Summary
Et billigt elektroencefalografisk registreringssystem kombineret med en millimeterstor spole foreslås at drive transkraniel magnetisk stimulering af musehjernen in vivo. Ved hjælp af konventionelle skrueelektroder med et specialfremstillet, fleksibelt multielektrode array-substrat kan multi-site optagelse udføres fra musehjernen som reaktion på transkraniel magnetisk stimulering.
Abstract
Et billigt elektroencefalografisk (EEG) registreringssystem foreslås her for at drive transkraniel magnetisk stimulering (TMS) af musehjernen in vivo ved hjælp af en millimeterstor spole. Ved hjælp af konventionelle skrueelektroder kombineret med et specialfremstillet, fleksibelt multielektrode array-substrat kan multi-site optagelse udføres fra musehjernen. Derudover forklarer vi, hvordan en millimeterstor spole produceres ved hjælp af billigt udstyr, der normalt findes i laboratorier. Praktiske procedurer til fremstilling af det fleksible multielektrode array-substrat og den kirurgiske implantationsteknik til skrueelektroder præsenteres også, som er nødvendige for at producere støjsvage EEG-signaler. Selvom metoden er nyttig til registrering fra hjernen hos ethvert lille dyr, fokuserer denne rapport på elektrodeimplementering i et bedøvet musekranium. Desuden kan denne metode let udvides til et vågent lille dyr, der er forbundet med fastgjorte kabler via en fælles adapter og fastgjort med en TMS-enhed til hovedet under optagelse. Den nuværende version af EEG-TMS-systemet, som maksimalt kan omfatte 32 EEG-kanaler (en enhed med 16 kanaler præsenteres som et eksempel med færre kanaler) og en TMS-kanalenhed, beskrives. Derudover rapporteres typiske resultater opnået ved anvendelse af EEG-TMS-systemet på bedøvede mus kort.
Introduction
Transkraniel magnetisk stimulering (TMS) er et lovende værktøj til menneskelig hjernevidenskab, klinisk anvendelse og dyremodelforskning på grund af dets ikke-/lave invasivitet. I den tidlige fase af TMS-applikationer var måling af den kortikale effekt som reaktion på enkelt- og parpuls-TMS hos mennesker og dyr begrænset til den motoriske cortex; Let målbar ydelse var begrænset til motorfremkaldte potentialer og inducerede myoelektriske potentialer, der involverede motorcortex 1,2. For at udvide hjerneområderne, der kan måles ved TMS-modulation, blev elektroencefalografisk (EEG) optagelse integreret med enkelt- og parpuls-TMS som en nyttig metode til direkte at undersøge excitabilitet, forbindelse og rumlig tidsmæssig dynamik i områder i hele hjernen 3,4,5. Således er samtidig anvendelse af TMS- og EEG-optagelse (TMS-EEG) til hjernen blevet brugt til at undersøge forskellige overfladiske kortikale hjerneområder hos mennesker og dyr for at undersøge intrakortikale neurale kredsløb (se Tremblay et al.6). Desuden kan TMS-EEG-systemer anvendes til at undersøge yderligere kortikale spatiotemporale egenskaber, herunder udbredelse af signaler til andre kortikale områder og generering af oscillerende aktivitet 7,8.
Imidlertid forbliver virkningsmekanismen for TMS i hjernen spekulativ på grund af TMS's ikke-invasivitet, hvilket begrænser vores viden om, hvordan hjernen fungerer under TMS-applikationer. Derfor er invasive translationelle undersøgelser hos dyr, der spænder fra gnavere til mennesker, af afgørende betydning for at forstå mekanismen for virkningerne af TMS på neurale kredsløb og deres aktivitet. Navnlig for kombinerede TMS-EEG-forsøg på dyr er der ikke udviklet et samtidigt stimulerings- og målesystem intensivt for små dyr. Derfor er eksperimentalister forpligtet til at konstruere et sådant system ved forsøg og fejl i henhold til deres specifikke eksperimentelle krav. Derudover er musemodeller nyttige blandt andre in vivo-dyreartsmodeller, fordi mange transgene og stammeisolerede musestammer er tilgængelige som biologiske ressourcer. Således ville en bekvem metode til at opbygge et TMS-EEG-kombineret målesystem til mus være ønskeligt for mange neurovidenskabsforskere.
Denne undersøgelse foreslår en TMS-EEG-kombineret metode, der kan anvendes til samtidig stimulering og registrering af musehjernen, som er den vigtigste type transgene dyr, der anvendes i forskning, og som let kan konstrueres i typiske neurovidenskabelige laboratorier. For det første beskrives et billigt EEG-registreringssystem ved hjælp af konventionelle skrueelektroder og et fleksibelt substrat til reproducerbart at tildele en elektrodearray-position i hvert eksperiment. For det andet er et magnetisk stimuleringssystem konstrueret ved hjælp af en millimeterstor spole, som let kan skræddersys i typiske laboratorier. For det tredje registrerer det TMS-EEG-kombinerede system neural aktivitet som reaktion på lyd og magnetisk stimulering. Metoden præsenteret i denne undersøgelse kan afsløre de mekanismer, der genererer specifikke lidelser hos små dyr, og resultaterne opnået i dyremodellerne kan oversættes for at forstå de tilsvarende menneskelige lidelser.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
I denne undersøgelse blev alle dyreforsøg udført efter National Institutes of Health Guide for Care and Use of Laboratory Animals og med godkendelse fra Institutional Animal Care and Use Committee of Hokkaido University. C57BL/6J-mus, to han- og tre hunmus, 8 til 10 uger gamle, blev anvendt til denne undersøgelse. Dette er en terminal procedure. Dyrene blev hentet fra en kommerciel kilde (se materialetabel).
1. Fleksibelt todimensionelt array-design og konstruktion
- Forbered det nødvendige antal miniatureskrueelektroder (rustfri, SUS XM7; se materialetabel) med følgende strukturelle egenskaber til brug som EEG-registrerings- og referenceelektroder: nominel diameter, halslængde og hoveddiameter på henholdsvis 0,6 mm, 1,5 mm og 1,1 mm (figur 1A).
