단일 세포 분해능에서 후성유전체 및 유전자 발현 프로파일링을 위한 마우스 심장 전구 세포에서 핵 분리
Summary
여기에서 우리는 세포핵 준비를 설명하는 프로토콜을 제시합니다. 심장 조직을 단일 세포로 미세 해부 및 효소 해리한 후, 전구 세포를 동결한 다음, 순수 생존 세포를 분리하여 단일 핵 RNA 시퀀싱 및 고처리량 시퀀싱 분석을 통한 전이효소 접근 가능한 염색질에 대한 단일 핵 분석에 사용했습니다.
Abstract
발달중인 심장은 복잡한 조절 메커니즘에 의해 제어되는 다양한 전구 세포를 포함하는 복잡한 구조입니다. 개별 세포의 유전자 발현 및 염색질 상태를 검사하면 세포 유형 및 상태를 확인할 수 있습니다. 단일 세포 시퀀싱 접근법은 심장 전구 세포 이질성의 여러 가지 중요한 특성을 밝혀냈습니다. 그러나 이러한 방법은 일반적으로 신선한 조직으로 제한되어 기술적 변동성을 줄이기 위해 신선한 조직을 동일한 실행에서 한 번에 처리해야하기 때문에 다양한 실험 조건의 연구를 제한합니다. 따라서 이 분야에서는 단일 핵 RNA 시퀀싱(snRNA-seq) 및 고처리량 시퀀싱(snATAC-seq)을 통한 트랜스포사제 접근 가능한 염색질에 대한 단일 핵 분석과 같은 방법에서 데이터를 생성하는 쉽고 유연한 절차가 필요합니다. 여기에서 우리는 후속 단일 핵 이중 오믹스(결합된 snRNA-seq 및 snATAC-seq)에 대해 핵을 신속하게 분리하는 프로토콜을 제시합니다. 이 방법은 심장 전구 세포의 냉동 샘플에서 핵을 분리 할 수 있으며 미세 유체 챔버를 사용하는 플랫폼과 결합 할 수 있습니다.
Introduction
선천적 결함 중 선천성 심장 결함 (CHD)이 가장 흔하며 매년 출생의 약 1 %에서 발생합니다 1,2. 유전적 돌연변이는 소수의 경우에만 확인되며, 이는 유전자 조절의 이상과 같은 다른 원인이 CHD 2,3의 병인에 관여함을 의미합니다. 심장 발달은 다양하고 상호 작용하는 세포 유형의 복잡한 과정으로, 인과적 비암호화 돌연변이와 유전자 조절에 미치는 영향을 식별하기가 어렵습니다. 심장의 기관 형성은 심근, 섬유아세포, 심외막 및 심내막 세포를 포함한 심장 세포의 다양한 아형을 생성하는 세포 전구체에서 시작됩니다 4,5. 단세포 유전체학(single-cell genomics)은 심장 발달을 연구하고 세포 이질성이 건강과 질병에 미치는 영향을 평가하는 핵심 방법으로 부상하고 있다6. 다양한 파라미터를 동시에 측정하기 위한 다중 오믹스 분석법의 개발과 전산 파이프라인의 확장은 정상 및 병든 심장에서 세포 유형 및 아형의 발견을 용이하게 했다6. 이 기사는 다운스트림 snRNA-seq 및 snATAC-seq(snRNA-seq 및 snATAC-seq 결합)7,8,9와 호환되는 마우스 배아에서 얻은 냉동 심장 전구 세포에 대한 신뢰할 수 있는 단일 핵 분리 프로토콜에 대해 설명합니다.
ATAC-seq는 조절 개방 염색질 영역의 식별과 뉴클레오솜10,11의 위치를 허용하는 강력한 방법입니다. 이 정보는 전사 인자의 위치, 정체성 및 활동에 대한 결론을 도출하는 데 사용됩니다. 리모델러를 포함한 염색질 인자의 활성과 RNA 중합효소의 전사 활성은 염색질 구조 1,2의 정량적 변화를 측정하는 데 매우 민감하기 때문에 분석할 수 있습니다. 따라서 ATAC-seq는 특정 세포 유형에서 전사 조절을 제어하는 메커니즘을 밝히기 위한 강력하고 공정한 접근 방식을 제공합니다. ATAC-seq 프로토콜은 또한 단일 세포에서 염색질 접근성을 측정하기 위해 검증되었으며, 세포 집단10,12,13 내에서 염색질 구조의 가변성을 나타냅니다.
최근 몇 년 동안 단일세포 분야에서 괄목할 만한 발전이 있었지만, 가장 큰 어려움은 이러한 실험을 수행하는데 필요한 신선한 시료를 처리하는 것이다14. 이러한 어려움을 피하기 위해, 냉동 심장 조직 또는 세포15,16을 사용하여 snRNA-seq 및 snATAC-seq와 같은 분석을 수행하기 위해 다양한 테스트가 수행되었습니다.
