Yeşil Mikroalglerin Agrobacterium tumefaciens Aracılı Genetik Mühendisliği ( Chlorella vulgaris)
Summary
Bu protokol, ilgilenilen gen(ler)i yeşil mikroalgler Chlorella vulgaris’in nükleer genomuna entegre etmek için Agrobacterium tumefaciens aracılı dönüşümün (AMT) kullanımını ana hatlarıyla belirtir ve kararlı dönüştürücülerin üretimine yol açar.
Abstract
Agrobacterium tumefaciens aracılı transformasyon (AMT), bitki genomlarını manipüle etmek için yaygın olarak kullanılan bir araç olarak hizmet eder. Bununla birlikte, A. tumefaciens , çeşitli türlere gen aktarımı için kapasite sergiler. Çok sayıda mikroalg türü, ilgilenilen genleri nükleer genomlarına güvenilir bir şekilde entegre etmek için köklü yöntemlerden yoksundur. Mikroalg biyoteknolojisinin potansiyel faydalarından yararlanmak için basit ve verimli genom manipülasyon araçları çok önemlidir. Burada, endüstriyel mikroalg türleri Chlorella vulgaris için, raportör yeşil floresan proteini (mGFP5) ve Higromisin B için antibiyotik direnç belirteci kullanılarak optimize edilmiş bir AMT protokolü sunulmuştur. mGFP5’in ekspresyonu, on nesilden fazla alt kültürlemeden sonra floresan yoluyla ölçülür ve bu da T-DNA kasetinin kararlı dönüşümünü gösterir. Bu protokol, ticari olarak temin edilebilen pCAMBIA1302 bitki ekspresyon vektörünü kullanarak, iki haftadan kısa bir sürede çoklu transgenik C. vulgaris kolonilerinin güvenilir bir şekilde oluşturulmasına izin verir.
Introduction
Gram negatif toprak kaynaklı bir bakteri olan Agrobacterium tumefaciens, benzersiz bir krallıklar arası gen aktarım yeteneğine sahiptir ve ona “doğal genetik mühendisi” unvanını kazandırır1. Bu bakteri, DNA’YI (T-DNA) tümöre neden olan bir plazmitten (Ti-Plazmit) bir Tip IV salgılama sistemi yoluyla konakçı hücrelere aktarabilir, bu da T-DNA’nın konakçı genomu 1,2,3,4 içinde entegrasyonu ve ekspresyonu ile sonuçlanır. Doğal ortamda, bu süreç bitkilerde tümör oluşumuna yol açar, genellikle taç safra hastalığı olarak bilinir. Bununla birlikte, Agrobacterium, T-DNA’yı laboratuvar koşullarında maya, mantarlar, algler, deniz kestanesi embriyoları ve hatta insan hücreleri dahil olmak üzere çeşitli diğer organizmalara da aktarabilir 5,6,7,8.
Bu doğal sistemden yararlanan Agrobacterium tumefaciens aracılı transformasyon (AMT), Ti-plazmidin T-DNA bölgesini değiştirerek ilgilenilen gen(ler)in bir konakçı hücrenin nükleer genomuna rastgele entegrasyonunu sağlar. Bu amaçla, yaygın olarak kullanılan bir AMT bitki ekspresyon vektörü pCAMBIA13029’dur. Araştırmacılar, istenen vektörü daha sonra ilgilenilen konakçıya aktarmak için A. tumefaciens’e aktarmadan önce E. coli’de basit klonlama iş akışlarını kullanabilirler.