BEMÆRK: I denne undersøgelse blev der anvendt 16 miniatureskrueelektroder. - Forbered en plan for et trykt kredsløbsdiagram på et fleksibelt substrat ved at følge nedenstående trin.
- Opret et todimensionelt (2D) elektrodepudemønster på et fleksibelt underlag (hel størrelse, 41,2 mm × 19,9 mm; se materialetabel) til skrueelektroderne, der skal læses ud. Design 2D-elektrodearrangementet. Figur 1B viser de særlige arrangementer, der er anvendt i denne undersøgelse, og de relative koordinater fra et basispunkt (kryds markeret ved udgangspunktet [0, 0]).
BEMÆRK: I denne undersøgelse, for at registrere neural aktivitet i den auditive cortex i tindingelapperne, var elektrodeplaceringen i lateral til medial (vandret) retning længere end i rostral-til-kaudale (lodrette) retning (figur 1B). - Sørg for, at hver kobberpude (se materialetabel) på det fleksible underlag for EEG-registreringselektroderne har en ringform med en ydre diameter på 1,3 mm og en indvendig diameter på 0,8 mm (figur 1C, venstre). Lav et lille hul (0,8 mm diameter) i midten for hver skrueelektrode at passere gennem underlaget. For referenceelektroderne skal hver kobberpude have en firkantet form med en sidelængde på 1,4 mm; På samme måde skal du lave et lille hul (0,8 mm diameter) i midten, så hver skrue passerer gennem den firkantede pude på underlaget (figur 1C, højre).
- For derefter at lodde et overflademonteret stik (figur 1D, venstre), design udlæsningspuder (2D-array), der fører til stikket (figur 1D, højre). Brug f.eks. et stik med 2 × 10 ben og en 1,27 mm stigning mellem tilstødende ben (figur 1D, højre).
- Tilslut skrueelektrodepuderne og forbindelsespuderne ved hjælp af både overflade- og baglaget med en linjebredde på 0,03 mm og linjeinterval på 0,03 mm (tynde linjer i figur 1E).
- For at forbinde reference- og jordkanalerne til forstærkeren skal du desuden forbinde elektrodepuderne til reference- og jordelektroderne til den isolerede del på ydersiden af det fleksible 2D-array (to lodrette rektangler angivet med "G" og "HR" nederst i figur 1E). Når du har bestemt reference- og jordkanalerne, skal du huske at lodde elektrodepuderne til de tilsvarende stik (se trin 2.1).
- Design et udsat område korrekt, der ikke er dækket af et beskyttelseslag (polyimidlag). Udsæt forbindelsespuderne i overfladelaget, mens skrueelektrodepuderne udsættes i både overflade- og baglagene. Hele elektrodedesignet, størrelserne og det fremstillede fleksible 2D-array er illustreret i figur 1E, og billedet af et fremstillet substrat er vist i figur 1F.
- I den øverste elektrodedel (hoveddel) i det fleksible 2D-array skal du sikre dig, at trelagsstrukturen fra top til bund består af følgende (samlet tykkelse på 49,0 μm): et øverste kobberlag (12,0 μm tykkelse), et mellemlag af kernepolyimid (25,0 μm) og et bundkobberlag (12,0 μm) (figur 1G, øverst).
- Æts kobberlagene på underlagets øverste og nederste overflade, for eksempel ved hjælp af vådætsning og standardfremstillingsteknikken9.
- I den nederste firkantede pad-del (forbindelsesdel) i det fleksible 2D-array skal du sikre dig, at strukturen i seks lag består af tre lag, herunder et øverste kobberlag (12,0 μm tykkelse), et midterste kernepolyimidlag (25,0 μm) og et bundkobberlag (12,0 μm), som er klemt sammen af beskyttende polyimidlag, inklusive øverste og nederste lag (begge 12,5 μm). Fastgør en 2 mm polyimidplade fra bunden som forstærkningsmateriale (figur 1G, bund).
BEMÆRK: For at bevare fleksibiliteten er forstærkningspolyimidpladen ikke monteret på halsdelen af det fleksible 2D-array mellem hoved- og forbindelsesdelen. - På samme måde ætses kobber- og beskyttelsespolyimidlagene i stikdelen på toppen ved hjælp af vådætsning og standardfremstillingsteknikken.
BEMÆRK: Den samlede vægt af den fremstillede, fleksible 2D-array-enhed, inklusive stikket, er 0,84 g. Efter design af et layout til et fleksibelt 2D-array, anbefales substraterne fra en kommerciel producent (se materialetabellen) nogle gange for nemheds skyld.
- Opret et todimensionelt (2D) elektrodepudemønster på et fleksibelt underlag (hel størrelse, 41,2 mm × 19,9 mm; se materialetabel) til skrueelektroderne, der skal læses ud. Design 2D-elektrodearrangementet. Figur 1B viser de særlige arrangementer, der er anvendt i denne undersøgelse, og de relative koordinater fra et basispunkt (kryds markeret ved udgangspunktet [0, 0]).
Figur 1: Komponenter i det fleksible todimensionale (2D) array til elektroencefalografisk (EEG) optagelse og det fremstillede udstyr, herunder arrayet. (A) Den miniature skrueelektrode, der er indlejret i musekraniet. (B) De konstruerede elektrodepuder til måling af hjerneaktivitet (grønne cirkler) og referencekanalen (firkant nederst til højre). De relative koordinater for elektrodepuderne fra et referencepunkt (krydsmærke) ved oprindelsen (0, 0) vises; Størrelsen i millimeter er illustreret i parentes. Elektrodepudernes midterkoordinater er symmetriske i forhold til den lodrette akse, der passerer gennem tværmærket. (C) Elektrodepuderne og borehullerne til en optageelektrode (venstre) og en referenceelektrode (højre) er illustreret. (D) Et overflademonteret stik (2 × 10 ben), der bruges til det fleksible 2D-array (venstre) og mønsteret og størrelsen af de designede puder på underlaget (højre). (E) Designet plan med størrelsen af hver del i millimeter. (F) Billede af et fabrikeret substrat angivet i tegningen i E. (G) Lagstrukturen i det fleksible 2D-array (hoved- og stikdele). Top- og sidevisningerne af skrueelektrodepuderne (øverst) og udlæsningspuderne (nederst) er illustreret. Hovedet og forbindelsesdelene består af henholdsvis en trelags struktur (øverst) og en sekslags struktur (bund). Derudover består halsdelen af en femlags struktur; Et beskyttende polyimidlag er monteret på over- og bagsiden, og forstærkningspolyimidpladen er ikke monteret på nakkedelen. Klik her for at se en større version af denne figur.
