de systeemassemblage voor de overdracht van telomeerherhalingsuitstrijkjes van de gel naar het nylonmembraan door capillaire werking. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Chemiluminescentiedetectie van TRF's post-Southern blotting en hybridisatie. Blot toont een reeks telomerische herhalingen als een uitstrijkje in baan 2. Baan 1 toont een moleculaire marker, met de molecuulgewichten (kb) van de banden aangegeven aan de linkerkant. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Tabel 1: Lijst van in dit protocol gebruikte reagentia. De tabel bevat reagentia die in het laboratorium zijn voorbereid, samen met hun opslaggegevens, het aanbevolen gebruik van de TAGGG-telomeerlengtetestkitreagentia en hun gewijzigde gebruiksvolumes, volgens de optimalisatie in dit protocol. Klik hier om deze tabel te downloaden.
Tabel 2: Lijst van in de handel verkrijgbare reagentia met gewijzigde gebruiksinstructies. De tabel bevat in de handel verkrijgbare reagentia, samen met verschillende verdunningen, hun opslagdetails en hun aanbevolen gebruik door de TAGGG-telomeerlengtetestkit en gewijzigde gebruiksvolumes, volgens de optimalisatie in dit protocol. Klik hier om deze tabel te downloaden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
We beschrijven een gedetailleerde procedure voor een niet-radioactieve, op chemiluminescentie gebaseerde methode voor telomeerlengtemeting met behulp van Southern blotting. Het protocol is getest om het oordeelkundig gebruik van verschillende reagentia mogelijk te maken zonder afbreuk te doen aan de kwaliteit van de resultaten. De prehybridisatie- en hybridisatiebuffer kan tot vijf keer worden hergebruikt. De enzymconcentratie kan variëren tussen 10-20 U per 1,5-2 μg genomisch DNA zonder de resultaten te beïnvloeden. Verschillende andere kitcomponenten, zoals de DIG-gelabelde moleculaire gewichtsmarker en hybridisatiesonde, kunnen worden gebruikt bij lagere concentraties dan aanbevolen. De geoptimaliseerde volumes zijn aangegeven in tabel 2. We hebben ze getest op de helft van de aanbevolen volumes / concentraties en vonden optimale prestaties. Het volgen van deze stappen verlaagt de kosten per monster enorm, waardoor onderzoekers de telomeerlengte met deze methode op grotere schaal kunnen meten.
Er zijn verschillende gepubliceerde TRF-protocollen. We hebben het commercieel beschikbare kitprotocol geoptimaliseerd om het kosteneffectief te maken. Dit protocol verschilt van sommige van de gepubliceerde protocollen omdat het geen radioactiviteit11,12 gebruikt. Het is ook relatief eenvoudig, omdat het de kitcomponenten gebruikt in plaats van interne reagentia te bereiden, met name de telomeersonde13.
Als het uiteindelijke beeld fragmentarisch is, is het membraan gedeeltelijk opgedroogd tijdens de incubatie. Om dit op te lossen, moet men het oplossingsvolume verhogen of met een hogere snelheid roeren. Als er geen uitstrijkjes zichtbaar zijn op de vlek, dan kan er een probleem zijn geweest tijdens de zuidelijke overdracht. Daarnaast kan er een probleem zijn geweest in de DNA-kwantiteit of -kwaliteit.
Er zijn enkele beperkingen aan deze methode. Ten eerste duurt genomische DNA-extractie en kwantificering meer dan 4 dagen op basis van de bron van het DNA14. DNA met een hoger molecuulgewicht heeft meer tijd nodig om te rehydrateren en te homogeniseren, waardoor kwantificering en nauwkeurig pipetteren moeilijk zijn. Ten tweede is het TRF-protocol lang (minimaal 2 dagen) en vereist het geschoolde laboratoriummedewerkers om te implementeren. Het is ook een dure methode vanwege de reagentia en de benodigde hoeveelheden. Het TRF-protocol meet ook de gemiddelde telomeerlengte in elk monster, in tegenstelling tot de kortste telomeerlengte die TESLA meet of de telomeerlengte per cel die op flowcytometrie gebaseerde methoden15 bieden. Een andere beperking van TRF-analyse met behulp van de enzymen die hier worden gebruikt, is een overschatting van de telomeerlengte, omdat deze enzymen geen restrictieplaats hebben in de sub-telomereregio's 15.