Yeşil mikroalgler, kara bitkileriyle birçok benzerliği paylaşan, ancak genetik modifikasyona karşı oldukça inatçı olan ökaryotlardır. Bununla birlikte, genetik dönüşüm, mikroalglerin hem temel hem de biyoteknolojik araştırmalarında çok önemli bir rol oynamaktadır. Çeşitli mikroalg türlerinde, özellikle Chlamydomonas reinhardtii, AMT yoluyla genetik dönüşüm, insan interlökin-2 (hIL-2), şiddetli akut solunum sendromu koronavirüs 2 reseptör bağlama alanı (SARS-CoV-2 RBD) ve iki antimikrobiyal peptit (AMP) gibi transgenleri başarıyla tanıttı10,11,12,13. Bunlar arasında, daha az titiz ve hızlı büyüyen bir yeşil alg türü olan Chlorella vulgaris, karbonhidratların, proteinlerin, nutrasötiklerin, pigmentlerin ve diğer yüksek değerli bileşiklerin sürdürülebilir üretimi için önemli bir potansiyele sahiptir14. Bununla birlikte, C. vulgaris’in transgenik suşlarını oluşturmak için güvenilir araçların bulunmaması, ticari ilerlemesini engellemektedir. C. vulgaris15’te AMT’yi kullanan sınırlı sayıda yayınlanmış çalışma olduğundan ve bitki ve mikroalg yetiştiriciliği arasındaki önemli farklılıklar göz önüne alındığında, AMT protokolünü optimize etmek gerekli hale gelir.
Bu çalışmada araştırmacılar, Karnabahar Mozaik Virüsü (CamV) 35S promotörün akış aşağısına yeşil floresan proteini (mGFP5) yerleştirdiler ve protein ekspresyonu için bir raportör gen olarak kullanmak için bir histidin etiketi eklediler. Dönüştürücüler, Higromisin B kullanılarak seçildi ve yirmiden fazla nesil boyunca alt kültürlemeden sonra, dönüşüm sabit kaldı. Bu çalışmada kullanılan pCAMBIA1302 plazmidi, ilgilenilen herhangi bir geni içerecek şekilde kolayca uyarlanabilir. Ayrıca, sunulan yöntem ve malzemeler, aktif bir CamV35S promotörü olan diğer yeşil alg türleri için ayarlanabilir, çünkü bu promotör Higromisin seçimi için kullanılır.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dönüşümün verimliliği birkaç farklı parametre ile ilişkilidir. AMT için kullanılan A. tumefaciens suşlarının seçimi çok önemlidir. AGL-1, keşfedilen en invaziv suşlardan biridir ve bu nedenle AMT bitkisinde rutin olarak kullanılmıştır. İndüksiyon ortamının glikoz (15-20 mM) ile desteklenmesi de AMT verimliliği için önemlidir. C. vulgaris’in hem fototrofik hem de heterotrofik koşullarda büyüyebileceği göz önüne alındığında, kontaminasyonu önlemek için glikoz vey…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Yazarlar, Hollanda Leiden Üniversitesi Leiden Biyoloji Enstitüsü’nden pCAMBIA1302 vektörünü ve Agrobacterium tumefaciens AGL1’i sağladığı için Prof. Paul Hooykaas’a teşekkür eder. Yazarlar ayrıca floresan dönüştürücülerin yetiştirilmesindeki yardımları için Eva Colic’e teşekkür etmek istiyor. Bu çalışma, Kanada Doğa Bilimleri ve Mühendislik Araştırma Konseyi ve Mitacs Accelerate programı tarafından finanse edildi.