2. Adapterkonstruktion og kanalkortlægning
- Udfør adapterkonstruktion ved at følge nedenstående trin.
- Spred loddestrømmen på 2 × 10-polen, overflademonteringsstikket (figur 1D, venstre) og forbindelsespuderne på 2D-arrayet (figur 1D, højre) (se materialetabellen) på det fleksible substrat.
- Lod det 2 × 10 ben, overflademonterede stik til forbindelsespuderne. Bekræft især forbindelsen mellem de to puder på den nederste del af 2D-arrayet og de to stikstifter, der bruges som reference- og jordkanaler (figur 2A).
- Tilslut hver af de to puder til individuelle ledninger for at føre basissignaler til et eksternt punkt (f.eks. et jordpunkt, der er forbundet med målesystemets jordkanal; Figur 2A).
BEMÆRK: I denne undersøgelse blev en af de cirkulære elektrodepuder med skrueelektroder imidlertid brugt som referenceelektrode i stedet for en firkantet elektrode i forbindelsesdelen. - Efter lodning skal du dække loddepunkterne ved hjælp af epoxyharpiks (se materialetabellen) for at beskytte de udsatte punkter og forhindre kortslutning.
- Fastgør stikkablet og hovedforstærkeren ved at følge nedenstående trin.
- Forbered et isolerings-forskydningsstik (IDC) med 2 × 10 ben og en 1,27 mm stigning (figur 2B, øverst til venstre) og et fladt 20-benet båndkabel (se materialetabellen) med en stigning på 0,635 mm (figur 2B, nederst til venstre). Klip det flade båndkabel til den ønskede længde (f.eks. 40 cm).
- Krympe IDC'en og den ene ende af det flade båndkabel ved hjælp af et IDC-krympeværktøj (figur 2B øverst til højre) (se materialetabellen).
- Hver linje i den anden ende af kablet adskilles op til ca. 15 mm fra spidsenden ved hjælp af en fræser. Fjern isoleringen 3 mm fra spidsenden.
- Tilslut den krympede IDC til det flade båndkabel og 2 × 10-polet stik loddet til det fleksible substrat (figur 2C).
- Bekræft korrespondancen mellem optageelektroden og kablets adskilte linje. Sørg for, at hver linje, der bruges, ikke giver en forkert forbindelsesfejl.
- Lodde de eksponerede kobbertråde på de enkelte linjer svarende til udgangen fra hver elektrode til målesystemets 20-polet stik (1,25 mm stigning), inklusive hovedforstærkeren (figur 2B, nederst til højre).
- Efter lodning skal du kontrollere ledningen mellem skrueelektrodepuderne og forbindelsesstifterne ved hjælp af et testudstyr (f.eks. En LCR-måler; se materialetabellen).
- Dæk loddepunkterne ved hjælp af epoxyharpiks og afskærmningstape for at beskytte dem mod skader og forhindre kontakt med andre signallinjer.
- Brug epoxyharpiks til at klæbe en tynd rustfri stålstang (diameter: 1,1-1,2 mm; længde: 100 mm) på bagsiden af forbindelsesdelen af 2D-arrayet på det fleksible substrat.
BEMÆRK: Denne rustfri stålstang kan gribes af en mikromanipulatorholder under eksperimenter (figur 2C). - Endelig skal du bekræfte kortlægningen mellem skrueelektroderne og signaludgangskanalerne (figur 2D).
Figur 2: Konstruktion af adapteren til et todimensionelt (2D) elektrodearray på det fleksible substrat og kortlægning af optagekanalen. (A) I forbindelsesdelen er reference- og jordkanalerne forbundet til bundelektrodepuderne med ledninger. Hvis reference- og jordkanalerne bestemmes på forhånd, skal kanalerne tilsluttes de tilsvarende bundelektrodepuder i designfasen. I sådanne tilfælde er lodning af blyledninger til kanalerne og elektrodepuderne unødvendig. (B) Isolationsfortrængningsstik (øverst til venstre) krympes til den ene ende af det flade kabel (nederst til venstre) for at forbinde måleforstærkerstikket (øverst til højre). Alle linjer, der svarer til de kanaler, der skal bruges, loddes til de grønne stik (nederst til højre). I dette tilfælde, fordi hvert grønt stik, der er tilsluttet hovedforstærkeren, er tildelt til en otte-kanals måling, er der brug for mindst to stik til at optage 16-kanals hjerneaktivitetssignaler. De loddede punkter er dækket af epoxyharpiks og afskærmningstape for at forhindre kontakt med andre signallinjer. (C) Stikket og det fremstillede kabel er placeret på overfladen af det fleksible 2D-array-substrat. Den tynde rustfri stålstang er fastgjort til bagsiden af det fleksible underlag. (D) Den rumlige placering af registreringskanaler på musens hjerneoverflade og kanalkortene for hvert punkt for målesystemet vises. I dette tilfælde er der 16 optagekanaler med skrueelektroder (røde cirkler), selvom det samlede antal mulige optagelsessteder er 32. De andre 16 ikke-optagende kanaler vises også som grønne cirkler på hjerneoverfladen. I kortlægningsplottet angiver "G" og "R" kanalerne designet til henholdsvis jord- og referenceelektroder. Klik her for at se en større version af denne figur.
3. Dyrekirurgi
- Forbered det sterile kirurgiske miljø.
- Brug beskyttelsesudstyr, såsom latexhandsker, under hele forsøgsproceduren, der involverer dyr.
- Steriliser stereotaksiske apparater og kirurgiske instrumenter (se materialetabel).
- Efter sterilisering af de kirurgiske instrumenter vaskes de med sterilt saltvand.
- Bedøv dyrene.
