Isolamento di nuclei da cellule progenitrici cardiache di topo per il profilo dell'epigenoma e dell'espressione genica a risoluzione di singole cellule
Summary
Qui, presentiamo un protocollo che descrive la preparazione dei nuclei cellulari. Dopo la microdissezione e la dissociazione enzimatica del tessuto cardiaco in singole cellule, le cellule progenitrici sono state congelate, seguite dall’isolamento di cellule vitali pure, che sono state utilizzate per il sequenziamento dell’RNA a singolo nucleo e dal test a nucleo singolo per la cromatina accessibile alla trasposasi con analisi di sequenziamento ad alto rendimento.
Abstract
Il cuore in via di sviluppo è una struttura complessa contenente varie cellule progenitrici controllate da complessi meccanismi di regolazione. L’esame dell’espressione genica e dello stato della cromatina delle singole cellule consente l’identificazione del tipo e dello stato cellulare. Gli approcci di sequenziamento a singola cellula hanno rivelato una serie di importanti caratteristiche dell’eterogeneità delle cellule progenitrici cardiache. Tuttavia, questi metodi sono generalmente limitati al tessuto fresco, il che limita gli studi con diverse condizioni sperimentali, poiché il tessuto fresco deve essere trattato contemporaneamente nello stesso ciclo per ridurre la variabilità tecnica. Pertanto, in quest’area sono necessarie procedure semplici e flessibili per produrre dati da metodi quali il sequenziamento dell’RNA a singolo nucleo (snRNA-seq) e il saggio a nucleo singolo per la cromatina accessibile alla trasposasi con sequenziamento ad alta produttività (snATAC-seq). Qui, presentiamo un protocollo per isolare rapidamente i nuclei per i successivi nuclei singoli dual-omici (combinati snRNA-seq e snATAC-seq). Questo metodo consente l’isolamento di nuclei da campioni congelati di cellule progenitrici cardiache e può essere combinato con piattaforme che utilizzano camere microfluidiche.
Introduction
Tra i difetti alla nascita, i difetti cardiaci congeniti (CHD) sono i più comuni, che si verificano in circa l’1% dei nati vivi ogni anno 1,2. Le mutazioni genetiche sono identificate solo in una minoranza di casi, il che implica che altre cause, come anomalie nella regolazione genica, sono coinvolte nell’eziologia della CHD 2,3. Lo sviluppo cardiaco è un processo complesso di tipi cellulari diversi e interagenti, che rende difficile l’identificazione delle mutazioni causali non codificanti e dei loro effetti sulla regolazione genica. L’organogenesi del cuore inizia con progenitori cellulari che danno origine a diversi sottotipi di cellule cardiache, tra cui cellule miocardiche, fibroblasti, epicardiche ed endocardiche 4,5. La genomica unicellulare sta emergendo come metodo chiave per studiare lo sviluppo del cuore e valutare l’impatto dell’eterogeneità cellulare nella salute e nella malattia6. Lo sviluppo di metodi multi-omici per la misurazione simultanea di diversi parametri e l’espansione di pipeline computazionali ha facilitato la scoperta di tipi e sottotipi cellulari nel cuore normale e malato6. Questo articolo descrive un protocollo affidabile di isolamento a singolo nucleo per cellule progenitrici cardiache congelate ottenute da embrioni di topo che è compatibile con snRNA-seq e snATAC-seq a valle (così come snRNA-seq e snATAC-seq combinati)7,8,9.
ATAC-seq è un metodo robusto che consente l’identificazione delle regioni regolatorie della cromatina aperta e il posizionamento dei nucleosomi10,11. Queste informazioni vengono utilizzate per trarre conclusioni sulla posizione, l’identità e l’attività dei fattori di trascrizione. L’attività dei fattori cromatinici, compresi i rimodellatori, così come l’attività trascrizionale della RNA polimerasi, possono quindi essere analizzate poiché il metodo è altamente sensibile per misurare i cambiamenti quantitativi nella struttura della cromatina 1,2. Pertanto, ATAC-seq fornisce un approccio robusto e imparziale per scoprire i meccanismi che controllano la regolazione trascrizionale in un tipo specifico di cellula. I protocolli ATAC-seq sono stati anche validati per misurare l’accessibilità della cromatina in singole cellule, rivelando variabilità nell’architettura della cromatina all’interno delle popolazioni cellulari10,12,13.
Sebbene negli ultimi anni vi siano stati notevoli progressi nel campo delle singole cellule, la difficoltà principale è l’elaborazione dei campioni freschi necessari per eseguire questi esperimenti14. Per aggirare questa difficoltà, sono stati effettuati vari test con l’obiettivo di condurre analisi come snRNA-seq e snATAC-seq con tessuto cardiaco congelato o cellule15,16.