Ondanks de beperkingen zijn er echter redenen waarom deze methode nog steeds wordt beschouwd als de gouden standaard voor telomeerlengtemeting. Telomeerlengtes worden nauwkeurig weergegeven in absolute waarden-in kilobaseparen (kbp).
Deze methode kan worden gebruikt om de gemiddelde telomeerlengte te meten in verschillende celtypen, van cellijnen16,17 tot buffy coat pellets18,19. Dit maakt het een robuuste methode om te gebruiken in verschillende soorten onderzoeken. Het kan ook worden gebruikt in grootschalige epidemiologische studies en in studies waar op cellen gebaseerde therapieën worden ontwikkeld.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben geen belangenconflicten.
Acknowledgments
We willen mevrouw Prachi Shah bedanken voor het feit dat ze ons in eerste instantie heeft geholpen met de protocoloptimalisatie. We willen Dr. Manoj Garg bedanken voor het leveren van de A2780 eierstokkanker cellijn. EK wordt ondersteund door een onderzoekssubsidie van het Department of Biotechnology (No. BT / RLF / Re-entry / 06/2015), Department of Science and Technology (ECR / 2018 / 002117) en NMIMS Seed Grant (IO 401405).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cell Line | |||
| A2780 (Ovarian adenocarcinoma cell line) | Received as a gift | ||
| Equipment | |||
| ChemiDoc XRS+ (for imaging and UV cross linking) | Biorad | Universal hood II (721BR14277) | |
| Nanodrop (Epoch 2) | Biotek | EPOCH2 | |
| Software | |||
| TeloTool | Version 1.3 | ||
| Materials | |||
| Acetic Acid | Molychem | 64-19-7 | |
| Agarose | MP | 180720 | |
| Amphotericin B | Gibco, ThermoFisher Scientific, USA | 15240062 | |
| DMEM | HyClone, Cytiva, USA | SH30243.01 | |
| Ethylenediamine tetraacetic acid | Molychem | 6381-92-6 | |
| HI FBS | Gibco, ThermoFisher Scientific, USA | 10270106 | |
| HCl | Molychem | 76-47-01-0 | |
| NaCl | Molychem | 7647-14-5 | |
| NaOH | Molychem | 1310-73-2 | |
| Nylon membrane | Sigma | 11209299001 | |
| Penicillin | Gibco, ThermoFisher Scientific, USA | 15240062 | |
| Sodium dodecyl sulfate | Affymetrix | 151-21-3 | |
| Streptomycin | Gibco, ThermoFisher Scientific, USA | 15240062 | |
| Tris | BIORAD | 77-86-1 | |
| Tris HCl | Sigma Aldrich | 1185-53-1 | |
| Whatman paper | GE healthcare lifesciences | 1001-917 | |
| Reagents | |||
| 1 kb ladder | NEB | N3232S | |
| 20x SSC | Invitrogen | 15557-036 | |
| Anti DIG AP | Telo TAGGG Telomere Length Assay kit | 12209136001 | |
| Blocking solution 10x | Telo TAGGG Telomere Length Assay kit | 12209136001 | |
| Cutsmart Buffer | NEB | B6004 | |
| Detection buffer 10x | Telo TAGGG Telomere Length Assay kit | 12209136001 | |
| Dig easy hyb | Telo TAGGG Telomere Length Assay kit | 12209136001 | |
| Digestion Buffer | Telo TAGGG Telomere Length Assay kit | 12209136001 | |
| Hinf 1 | Telo TAGGG Telomere Length Assay kit | 12209136001 | |
| Hinf 1 (alternative to kit) | NEB | R0155T | |
| Loading Dye | BIOLABS | N3231S | |
| Maleic acid buffer 10x | Telo TAGGG Telomere Length Assay kit | 12209136001 | |
| Molecular marker | Telo TAGGG Telomere Length Assay kit | 12209136001 | |
| Probe | Telo TAGGG Telomere Length Assay kit | 12209136001 | |
| Rsa 1 | Telo TAGGG Telomere Length Assay kit | 12209136001 | |
| Rsa 1 (alternative to kit) | NEB | R0167L | |
| Substrate | Telo TAGGG Telomere Length Assay kit | 12209136001 | |
| Wash buffer | Telo TAGGG Telomere Length Assay kit | 12209136001 |
References
- Greider, C. W.