- Mål musens vægt før operationen. Administrer atropinsulfat (0,04 mg/kg; se materialetabel) via intraperitoneal injektion.
- Bedøv musen via en intraperitoneal injektion af en blanding af medetomidin (0,3 mg / kg), midazolam (4,0 mg / kg) og butorphanol (5,0 mg / kg).
- Bekræft bedøvelsesdybden ved hjælp af responsniveauet ved at klemme tåen.
BEMÆRK: Anæstesien slides af efter ca. 40 min. Hvis musen reagerer på en tåklemme, skal du administrere den samme dosis af bedøvelsesblandingen via en intraperitoneal injektion.
- Forbered dig på elektrodeimplantationsoperationen.
- Skær musens knurhår for at forhindre haptisk fornemmelse.
- Smør begge øjne med en oftalmisk salve for at forhindre tørring. Luk øjenlågene for at blokere synssansen og opretholde lukningen ved at klæbe de øvre og nedre øjenlåg med reparationstape.
- Barber håret på musens hoved med elektriske klippere. Indsæt et termometer i endetarmen og hold kropstemperaturen på 37 °C ved hjælp af en varmepude.
- Administrer lidokainhydrochlorid som et aktuelt lokalbedøvelsesmiddel til den del af musens hovedbund, der vil blive indskåret.
- Skær musens hovedbund ved hjælp af en skalpel eller kirurgisk saks i en rostral-til-kaudale retning (arealstørrelse: 7 × 10 mm2).
- Klem hovedbunden nær den indskårne del med pincet og løft. Fjern den synlige membran på kraniet ved hjælp af en skalpel eller kirurgisk saks. Bryd ikke blodkarrene omkring øjnene under operationen.
- Tag fat i huden nær begge centre af hovedbundens snitlinje med tang og udvid den indskårne del for bredt at udsætte toppen af kraniet.
- Bekræft fuldstændig fjernelse af alle membraner på overfladen af kraniet og vævet omkring lambda med kirurgisk saks.
- Våd kraniets overflade med fysiologisk saltvand for at forbedre synligheden af hjerneoverfladen under kraniet og lokalisere den tværgående sinus.
BEMÆRK: Når du implanterer skrueelektroder i kraniet, skal du huske ikke at indlejre dem over og i den tværgående sinus.
4. Elektrodeimplantation
- Fastgør stangen i rustfrit stål, der er monteret på 2D-elektrodearrayet på bagsiden af det fleksible substrat, til en mikromanipulator. Placer det fleksible substrat på kraniet.
- Juster placeringen af kanal (Chs) 3 og 14 (figur 2D) på arrayet, så de passer ind i den ringere colliculus.
BEMÆRK: Den ringere colliculus er placeret langs den tværgående sinus. Vi anbefaler at bekræfte placeringen af den ringere colliculus ved hjælp af et musehjerneatlas på forhånd. - Tegn små cirkler på placeringen af Chs 3, 8, 9 og 14 (figur 2D) på kraniet med en permanent markør til brug som målretningsmærker.
- Tør kraniets overflade for at forbedre vedhæftningen til tandcementen og for elektrisk at isolere 2D-elektrodearrayet på det fleksible substrat fra musekraniet.
- Påfør tandcement (ca. 1 mm tykkelse; se materialetabel) på kraniets overflade. Efter påføring af tandcementen skal du vente ca. 30 minutter på, at den hærder.
- Juster det fleksible substrat i henhold til de små cirkulære mærker på overfladen af kraniet.
- Juster spidsen af en tandbor til hvert elektrodepudehul på det fleksible underlag. Bor forsigtigt ind i kraniet gennem hvert af elektrodehullerne.
- Skru hver af miniatureskrueelektroderne gennem de borede huller i kraniet ved hjælp af en dedikeret skruetrækker til miniatureskruer.
- Krympe hovedet på skrueelektroden og elektrodepuden tæt. Til sidst måles konduktansen mellem hver skrueelektrode og konnektoren med testudstyr (f.eks. En LCR-måler) for at bekræfte elektrisk ledningsevne.
5. Design og konstruktion af små spoler
- Design en kranseformet disk (se supplerende kodningsfil 1) med et hul i midten (indvendig diameter: 2 mm; udvendig diameter: 7 mm; tykkelse: 1 mm) ved hjælp af CAD-software (computerstøttet design) (se materialetabel).
- Brug en 3D-printer til at udskrive to diske (figur 3A, venstre) lavet af ikke-varmebestandigt materiale (f.eks. Polymælkesyrefilament); Ikke-varmebestandigt materiale er ikke altid nødvendigt (se nedenfor).
- Trim en permalloy-45 stang (diameter: 2 mm; se materialetabel) for at danne en kort aksel (længde: 60 mm).
- Indsæt akslen i hvert hul på de to 3D-printede diske (figur 3A, højre). Placer den ene skive for enden af akslen og den anden 11 mm fra enden, hvilket resulterer i en afstand på 10 mm mellem de to diske. Overhold diskene med øjeblikkelig lim (se materialetabel).
- Fastgør enden af akslen uden disk til en slagdriver (figur 3B). Fastgør en lille magnet til permalloy-45-akslen. Placer en hall-effektsensor nær magneten 5 mm fra akslen. Tilslut hall-effektsensoren til et dataindsamlingssystem (DAQ; se materialetabel).
- For at tælle antallet af drejninger skal du forberede et computerprogram (se materialetabel), der analyserer udgangssignaler fra hall-effektsensoren gennem DAQ-systemet.
- Tilslut en tynd kobbertråd (diameter: 0,16 mm) til akslen, og fastgør den øverste ende af ledningen med øjeblikkelig lim.
- Brug slagdriveren til at vikle kobbertråden i 1.000 omdrejninger mellem de to diske. Selvom rotationshastigheden er vilkårlig, bruges typisk ca. 5 rotationer pr. Sekund. Hold dig derefter til sårtråden med øjeblikkelig lim.
- Fjern de to diske fra akslen. Hvis diskene klæbes stærkt til akslen, smeltes diskene ved hjælp af en varmepistol.
- Dæk spolen med epoxyharpiks for at isolere og fastgøre overfladen. Skær derefter den afviklede akseldel af som overskud.
