Agrobacterium tumefaciens-gemedieerde genetische manipulatie van groene microalgen, Chlorella vulgaris
Summary
Dit protocol schetst het gebruik van Agrobacterium tumefaciens-gemedieerde transformatie (AMT) voor het integreren van gen(en) van belang in het nucleaire genoom van de groene microalg Chlorella vulgaris, wat leidt tot de productie van stabiele transformatoren.
Abstract
Agrobacterium tumefaciens-gemedieerde transformatie (AMT) dient als een veelgebruikt hulpmiddel voor het manipuleren van plantengenomen. A. tumefaciens vertoont echter het vermogen tot genoverdracht naar een breed scala aan soorten. Talloze soorten microalgen missen gevestigde methoden om genen die van belang zijn betrouwbaar te integreren in hun nucleaire genoom. Om de potentiële voordelen van microalgenbiotechnologie te benutten, zijn eenvoudige en efficiënte hulpmiddelen voor genoommanipulatie cruciaal. Hierin wordt een geoptimaliseerd AMT-protocol gepresenteerd voor de industriële microalgensoort Chlorella vulgaris, waarbij gebruik wordt gemaakt van het reporter groen fluorescerend eiwit (mGFP5) en de antibioticaresistentiemarker voor Hygromycine B. Mutanten worden geselecteerd door middel van plating op Tris-Acetaat-Fosfaat (TAP) media die Hygromycine B en cefotaxime bevatten. De expressie van mGFP5 wordt gekwantificeerd via fluorescentie na meer dan tien generaties subculturing, wat wijst op de stabiele transformatie van de T-DNA-cassette. Dit protocol maakt het mogelijk om in minder dan twee weken op betrouwbare wijze meerdere transgene C. vulgaris-kolonies te genereren, waarbij gebruik wordt gemaakt van de in de handel verkrijgbare pCAMBIA1302 plantenexpressievector.
Introduction
Agrobacterium tumefaciens, een gramnegatieve bodembacterie, bezit een uniek vermogen tot genoverdracht tussen koninkrijken, waardoor het de titel “natuurlijke genetische ingenieur” heeft gekregen1. Deze bacterie kan DNA (T-DNA) overbrengen van een tumor-inducerend plasmide (Ti-Plasmide) naar gastheercellen via een Type IV-secretiesysteem, wat resulteert in de integratie en expressie van het T-DNA in het gastheergenoom 1,2,3,4. In de natuurlijke omgeving leidt dit proces tot tumorvorming in planten, algemeen bekend als kroongalziekte. Agrobacterium kan echter ook T-DNA overbrengen naar verschillende andere organismen, waaronder gist, schimmels, algen, zee-egelembryo’s en zelfs menselijke cellen onder laboratoriumomstandigheden 5,6,7,8.
Door gebruik te maken van dit natuurlijke systeem, maakt Agrobacterium tumefaciens-gemedieerde transformatie (AMT) de willekeurige integratie van gen(en) van belang in het nucleaire genoom van een gastheercel mogelijk door het T-DNA-gebied van het Ti-plasmide te wijzigen. Voor dit doel is een veelgebruikte AMT-plantenexpressievector pCAMBIA13029. Onderzoekers kunnen eenvoudige kloonworkflows gebruiken in E. coli voordat ze de gewenste vector overbrengen naar A. tumefaciens voor latere overdracht naar de gastheer van belang.
Groene microalgen zijn eukaryoten die veel overeenkomsten vertonen met landplanten, maar zeer recalcitrant zijn voor genetische modificatie. Genetische transformatie speelt echter een cruciale rol in zowel fundamenteel als biotechnologisch onderzoek naar microalgen. In verschillende microalgensoorten, met name Chlamydomonas reinhardtii, heeft genetische transformatie via AMT met succes transgenen geïntroduceerd zoals humaan interleukine-2 (hIL-2), het ernstige acute respiratoire syndroom coronavirus 2-receptorbindende domein (SARS-CoV-2 RBD) en twee antimicrobiële peptiden (AMP’s)10,11,12,13. Chlorella vulgaris, een minder kieskeurige en snelgroeiende groene algensoort, heeft een aanzienlijk potentieel voor de duurzame productie van koolhydraten, eiwitten, nutraceuticals, pigmenten en andere hoogwaardigeverbindingen14. Het gebrek aan betrouwbare instrumenten voor het creëren van transgene stammen van C. vulgaris belemmert echter de commerciële vooruitgang ervan. Aangezien er slechts een beperkt aantal gepubliceerde werken zijn gepubliceerd waarin AMT in C. vulgaris15 wordt gebruikt, en gezien de aanzienlijke verschillen tussen de kweek van planten en microalgen, wordt het optimaliseren van het AMT-protocol essentieel.