Materials
| 1 Kb Plus DNA ladder | FroggaBio | DM015 | |
| Acetosyringone | Fisher Scientific | D26665G | |
| Agrobacterium tumefaciens | Gold Biotechnologies | Strain: AGL-1; Gift from Prof. Paul Hooykaas | Genotype: C58 RecA (RifR/CarbR) pTiBo542DT-DNA |
| Biotin | Enzo Life Sciences | 89151-400 | |
| CaCl2·2H2O | VWR | BDH9224-1KG | |
| Cefotaxime | AK Scientific | J90010 | |
| Chlorella vulgaris | University of Texas at Austin Culture Collection of Algae | Strain: UTEX 395 | Wildtype strain |
| CoCl2·6H2O | Sigma Aldrich | C8661-25G | |
| CuSO4·5H2O | EMD Millipore | CX2185-1 | |
| FeCl3·6H2O | VWR | BDH9234-500G | |
| Gene Pulser Xcell Electroporator | Bio-Rad | 1652662 | Main unit equipped with PC module. |
| GeneJET Plant Genome Purification Kit | Thermo Scientific | K0791 | |
| Glacial acetic acid | VWR | CABDH3093-2.2P | |
| Glycerol | BioBasic | GB0232 | |
| HEPES Buffer | Sigma Aldrich | H-3375 | |
| Hygromycin B | Fisher Scientific | AAJ6068103 | |
| K2HPO4 | VWR | BDH9266-500G | |
| Kanamycin | Gold Biotechnologies | K-250-25 | |
| KH2PO4 | VWR | BDH9268-500G | |
| MgSO4·7H2O | VWR | 97062-134 | |
| MnCl2·4H2O | JT Baker | BAKR2540-01 | |
| Na2CO3 | VWR | BDH7971-1 | |
| Na2EDTA·2H2O | JT Baker | 8993-01 | |
| Na2MoO4·2H2O | JT Baker | BAKR3764-01 | |
| NaCl | VWR | BDH7257-7 | |
| NaH2PO4 H2O | Millipore Sigma | CA80058-650 | |
| NaNO3 | VWR | BDH4574-500G | |
| NEBExpress Ni Resin | NewEngland BioLabs | NEB #S1427 | |
| NH4Cl | VWR | BDH9208-500G | |
| pCAMBIA1302 | Leiden University | Gift from Prof. Paul Hooykaas | pBR322, KanR, pVS1, T-DNA(CaMV 35S/HygR/CaMV polyA, CaMV 35S promoter/mgpf5-6xhis/NOS terminator) |
| Polypropylene Columns (5 mL) | QIAGEN | 34964 | |
| Precision Plus Protein Unstained Protein Standards, Strep-tagged recombinant, 1 mL | Bio-Rad | 1610363 | |
| Rifampicin | Millipore Sigma | R3501-1G | |
| SunBlaster LED Strip Light 48 Inch | SunBlaster | 210000000906 | |
| Synergy 4 Microplate UV/Vis spectrometer | BioTEK | S4MLFPTA | |
| Tetracycline | Thermo Scientific Chemicals | CAAAJ61714-14 | |
| TGX Stain-Free FastCast Acrylamide Kit, 12% | Bio-Rad | 1610185 | |
| Thiamine | TCI America | T0181-100G | |
| Tris Base | Fisher Scientific | BP152-500 | |
| Tryptone | BioBasic | TG217(G211) | |
| Vitamin B12 (cyanocobalamin) | Enzo Life Sciences | 89151-436 | |
| Yeast Extract | BioBasic | G0961 | |
| ZnSO4·7H2O | JT Baker | 4382-01 |
References
- Smith, E. F., Townsend, C. O. A plant tumor of bacterial origin. Science. 25 (643), 671-673 (1907).
- Chilton, M. D., et al. Stable incorporation of plasmid DNA into higher plant cells: The molecular basis of tumorigenesis. Cell. 11 (2), 263-271 (1977).
- De Cleene, M., De Ley, J. The host range of crown gall. The Botanical Review. 42, 389-466 (1976).
- Hooykaas, P. J., Schilperoort, R. A. Agrobacterium and plant genetic engineering. Plant Molecular Biology. 19, 15-38 (1992).
- Bundock, P., den Dulk-Ras, A., Beijersbergen, A., Hooykaas, P. J. J. Transkingdom T-DNA transfer from Agrobacterium tumefaciens to Saccharomyces cerevisiae. The European Molecular Biology Organization. 14 (13), 3206-3214 (1995).
- Piers, K. L., Heath, J. D., Liang, X., Stephens, K. M., Nester, E. W. Agrobacteriumtumefaciens-mediated transformation of yeast. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 93 (4), 1613-1618 (1996).