- Sørg for, at den opnåede spole har en højde på 10 mm og en diameter på 6 mm (figur 3B, venstre). Til spolemanipulation skal du enten konstruere en spoleholder (figur 3C, højre) eller fastgøre en rustfri stålstang til spolen (ikke vist her).
- Mål spolens modstand og induktans ved hjælp af en LCR-måler (se materialetabellen). For eksempel havde spolen, der blev brugt her, en jævnstrømsmodstand (DC) på 18,3 Ω og en induktans på 7,9 mH ved 1 kHz vekselstrømsindgang (AC). AC-egenskaberne (modstand og induktans) er vist i figur 3D.
- Brug en funktionsgenerator til at påføre en bipolær firkantbølge på spolen. Den typiske amplitude af indgangsspændingen er 20 V gennem en bipolær strømforsyning med en 10x forstærkning efter en 2 V generatorudgang. Den resulterende bølgeform er en bipolær firkantbølge med en omtrentlig amplitude på 20 V (dvs. en top-til-top-spænding på 40 V) (figur 3E).
- Mål den magnetiske fluxtæthed ved hjælp af hall-effektsensoren og DAQ-systemet. I dette tilfælde var spolens magnetiske fluxtæthed (B) for eksempel 113,6 ±2,5 mT (gennemsnit ± SEM), når spolebunden var i kontakt med hall-effektsensoren (figur 3F).
Figur 3: Lille spole til magnetisk stimulering. (A) Tredimensionel (3D)-trykt disk (venstre). To identiske diske klæbes til permalloy-45-akslen; Den ene er for enden af akslen, og den anden er 10 mm væk (højre). (B) Opsætning til vikling af spolen. 60 mm akslen med de to skiver er fastgjort til en slagdriver. En hall-effekt sensor er placeret nær den lille magnet, der er fastgjort til akslen. Kobbertråden vikles mellem de to diske. (C) Konstrueret spole. Spolen er 10 mm høj, 6 mm i diameter og har 1.000 omdrejninger af kobbertråd. Højre side af figuren viser spolen manipuleret af en 3D-printet spoleholder. D) Spolens vekselstrømsegenskaber registreret af en LCR-måler: (øverst) modstand versus sinusformet indgangsfrekvens; (nederst) induktans versus indgangsfrekvens. En typisk spole har en modstand og induktans på henholdsvis 21,6 og 7,9 mH ved 1 kHz vekselstrømsindgang. E) Bifasisk rektangulær bølgeform, der anvendes som spoleindgang registreret af et oscilloskop. (F) Forholdet mellem magnetisk fluxtæthed og afstanden mellem en konstrueret spole og hall-effect sensoren. Den magnetiske fluxtæthed blev registreret af fem forskellige hall-effekt sensorer, en gang for hver sensor. Gennemsnittet af fem målinger er plottet, og fejlbjælker repræsenterer standardfejlene i middelværdien. Klik her for at se en større version af denne figur.
6. Signaloptagelsessystem og -procedure
- Tilslut det fleksible 2D-array til optagesystemet (se Materialetabel) med det flade båndkabel.
- Fastgør stangen i rustfrit stål, der er monteret på spolen, til en mikromanipulator (se materialetabellen).
- Placer spolen over bregma og juster positionen i kaudale retning for at lokalisere brændpunktet over den ringere colliculus. Omdrejningspunktet for det emitterende elektriske felt er midterlinjen af sårområdet på spolens bundoverflade (dvs. 1 mm fra kanten til midten).
- Forbered et stimuleringssystem bestående af en bipolær strømforsyning og en funktionsgenerator (se materialetabel), og tilslut spolen til systemet.
- Tilslut et kabel mellem funktionsgeneratorens indgangsterminal og DAQ-systemets udgangsterminal for at anvende triggersignaler på funktionsgeneratoren fra DAQ-systemet. Forbered et passende computerprogram til triggersignaler for at starte stimuli. Tilslut desuden DAQ-systemet til optagesystemet for at gemme stimuleringstiderne som tidsstempler.
- Start anskaffelsesprocessen for optagesystemet.
BEMÆRK: Hvis optagesystemet opfanger støj, skal du finde støjkilden og reducere den. - Test den magnetiske stimulering ved at udløse stimuleringssystemet.
BEMÆRK: Hvis støjen fra den magnetiske stimulering mætter måleområdet, skal du justere området korrekt. Kontroller desuden, at optagesystemet gemmer stimuleringstidsstemplerne korrekt. - Start med at registrere responsdataene, og begynd stimuleringssessioner. Stop optagelsen, når hver stimuleringssession er afsluttet. Gem alle registrerede data til efterfølgende analyse.
BEMÆRK: For at udføre alle eksperimentelle betingelser med fem forskellige magnetiske intensiteter var den samlede tid, der kræves til alle sessioner, ca. 75 minutter. Slutpunktet blev normalt bestemt, når alle optagelsessessionerne var overstået. Men da dyrene viste kliniske tegn, herunder hoste, besværet vejrtrækning og gispende, blev forsøgssessionen straks afsluttet. Til eutanasi blev halshugning udført ved hjælp af skarp, ren saks, mens dyrene var under bedøvelse.
7. Analyse af data
- Filtrer bredbåndssignalet (rå) ved hjælp af et lavpasfilter med en afskæringsfrekvens på 200 Hz.
- Indsaml filtrerede bølgeformer i løbet af et tidsvindue omkring hvert stimuleringstidsstempel. Gennemsnit bølgeformerne for at opnå de begivenhedsrelaterede potentielle bølgeformer (ERP) (figur 4 og figur 5).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Prøve EEG-data registreret i bedøvede C57BL/6J-mus med det fleksible substrat kombineret med skrueelektroderne er præsenteret nedenfor.