In deze studie plaatsten onderzoekers groen fluorescerend eiwit (mGFP5) stroomafwaarts van de Cauliflower Mosaic Virus (CamV) 35S-promotor en voegden een histidine-tag toe om het te gebruiken als een reporter-gen voor eiwitexpressie. Transformanten werden geselecteerd met behulp van hygromycine B en na meer dan twintig generaties subculturatie bleef de transformatie stabiel. Het pCAMBIA1302-plasmide dat in dit werk wordt gebruikt, kan gemakkelijk worden aangepast om elk interessant gen te bevatten. Bovendien kunnen de gepresenteerde methode en materialen worden aangepast voor andere groene algensoorten met een actieve CamV35S-promotor, aangezien deze promotor wordt gebruikt voor hygromycineselectie.
Protocol
Representative Results
Discussion
De efficiëntie van transformatie wordt geassocieerd met verschillende parameters. De keuze van A. tumefaciens-stammen die voor AMT worden gebruikt, is cruciaal. AGL-1 is een van de meest invasieve stammen die is ontdekt en wordt om deze reden routinematig gebruikt in AMT van planten. Het aanvullen van de inductiemedia met glucose (15-20 mM) is ook belangrijk voor de AMT-efficiëntie. Aangezien C. vulgaris kan groeien in zowel fototrofe als heterotrofe omstandigheden, worden glucose of andere koolstofbr…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
De auteurs willen Prof. Paul Hooykaas bedanken voor het beschikbaar stellen van de pCAMBIA1302 vector en Agrobacterium tumefaciens AGL1 van het Instituut Biologie Leiden, Universiteit Leiden, Nederland. De auteurs willen ook Eva Colic bedanken voor haar hulp bij het kweken van de fluorescerende transformatoren. Dit werk werd gefinancierd door de Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada en het Mitacs Accelerate-programma.
Materials
| 1 Kb Plus DNA ladder | FroggaBio | DM015 | |
| Acetosyringone | Fisher Scientific | D26665G | |
| Agrobacterium tumefaciens | Gold Biotechnologies | Strain: AGL-1; Gift from Prof. Paul Hooykaas | Genotype: C58 RecA (RifR/CarbR) pTiBo542DT-DNA |
| Biotin | Enzo Life Sciences | 89151-400 | |
| CaCl2·2H2O | VWR | BDH9224-1KG | |
| Cefotaxime | AK Scientific | J90010 | |
| Chlorella vulgaris | University of Texas at Austin Culture Collection of Algae | Strain: UTEX 395 | Wildtype strain |
| CoCl2·6H2O | Sigma Aldrich | C8661-25G | |
| CuSO4·5H2O | EMD Millipore | CX2185-1 | |
| FeCl3·6H2O | VWR | BDH9234-500G | |
| Gene Pulser Xcell Electroporator | Bio-Rad | 1652662 | Main unit equipped with PC module. |
| GeneJET Plant Genome Purification Kit | Thermo Scientific | K0791 | |
| Glacial acetic acid | VWR | CABDH3093-2.2P | |
| Glycerol | BioBasic | GB0232 | |
| HEPES Buffer | Sigma Aldrich | H-3375 | |
| Hygromycin B | Fisher Scientific | AAJ6068103 | |
| K2HPO4 | VWR | BDH9266-500G | |
| Kanamycin | Gold Biotechnologies | K-250-25 | |
| KH2PO4 | VWR | BDH9268-500G | |
| MgSO4·7H2O | VWR | 97062-134 | |
| MnCl2·4H2O | JT Baker | BAKR2540-01 | |
| Na2CO3 | VWR | BDH7971-1 | |
| Na2EDTA·2H2O | JT Baker | 8993-01 | |
| Na2MoO4·2H2O | JT Baker | BAKR3764-01 | |
| NaCl | VWR | BDH7257-7 | |
| NaH2PO4 H2O | Millipore Sigma | CA80058-650 | |
| NaNO3 | VWR | BDH4574-500G | |
| NEBExpress Ni Resin | NewEngland BioLabs | NEB #S1427 | |
| NH4Cl | VWR | BDH9208-500G | |
| pCAMBIA1302 | Leiden University | Gift from Prof. Paul Hooykaas | pBR322, KanR, pVS1, T-DNA(CaMV 35S/HygR/CaMV polyA, CaMV 35S promoter/mgpf5-6xhis/NOS terminator) |
| Polypropylene Columns (5 mL) | QIAGEN | 34964 | |
| Precision Plus Protein Unstained Protein Standards, Strep-tagged recombinant, 1 mL | Bio-Rad | 1610363 | |
| Rifampicin | Millipore Sigma | R3501-1G | |
| SunBlaster LED Strip Light 48 Inch | SunBlaster | 210000000906 | |
| Synergy 4 Microplate UV/Vis spectrometer | BioTEK | S4MLFPTA | |
| Tetracycline | Thermo Scientific Chemicals | CAAAJ61714-14 | |
| TGX Stain-Free FastCast Acrylamide Kit, 12% | Bio-Rad | 1610185 | |
| Thiamine | TCI America | T0181-100G | |
| Tris Base | Fisher Scientific | BP152-500 | |
| Tryptone | BioBasic | TG217(G211) | |
| Vitamin B12 (cyanocobalamin) | Enzo Life Sciences | 89151-436 | |
| Yeast Extract | BioBasic | G0961 | |
| ZnSO4·7H2O | JT Baker | 4382-01 |
References
- Smith, E. F., Townsend, C. O. A plant tumor of bacterial origin. Science. 25 (643), 671-673 (1907).