- Valdes, A. M., et al. Obesity, cigarette smoking, and telomere length in women. Lancet. 366 (9486), 662-664 (2005).
- Allsopp, R. C., et al. Telomere length predicts replicative capacity of human fibroblasts. Proceedings of the National Academy of Sciences. 89 (21), 10114-10118 (1992).
- Epel, E. S., et al. Accelerated telomere shortening in response to life stress. Proceedings of the National Academy of Sciences. 101 (49), 17312-17315 (2004).
- Canela, A., Vera, E., Klatt, P., Blasco, M. A. High-throughput telomere length quantification by FISH and its application to human population studies. Proceedings of the National Academy of Sciences. 104 (13), 5300-5305 (2007).
- Révész, D., Milaneschi, Y., Verhoeven, J. E., Penninx, B. W. Telomere length as a marker of cellular aging is associated with prevalence and progression of metabolic syndrome. The Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism. 99 (12), 4607-4615 (2014).
- Rizvi, S., Raza, S. T., Mahdi, F. Telomere length variations in aging and age-related diseases. Current Aging Science. 7 (3), 161-167 (2014).
- Mender, I., Shay, J. W. Telomere restriction fragment (TRF) analysis. Bio-Protocol. 5 (22), e1658 (2015).
- Zhu, Y., Liu, X., Ding, X., Wang, F., Geng, X. Telomere and its role in the aging pathways: telomere shortening, cell senescence and mitochondria dysfunction. Biogerontology. 20 (1), 1-16 (2019).
- Göhring, J., Fulcher, N., Jacak, J., Riha, K. TeloTool: a new tool for telomere length measurement from terminal restriction fragment analysis with improved probe intensity correction. Nucleic Acids Research. 42 (3), 21 (2014).
- Jenkins, F. J., Kerr, C. M., Fouquerel, E., Bovbjerg, D. H., Opresko, P. L. Modified terminal restriction fragment analysis for quantifying telomere length using in-gel hybridization. Journal of Visualized Experiments. (125), e56001 (2017).
- Fojtová, M., Fajkus, P., Sováková, P. P., Fajkus, J. Terminal restriction fragments (TRF) method to analyze telomere lengths. Bio-protocol. 5 (23), e1671 (2015).
- Kimura, M., et al. Measurement of telomere length by the Southern blot analysis of terminal restriction fragment lengths. Nature Protocols. 5 (9), 1596-1607 (2010).
- Trigodet, F., et al. High molecular weight DNA extraction strategies for long-read sequencing of complex metagenomes. Molecular Ecology Resources. 22 (5), 1786-1802 (2022).
- Lai, T. P., Wright, W. E., Shay, J. W. Comparison of telomere length measurement methods. Philosophical Transactions of the Royal Society of London. Series B, Biological Sciences. 373 (1741), 20160451 (2018).
- Mochida, A., et al. Telomere size and telomerase activity in Epstein-Barr virus (EBV)-positive and EBV-negative Burkitt's lymphoma cell lines. Archives of Virology. 150 (10), 2139-2150 (2005).
- Gupta, N., et al. Replicative senescence, telomere shortening and cell proliferation rate in Gaddi goat's skin fibroblast cell line. Cell Biology International. 31 (10), 1257-1264 (2007).
- Michaeli, J., et al. Leukocyte telomere length correlates with extended female fertility. Cells. 11 (3), 513 (2022).
- Lesmana, A., et al. Continuous reference intervals for leukocyte telomere length in children: the method matters. Clinical Chemistry and Laboratory Medicine. 59 (7), 1279-1288 (2021).