Som et typisk eksempel vises de gennemsnitlige EEG-bølgeformer, der genereres som reaktion på lydstimulering (8 kHz toneudbrud, 80 dB lydtrykniveau [SPL]) for 60 forsøg med identiske stimuli (figur 4A). Et skema over kortlægning af optagelseskanaler er også præsenteret midt i figur 4A. Svarene fra Chs 5, 7, 10 og 12 registreres fra områder nær den auditive cortex i begge temporale lobes. I de enkelte EEG-bølgeformer af kanalerne placeret omkring de auditive områder (den ringere colliculus og auditive cortex) var responserne eksklusive stimuleringsartefakterne først negative umiddelbart efter lydstimuleringens begyndelse (f.eks. Chs 3 og 10); topamplituderne var henholdsvis 45,6 ± 4,0 μV og 25,6 ± 1,5 μV. Svarene var efterfølgende positive - gik til en vis grad over basislinjen (figur 4B, C) og svingede under dæmpning. I modsætning hertil var responser fra andre kanaler næsten uafhængige af stimuleringsstarten, selvom nogle kanalbølgeformer viste lignende reaktioner.
Figur 4: Lydhændelsesrelateret potentiale (ERP) bølgeformer på 16 steder i musehjernen. (A) Som reaktion på lydstimulering (8 kHz toneudbrud, 80 dB SPL) anvendt på en bedøvet mus illustreres 16-kanals ERP-bølgeformer. Skemaet for en musehjerne vises i midten, og de 16 optagelsessteder (røde cirkler) på musens hjerneoverflade er angivet med kanalnumre. I dette tilfælde anvendes 16 optagekanaler; De øvrige 16 ikke-optagekanaler vises som grønne cirkler. (B) Udvidede visninger af ERP-bølgeformer for Ch 3. (C) Udvidede visninger af ERP-bølgeformer for Ch 10. Klik her for at se en større version af denne figur.
Tilsvarende er de gennemsnitlige bølgeformer af EEG-optagelser som reaktion på kort magnetisk stimulering (V in = 60 Vpp) af området nær højre inferior colliculus vist for 60 forsøg med identiske stimuli i figur 5A. Et skema over kortlægning af optagelseskanaler er også præsenteret midt i figur 5A. Fordi stimuleringsspolen var placeret nær området Ch 14, var stimuleringsartefakten størst ved den kanal. Imidlertid blev der observeret relativt store stimuleringsartefakter for de fleste kanaler umiddelbart efter stimuleringens begyndelse, hvilket indikerer, at den magnetiske stimulering påvirkede alle optagelsessteder. Fordi svarene fra Chs 5, 7, 10 og 12 blev registreret fra områder nær den auditive cortex i begge temporale lobes, var de enkelte EEG-bølgeformer eksklusive stimuleringsartefakterne først negative og derefter positive til en vis grad afhængigt af kanalpositionerne (figur 5A-C). I nærheden af de auditive områder var responstidskurser induceret af magnetisk stimulering forskellige fra dem, der blev induceret af lydstimulering. For Chs 3 og 10 var responserne for eksempel negative umiddelbart efter lydstimuleringens begyndelse, selvom topamplituderne var henholdsvis 58,8 ± 4,0 μV og 28,2 ± 2,0 μV. Med stigende magnetiske stimuleringsintensiteter blev topamplituderne for drevne responser for Ch 10 desuden øget (figur 5D), hvilket tyder på, at den magnetiske stimulering, der påvirkes, fremkaldte neurale reaktioner.
Figur 5: Transkraniel magnetisk stimulering (TMS)-drevet begivenhedsrelateret potentiale (ERP) bølgeformer på 16 steder i musehjernen. (A) De 16-kanals ERP-bølgeformer som reaktion på TMS (V in = 60 Vpp), der anvendes på en bedøvet mus, er illustreret. Et skema over en musehjerne vises i midten, og de 16 optagelsessteder (røde cirkler) på musens hjerneoverflade er angivet med kanalnumrene. (B) Udvidede visninger af ERP-bølgeformer for Ch 3. (C) Udvidede visninger af ERP-bølgeformer for Ch 10. (D) Oversigt over amplituderne af kap. 10 ERP'er fremkaldt af forskellige magnetiske intensiteter (indgangsspænding). Til statistisk analyse anvendes en ANOVA til flere sammenligninger efterfulgt af en post-hoc Tukey-Kramer-test. * og *** repræsenterer henholdsvis p < 0,05 og p < 0,001. Forsøgsnummeret for en session er 60 gange for hver tilstand af individuelle dyr. Statistikken opgøres for prøver fra to dyr. Klik her for at se en større version af denne figur.
Denne metode kan også let udvides til et vågent lille dyr, der er forbundet med fastgjorte kabler via en fælles adapter og fastgjort med en TMS-enhed til hovedet under optagelse (supplerende figur 1 og supplerende figur 2).
Supplerende figur 1: Fastgørelse af stimuleringsspolen fastgjort til et musekranium. (A) For en vågen mus vises en stimuleringsspole fastgjort med armaturet fastgjort til musekraniet. (B) Begivenhedsrelaterede potentialer (ERP'er) for den vågne mus blev registreret i en akrylkasse, hvor musen kunne bevæge sig inde i kassen. Klik her for at downloade denne fil.
Supplerende figur 2: Bølgeformer af lyddrevne og transkranielle magnetiske stimuleringsdrevne (TMS)-drevne ERP'er på 16 steder fra hjernen på en vågen mus. (A) Som reaktion på lydstimulering (8 kHz toneudbrud, 80 dB SPL) anvendt på en vågen mus i et akrylhus (supplerende figur 1B) illustreres 16-kanals ERP-bølgeformer. Skemaet for en musehjerne vises i midten, og de 16 optagelsessteder (røde cirkler) på musens hjerneoverflade er angivet med kanalnumre. I dette tilfælde anvendes 16 optagekanaler; De øvrige 16 kanaler, der ikke optages, vises som grønne cirkler. (B) På samme måde illustreres 16-kanals ERP-bølgeformer som svar på TMS (Vin = 60 Vpp) anvendt på den samme vågne mus. Et skema over en musehjerne vises i midten, og de 16 optagelsessteder (røde cirkler) på musens hjerneoverflade er angivet med kanalnumrene. Stimuleringsspolen er placeret nær området Ch 14. Klik her for at downloade denne fil.