단세포 유전체학 데이터를 분석하기 위해 여러 플랫폼이 사용되었다17. 단세포 유전자 발현 및 ATAC 프로파일링을 위해 널리 사용되는 플랫폼은 다중 미세유체 액적 캡슐화를 위한 플랫폼이다17. 이러한 플랫폼은 미세 유체 챔버를 사용하기 때문에 파편이나 응집체가 시스템을 막아 사용할 수 없는 데이터를 생성할 수 있습니다. 따라서 단일 세포 연구의 성공 여부는 개별 세포/핵의 정확한 분리에 달려 있습니다.
여기에 제시된 프로토콜은 선천성 심장 결함 18,19,20,21,22,23을 이해하기 위해 snRNA-seq 및 snATAC-seq를 사용하는 최근 연구와 유사한 접근 방식을 사용합니다. 이 절차는 갓 미세 해부된 심장 조직의 효소 해리에 이어 마우스 심장 전구 세포의 냉동 보존을 활용합니다. 해동 후, 생존 가능한 세포는 핵 분리를 위해 정제되고 처리된다. 이 연구에서, 이 프로토콜은 마우스 심장 전구 세포의 동일한 핵 제제로부터 snRNA-seq 및 snATAC-seq 데이터를 얻기 위해 성공적으로 사용되었다.
Protocol
Representative Results
Discussion
snRNA-seq 및 snATAC-seq 연구를 결합하여 발달 중인 심장의 세포 조성을 분석하면 선천성 심장 질환의 기원에 대한 더 깊은 이해를 얻을 수 있다26. 여러 연구실에서 snRNA-seq27에 대한 심장 조직 동결 보존의 효과를 연구했습니다. 인간 질병의 마우스 모델에서 신선한 미세 해부 조직을 사용하여 snRNA-seq 및 snATAC-seq를 수행하는 것은 서로 다른 실험 조건을 비교할 때 논?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 연구는 ERA-CVD-2019 및 ANR-JCJC-2020에서 SS로 지원되었습니다. 귀중한 의견을 제공해 주신 U 1251/Marseille Medical Genetics 연구실의 Genomics and Bioinformatics facility(GBiM)와 익명의 검토자에게 감사드립니다.
Materials
| 2100 Bioanalyzer Instrument | Agilent | No catalog number | |
| 5M Sodium chloride (NaCl) | Sigma | 59222C-500ML | |
| BSA 10% | Sigma | A1595-50ML | |
| Chromium Next GEM Chip J Single Cell Kit, 16 rxns | 10X Genomics | 1000230 | |
| Chromium Next GEM Single Cell Multiome ATAC + Gene Expression Reagent Bundle, 4 rxns (including Nuclei Buffer 20X) | 10X Genomics | 1000285 | |
| Countess cell counting chamber slides | Invitrogen | C10283 | |
| Countess III FL | Thermofisher | No catalog number | |
| Digitonin (5%) | Thermofisher | BN2006 | |
| DMSO | Sigma | D2650-5x5ML | |
| DNA LoBind Tubes | Eppendorf | 22431021 | |
| D-PBS | Thermofisher | 14190094 | Sterile and RNase-free |
| Dual Index Kit TT Set A 96 rxns | 10X Genomics | 1000215 | |
| Falcon 15 mL Conical Centrifuge Tubes | Fisher Scientific | 352096 | |
| Falcon 50 mL Conical Centrifuge Tubes | Fisher Scientific | 10788561 | |
| HI-FBS | Thermofisher | A3840001 | Heat inactivated |
| High sensitivity DNA kit | Agilent | 5067-4626 | |
| Igepal CA-630 | Sigma | I8896-50ML | |
| LIVE/DEAD Viability/Cytotoxicity Kit | Thermofisher | L3224 | |
| MACS Dead Cell Removal kit: Dead Cell Romoval MicroBeads, Binding Buffer 20X | Miltenyi Biotec | 130-090-101 | |
| MACS SmartStrainers (30 µm) | Miltenyi Biotec | 130-098-458 | |
| Magnesium chloride (MgCl2) | Sigma | M1028-100ML | |
| Milieu McCoy 5A | Thermofisher | 16600082 | |
| MS Columns | Miltenyi Biotec | 130-042-201 | |
| NovaSeq 6000 S2 | Illumina | No catalog number | |
| Penicillin Streptomycin (Pen/Strep) | Thermofisher | 15070063 | |
| PluriStrainer Mini 40µm | PluriSelect | V-PM15-2021-12 | |
| Rock inhibitor | Enzo Life Sciences | ALX-270-333-M005 | |
| Single Index Kit N Set A, 96 rxn | 10X Genomics | 1000212 | |
| Standard 90mm Petri dish Sterilin | Thermofisher | 101R20 | |
| Sterile double-distilled water | Thermofisher | R0582 | |
| Trizma Hydrochloride solution (HCl) | Sigma | T2194-100ML | |
| Trypan Blue stain (0.4%) | Invitrogen | T10282 | |
| Trypsin 0.05% – EDTA 1X | Thermofisher | 25300054 | |
| Tween20 | Sigma | P9416-50ML | |
| Wide orifice filtered pipette tips 200 μl | Labcon | 1152-965-008-9 | |
| ZEISS SteREO Discovery.V8 | ZEISS | No catalog number |
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