Diverse piattaforme sono state utilizzate per analizzare i dati genomici di singole cellule17. Le piattaforme ampiamente utilizzate per l’espressione genica di singole cellule e il profilo ATAC sono piattaforme per l’incapsulamento multiplo di goccioline microfluidiche17. Poiché queste piattaforme utilizzano camere microfluidiche, detriti o aggregati possono ostruire il sistema, con conseguente inutilizzabilità dei dati. Pertanto, il successo degli studi su singole cellule dipende dall’isolamento accurato delle singole cellule / nuclei.
Il protocollo qui presentato utilizza un approccio simile a studi recenti che utilizzano snRNA-seq e snATAC-seq per comprendere i difetti cardiaci congeniti 18,19,20,21,22,23. Questa procedura utilizza la dissociazione enzimatica del tessuto cardiaco appena microdissecato seguito dalla crioconservazione delle cellule progenitrici cardiache di topo. Dopo lo scongelamento, le cellule vitali vengono purificate e lavorate per l’isolamento nucleare. In questo lavoro, questo protocollo è stato utilizzato con successo per ottenere dati snRNA-seq e snATAC-seq dalla stessa preparazione nucleare di cellule progenitrici cardiache di topo.
Protocol
Representative Results
Discussion
L’analisi della composizione cellulare del cuore in via di sviluppo mediante studi combinati snRNA-seq e snATAC-seq fornisce una comprensione più profonda dell’origine della cardiopatia congenita26. Diversi laboratori di ricerca hanno studiato gli effetti della crioconservazione dei tessuti cardiaci sull’snRNA-seq27. Condurre snRNA-seq e snATAC-seq utilizzando tessuto fresco micro-sezionato da modelli murini di malattia umana può essere logisticamente impegnativo quando s…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questa ricerca è stata supportata da ERA-CVD-2019 e ANR-JCJC-2020 a SS. Ringraziamo la struttura di genomica e bioinformatica (GBiM) del laboratorio di genetica medica U 1251 / Marsiglia e i revisori anonimi per aver fornito preziosi commenti.
Materials
| 2100 Bioanalyzer Instrument | Agilent | No catalog number | |
| 5M Sodium chloride (NaCl) | Sigma | 59222C-500ML | |
| BSA 10% | Sigma | A1595-50ML | |
| Chromium Next GEM Chip J Single Cell Kit, 16 rxns | 10X Genomics | 1000230 | |
| Chromium Next GEM Single Cell Multiome ATAC + Gene Expression Reagent Bundle, 4 rxns (including Nuclei Buffer 20X) | 10X Genomics | 1000285 | |
| Countess cell counting chamber slides | Invitrogen | C10283 | |
| Countess III FL | Thermofisher | No catalog number | |
| Digitonin (5%) | Thermofisher | BN2006 | |
| DMSO | Sigma | D2650-5x5ML | |
| DNA LoBind Tubes | Eppendorf | 22431021 | |
| D-PBS | Thermofisher | 14190094 | Sterile and RNase-free |
| Dual Index Kit TT Set A 96 rxns | 10X Genomics | 1000215 | |
| Falcon 15 mL Conical Centrifuge Tubes | Fisher Scientific | 352096 | |
| Falcon 50 mL Conical Centrifuge Tubes | Fisher Scientific | 10788561 | |
| HI-FBS | Thermofisher | A3840001 | Heat inactivated |
| High sensitivity DNA kit | Agilent | 5067-4626 | |
| Igepal CA-630 | Sigma | I8896-50ML | |
| LIVE/DEAD Viability/Cytotoxicity Kit | Thermofisher | L3224 | |
| MACS Dead Cell Removal kit: Dead Cell Romoval MicroBeads, Binding Buffer 20X | Miltenyi Biotec | 130-090-101 | |
| MACS SmartStrainers (30 µm) | Miltenyi Biotec | 130-098-458 | |
| Magnesium chloride (MgCl2) | Sigma | M1028-100ML | |
| Milieu McCoy 5A | Thermofisher | 16600082 | |
| MS Columns | Miltenyi Biotec | 130-042-201 | |
| NovaSeq 6000 S2 | Illumina | No catalog number | |
| Penicillin Streptomycin (Pen/Strep) | Thermofisher | 15070063 | |
| PluriStrainer Mini 40µm | PluriSelect | V-PM15-2021-12 | |
| Rock inhibitor | Enzo Life Sciences | ALX-270-333-M005 | |
| Single Index Kit N Set A, 96 rxn | 10X Genomics | 1000212 | |
| Standard 90mm Petri dish Sterilin | Thermofisher | 101R20 | |
| Sterile double-distilled water | Thermofisher | R0582 | |
| Trizma Hydrochloride solution (HCl) | Sigma | T2194-100ML | |
| Trypan Blue stain (0.4%) | Invitrogen | T10282 | |
| Trypsin 0.05% – EDTA 1X | Thermofisher | 25300054 | |
| Tween20 | Sigma | P9416-50ML | |
| Wide orifice filtered pipette tips 200 μl | Labcon | 1152-965-008-9 | |
| ZEISS SteREO Discovery.V8 | ZEISS | No catalog number |
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