Supplerende kodningsfil 1: CAD-datafil til den doughnutformede disk, der kræves til spolekonstruktionen. Klik her for at downloade denne fil.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Denne undersøgelse omhandler et multi-site EEG-registreringssystem kombineret med et magnetisk stimuleringssystem designet til små dyr, herunder mus. Det konstruerede system er billigt og let konstrueret i fysiologiske laboratorier og kan udvide deres eksisterende måleopsætninger. Den kirurgiske procedure, der er nødvendig for at indhente data fra museregistreringssystemet, er dybt enkel, hvis sådanne laboratorier har tidligere erfaring med standard elektrofysiologiske eksperimenter.
En fordel ved at bruge denne tilgang er den gode reproducerbarhed af elektrodeplacering på et enkelt dyrs hoved og hovedbund. Det fleksible substrat, der bruges til at tildele skrueelektroder til hjernemålsteder, replikeres let ved hjælp af standard mikrofabrikationsteknikker, og de samme substrater er også bekvemme til bestemmelse af registreringsstederne fra hovedbunden af hvert dyr. Derudover kan formen på elektrodearrayet let ændres for at optimere forskellige eksperimentelle behov; Tilpassede elektrodearrangementer kan oprettes optimalt til specifikke eksperimentelle formål. Hvis metoden angivet i protokollen følges, kan skrueelektroder, stik, kabler og kirurgiske procedurer let ændres og udvides til et målesystem med et større antal registreringssteder. En anden fordel ved dette optagesystem er dets lave omkostninger, når laboratorier er udstyret med en multikanalforstærker. Det nuværende optagesystem kan hente neurale signaler fra 32 indgangskanaler og op til fire separate kabler. Derfor ville et udvidet 32-kanals optagesystem kræve ekstra kabler, skrueelektroder og modificerede fleksible substrater, og dette udvidede system ville have meget lave omkostninger.
En ulempe ved denne metode er imidlertid den præcise kontrol af dybden af skrueelektroder under implantation. Denne ulempe er dog altid til stede for typiske skrue-EEG-elektroder, og den nøjagtige dybde af skruerne før mortem i forhold til den kortikale overflade er ukendt. Desuden er et andet kritisk punkt i dette system for optagekvaliteten af EEG-signaler og reduktion af støjniveauet passende elektrodekontakt med epidurallaget. Vi bekræfter altid passende elektrodekontakt af alle skrueelektroder gennem impedansmåling. Typisk antyder en impedans på 5-10 kΩ ved 1 kHz passende epidural placering, og impedansværdierne skal bekræftes før neurale signalmålinger.
Derudover påføres tandcement i den nuværende protokol på kraniet før elektrodeimplantation. Den passende mængde tandcement kan påvirke succesen med EEG-signaloptagelser. Det vil sige, at et tyndt lag tandcement på kraniet ikke understøtter de implanterede elektroder eller fastgør elektrodernes position, mens et tykkere lag forhindrer korrekt placering af elektroden (e) for at komme i kontakt med dura-sagen. For at bestemme lagets passende tykkelse målte vi tykkelsen af tandcementen ved hjælp af en digital tykkelse efter vellykkede EEG-optagelser. Den gennemsnitlige tykkelse af et passende cementlag var 0,7 mm, hvilket tyder på, at tandcementlaget kunne erstattes med en "kraniehætte" med en tykkelse på 0,7 mm og små huller til skrueelektroder.
Magnetisk stimulering er et nyttigt værktøj i humane og dyreforsøg til minimalt invasiv eller ikke-invasiv neurostimulering af hjernen. Hurtig ændring af strømmene i en spole skaber et magnetfelt omkring spolen og forårsager hyperpolarisering eller depolarisering af neuronmembraner, når strømmene passerer gennem dyre- og menneskekranier. For dyremodeller tændes aktionspotentialresponser direkte af supratærskelstørrelsen af den elektriske feltændring, mens subtærskelændringer i neurale membraner produceres for at indstille netværksaktiviteten af neurale populationer10. Denne spole er simuleret til at producere et elektrisk felt, der er mere end 10 V / m, op en dybde på 1,8 mm fra hjernens overflade (2,4 mm fra kraniet), svarende til kortikale lag 5/6 eller dybere områder i en typisk (f.eks. C57BL / 6J) mus10. Disse millimeterstore spoler er i stand til at inducere neural aktivitet over tærsklen og kan endda generere et mere lokaliseret elektrisk felt på hjernens overflade sammenlignet med dem, der induceres af tidligere rapporterede spoler11. Selvom tilføjede effekter bestående af flere faktorer, herunder opfattet lyd, kranievibrationer og den termiske effekt, ikke helt kan udelukkes, havde disse individuelle effekter en lille indflydelse på neural aktivitet. Desuden bruger vi som magnetisk kerne permalloy, hvis magnetiske egenskaber normalt afhænger af betingelserne for udglødningsprocessen, herunder kølehastighed, udglødningstemperatur og holdetid12. Imidlertid kunne dens udglødningsforhold ikke kontrolleres, da det var en kommerciel permalloy.