- Kumar, S. V., Misquitta, R. W., Reddy, V. S., Rao, B. J., Rajam, M. V. Genetic transformation of the green alga-Chlamydomonas reinhardtii by Agrobacteriumtumefaciens. Plant Science. 166 (3), 731-738 (2004).
- de Groot, M. J., Bundock, P., Hooykaas, P. J., Beijersbergen, A. G. Agrobacteriumtumefaciens-mediated transformation of filamentous fungi. Nature Biotechnology. 16 (9), 839-842 (1998).
- Hajdukiewicz, P., Svab, Z., Maliga, P. The small, versatile pPZP family of Agrobacterium binary vectors for plant transformation. Plant Molecular Biology. 25 (6), 989-994 (1994).
- Dehghani, J., Adibkia, K., Movafeghi, A., Pourseif, M. M., Omidi, Y. Designing a new generation of expression toolkits for engineering of green microalgae; robust production of human interleukin-2. BioImpacts. 10 (4), 259-268 (2020).
- Berndt, A. J., Smalley, T. N., Ren, B., Simkovsky, R., Badary, A., Sproles, A. E., Fields, F. J., Torres-Tiji, Y., Heredia, V., Mayfield, S. P. Recombinant production of a functional SARS-CoV-2 spike receptor binding domain in the green algae Chlamydomonas reinhardtii. PLoS One. 16, 0257089 (2021).
- Li, A., Huang, R., Wang, C., Hu, Q., Li, H., Li, X. Expression of anti-lipopolysaccharide factor isoform 3 in Chlamydomonas reinhardtii showing high antimicrobial activity. Marine Drugs. 19 (5), 239 (2021).
- Xue, B., Dong, C. M., Hu, H. H., Dong, B., Fan, Z. C. Chlamydomonas reinhardtii-expressed multimer of ToAMP4 inhibits the growth of bacteria of both Gram-positive and Gram-negative. Process Biochemistry. 91, 311-318 (2020).
- Khan, M. I., Shin, J. H., Kim, J. D. The promising future of microalgae: current status, challenges, and optimization of a sustainable and renewable industry for biofuels, feed, and other products. Microbial Cell Factories. 17, 36 (2018).
- Cha, T. S., Yee, W., Aziz, A. Assessment of factors affecting Agrobacterium-mediated genetic transformation of the unicellular green alga, Chlorella vulgaris. World Journal of Microbiology and Biotechnology. 28, 1771-1779 (2012).
- Lee, P. Y., Costumbrado, J., Hsu, C. Y., Kim, Y. H. Agarose gel electrophoresis for the separation of DNA fragments. Journal of Visualized Experiments. (62), e3923 (2012).
- Bio-Rad Laboratories Inc. A Guide to Polyacrylamide Gel Electrophoresis and Detection. Bulletin 6040, Rev C. Bio-Rad Laboratories Inc. Accessed. , (2023).
- NEBExpress Ni Resin Gravity Flow Typical Protocol. New England Biolabs Inc Available from: https://international.neb.com/protocols/2019/09/10/nebexpress-ni-resin-gravity-flow-typical-protocol (2023)
- Ward, V. C. A., Rehmann, L. Fast media optimization for mixotrophic cultivation of Chlorella vulgaris. Scientific Reports. 9, 19262 (2019).
- Morton, E. R., Fuqua, C. Laboratory maintenance of Agrobacterium. Current Protocols in Microbiology. , (2012).
- Haddadi, F., Abd Aziz, M., Abdullah, S. N., Tan, S. G., Kamaladini, H. An efficient Agrobacterium-mediated transformation of strawberry cv. Camarosa by a dual plasmid system. Molecules. 20 (3), 3647-3666 (2015).
- Wang, X., Ryu, D., Houtkooper, R. H., Auwerx, J. Antibiotic use and abuse: a threat to mitochondria and chloroplasts with impact on research, health, and environment. Bioessays. 37 (10), 1045-1053 (2015).
- Gelvin, S. B. Plant DNA repair and Agrobacterium T-DNA integration. International Journal of Molecular Sciences. 22 (16), 8458 (2021).