- Chilton, M. D., et al. Stable incorporation of plasmid DNA into higher plant cells: The molecular basis of tumorigenesis. Cell. 11 (2), 263-271 (1977).
- De Cleene, M., De Ley, J. The host range of crown gall. The Botanical Review. 42, 389-466 (1976).
- Hooykaas, P. J., Schilperoort, R. A. Agrobacterium and plant genetic engineering. Plant Molecular Biology. 19, 15-38 (1992).
- Bundock, P., den Dulk-Ras, A., Beijersbergen, A., Hooykaas, P. J. J. Transkingdom T-DNA transfer from Agrobacterium tumefaciens to Saccharomyces cerevisiae. The European Molecular Biology Organization. 14 (13), 3206-3214 (1995).
- Piers, K. L., Heath, J. D., Liang, X., Stephens, K. M., Nester, E. W. Agrobacteriumtumefaciens-mediated transformation of yeast. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 93 (4), 1613-1618 (1996).
- Kumar, S. V., Misquitta, R. W., Reddy, V. S., Rao, B. J., Rajam, M. V. Genetic transformation of the green alga-Chlamydomonas reinhardtii by Agrobacteriumtumefaciens. Plant Science. 166 (3), 731-738 (2004).
- de Groot, M. J., Bundock, P., Hooykaas, P. J., Beijersbergen, A. G. Agrobacteriumtumefaciens-mediated transformation of filamentous fungi. Nature Biotechnology. 16 (9), 839-842 (1998).
- Hajdukiewicz, P., Svab, Z., Maliga, P. The small, versatile pPZP family of Agrobacterium binary vectors for plant transformation. Plant Molecular Biology. 25 (6), 989-994 (1994).
- Dehghani, J., Adibkia, K., Movafeghi, A., Pourseif, M. M., Omidi, Y. Designing a new generation of expression toolkits for engineering of green microalgae; robust production of human interleukin-2. BioImpacts. 10 (4), 259-268 (2020).
- Berndt, A. J., Smalley, T. N., Ren, B., Simkovsky, R., Badary, A., Sproles, A. E., Fields, F. J., Torres-Tiji, Y., Heredia, V., Mayfield, S. P. Recombinant production of a functional SARS-CoV-2 spike receptor binding domain in the green algae Chlamydomonas reinhardtii. PLoS One. 16, 0257089 (2021).
- Li, A., Huang, R., Wang, C., Hu, Q., Li, H., Li, X. Expression of anti-lipopolysaccharide factor isoform 3 in Chlamydomonas reinhardtii showing high antimicrobial activity. Marine Drugs. 19 (5), 239 (2021).
- Xue, B., Dong, C. M., Hu, H. H., Dong, B., Fan, Z. C. Chlamydomonas reinhardtii-expressed multimer of ToAMP4 inhibits the growth of bacteria of both Gram-positive and Gram-negative. Process Biochemistry. 91, 311-318 (2020).
- Khan, M. I., Shin, J. H., Kim, J. D. The promising future of microalgae: current status, challenges, and optimization of a sustainable and renewable industry for biofuels, feed, and other products. Microbial Cell Factories. 17, 36 (2018).
- Cha, T. S., Yee, W., Aziz, A. Assessment of factors affecting Agrobacterium-mediated genetic transformation of the unicellular green alga, Chlorella vulgaris. World Journal of Microbiology and Biotechnology. 28, 1771-1779 (2012).
- Lee, P. Y., Costumbrado, J., Hsu, C. Y., Kim, Y. H. Agarose gel electrophoresis for the separation of DNA fragments. Journal of Visualized Experiments. (62), e3923 (2012).
- Bio-Rad Laboratories Inc. A Guide to Polyacrylamide Gel Electrophoresis and Detection. Bulletin 6040, Rev C. Bio-Rad Laboratories Inc. Accessed. , (2023).
- NEBExpress Ni Resin Gravity Flow Typical Protocol. New England Biolabs Inc Available from: https://international.neb.com/protocols/2019/09/10/nebexpress-ni-resin-gravity-flow-typical-protocol (2023)
- Ward, V. C. A., Rehmann, L. Fast media optimization for mixotrophic cultivation of Chlorella vulgaris. Scientific Reports. 9, 19262 (2019).
- Morton, E. R., Fuqua, C. Laboratory maintenance of Agrobacterium. Current Protocols in Microbiology. , (2012).
- Haddadi, F., Abd Aziz, M., Abdullah, S. N., Tan, S. G., Kamaladini, H. An efficient Agrobacterium-mediated transformation of strawberry cv. Camarosa by a dual plasmid system. Molecules. 20 (3), 3647-3666 (2015).
- Wang, X., Ryu, D., Houtkooper, R. H., Auwerx, J. Antibiotic use and abuse: a threat to mitochondria and chloroplasts with impact on research, health, and environment. Bioessays. 37 (10), 1045-1053 (2015).
- Gelvin, S. B. Plant DNA repair and Agrobacterium T-DNA integration. International Journal of Molecular Sciences. 22 (16), 8458 (2021).