For nylig er kombinerede målesystemer bestående af multi-site EEG-registrering og TMS blevet brugt i medicinske undersøgelser, og deres kliniske anvendelser er steget 4,6. Vores foreslåede tilgang vil forbedre små dyremodeller (især musemodeller) af human neurofysiologi, hvilket kan give en meget lettere oversættelse af eksperimentelle gnavermodelresultater til humane kliniske modstykker ved at tilbyde dyremodeller, der bedre parallelle menneskelige systemer. Endelig kan kombinerede magnetiske og farmakologiske indgreb hos dyr med sensorisk høretab ved hjælp af multi-site optagelsesteknikker i genetisk modificerede mus bidrage til at afsløre de mekanismer, der genererer specifikke auditive lidelser og tinnitus, som er vores fremtidige forskningsmål.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
Dette arbejde blev støttet af Murata Science Foundation, Suzuken Memorial Foundation, Nakatani Foundation for Advancement of Measuring Technologies in Biomedical Engineering og et tilskud til sonderende forskning (bevillingsnummer 21K19755, Japan) og til videnskabelig forskning (B) (bevillingsnummer 23H03416, Japan) til T.T.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 3D printer | Zhejiang Flashforge 3D Technology Co., Ltd | FFD-101 | The printer used for 3D-printing the donut-shaped disks |
| ATROPINE SULFATE 0.5 mg | NIPRO ES PHARMA CO., LTD. | - | Atropine sulfate |
| Bipolar amplifier | NF Corp. | KIT61380 | For amplifying waveforms for coil input |
| Butorphanol | Meiji Seika Pharma Co., Ltd., Tokyo, Japan |
- | For anathesis of animals |
| Commercial manufacturer of flexible 2D array | p-ban.com Corp. | - | URL: https://www.p-ban.com/ |
| Computer prograom to analyze output signals | Natinal Instruments | NI-DAQ and NI-DAQmx Python | To analyze output signals from the hall-effect sensor |
| Connector | Harwin Inc. | G125-FV12005L0P | For connector to conect to the measuring system |
| Copper pad | p-ban.com Corp. | copper | Copper pad on each substrate |
| Copper wire | Kyowa Harmonet Ltd. | P644432 | The windings of the coil |
| DAQ board | National Instruments Corp. | USB-6343 | For measuring the magnitic flux density of the coil |
| Dental cement | SHOFU INC. | Quick Resin | Self-Curing Orthodontic Resin |
| ECoG electrode | NeuroNexus Inc. | HC32 | For reference to design of the flexible 2D array |
| Epoxy resin | Konishi Co. Ltd. | #16123 | For coil construction |
| Ethyl Carbamate | FUJIFILM Wako Pure Chemical Corp. | 050-05821 | For urethan anesthesia |
| Flat ribbon cable | Oki Electric Cable Co., Ltd. | FLEX-B2(20)-7/0.1 20028 5m | For cable to connect between surface-mount connector and measuring sysytem |
| flexible substrate | p-ban.com Corp. | polyimide | Baseplate of flexible substrate |
| Function generator | NF Corp. | WF1947 | For generating waveforms for coil input |
| Hall-effect sensor | Honeywell International Inc. | SS94A2D | For measuring the magnitic flux density of the coil |
| IDC crimping tool | Pro'sKit Industries Co. | 6PK-214 | To crimp the IDC and one end of the flat ribbon cable; Flat cable connector crimping tool |
| Instant glue | Konishi Co. Ltd. | #04612 | For coil construction |
| Insulation-displacement connector (IDC ) | Uxcell Japan | B07GDDG3XG | 2 × 10 pins and a 1.27 mm pitch |
| LCR meter | NF Corp. | ZM2376 | For measuring the AC properties of the coil |
| Manipulator | NARISHIGE Group. | SM-15L | For manipulating the coil |
| Medetomidine | Kobayashi Kako, Fukui, Japan | - | For anathesis of animals |
| Midazolam | Astellas Pharma, Tokyo, Japan | - | For anathesis of animals |
| Miniature screw | KOFUSEIBYO Co., Ltd. | S0.6*1.5 | For EEG-senseing and reference electrode |
| Mouse | Japan SLC, Inc. | C57BL/6J (C57BL/6JJmsSlc) | Experimental animal |
| Permalloy-45 rod | The Nilaco Corp. | 780544 | The core of the coil |
| Recording system | Plexon Inc. | OmniPlex | For EEG data acquisition |
| Stainless wire | Wakisangyo Co., Ltd. | HW-136 | For grasp by manipulator |
| Stereotaxic apparatus | NARISHIGE Group. | SR-5M-HT | To fix a mouse head |
| Surface-mount connector | Useconn Electronics Ltd. | PH127-2x10MG | For connector to mount on the flexible 2D array |
| Testing equipment (LCR meter) | NF Corp. | ZM2372 | Contact check and impedance measurements |
| White PLA filament | Zhejiang Flashforge 3D Technology Co., Ltd | PLA-F13 | The material used for 3D-printing the donut-shaped disks |
| Xylocaine Jelly 2% | Sandoz Pharma Co., Ltd. | - | lidocaine hydrochloride |
References
- Ilmoniemi, R. J., et al. Neuronal responses to magnetic stimulation reveal cortical reactivity and connectivity. Neuroreport. 8 (16), 3537-3540 (1997).
- Hallett, M. Transcranial magnetic stimulation: a primer. Neuron. 55 (2), 187-199 (2007).
- Thut, G., Pascual-Leone, A. Integrating TMS with EEG: How and what for. Brain Topography. 22 (4), 215-218 (2010).
- Ilmoniemi, R. J., Kicic, D. Methodology for combined TMS and EEG. Brain Topograpy. 22 (4), 233-248 (2010).
- Daskalakis, Z. J., Farzan, F., Radhu, N., Fitzgerald, P. B. Combined transcranial magnetic stimulation and electroencephalography: its past, present and future. Brain Research. 1463, 93-107 (2012).
- Tremblay, S., et al. Clinical utility and prospective of TMS-EEG. Clinical Neurophysiology. 130 (5), 802-844 (2019).
- Pellicciari, M. C., Veniero, D., Miniussi, C. Characterizing the cortical oscillatory response to TMS pulse. Frontiers in Cellular Neuroscience. 11, 38 (2017).
- Lin, Y. J., Shukla, L., Dugue, L., Valero-Cabre, A., Carrasco, M. Transcranial magnetic stimulation entrains alpha oscillatory activity in occipital cortex. Scientific Reports. 11 (1), 18562 (2021).
- Takahashi, S., et al. Laminar responses in the auditory cortex using a multielectrode array substrate for simultaneous stimulation and recording. IEEJ Transactions Electrical and Electronic Engineering. 14 (2), 303-311 (2019).
- Yoshikawa, T., Higuchi, H., Furukawa, R., Tateno, T. Temporal and spatial profiles of evoked activity induced by magnetic stimulation using millimeter-sized coils in the mouse auditory cortex in vivo. Brain Research. 1796, 148092 (2022).
- Tang, A. D., et al. Construction and evaluation of rodent-specific rTMS coils. Frontiers in Neural Circuits. 10, 47 (2016).
- Li, L. Controlling annealing and magnetic treatment parameters to achieve high permeabilities in 55 Ni-Fe toroid cores. IEEE Transactions on Magnetics. 37 (4), 2315-2317 (2001).
