Engenharia Genética Mediada por Agrobacterium tumefaciens de Microalgas Verdes, Chlorella vulgaris
Summary
Este protocolo descreve a utilização da transformação mediada por Agrobacterium tumefaciens (AMT) para integrar gene(s) de interesse no genoma nuclear da microalga verde Chlorella vulgaris, levando à produção de transformantes estáveis.
Abstract
A transformação mediada por Agrobacterium tumefaciens (AMT) serve como uma ferramenta amplamente empregada para manipular genomas de plantas. No entanto, A. tumefaciens exibe a capacidade de transferência gênica para diversas espécies. Numerosas espécies de microalgas carecem de métodos bem estabelecidos para integrar de forma confiável genes de interesse em seu genoma nuclear. Para aproveitar os benefícios potenciais da biotecnologia de microalgas, ferramentas simples e eficientes de manipulação do genoma são cruciais. Neste trabalho, um protocolo AMT otimizado é apresentado para a espécie de microalgas industriais Chlorella vulgaris, utilizando a proteína fluorescente verde repórter (mGFP5) e o marcador de resistência a antibióticos para Hygromycin B. Os mutantes são selecionados através de plaqueamento em meio Tris-Acetato-Fosfato (TAP) contendo Higromicina B e cefotaxima. A expressão de mGFP5 é quantificada via fluorescência após mais de dez gerações de subcultivo, indicando a transformação estável do de T-DNA. Este protocolo permite a geração confiável de múltiplas colônias transgênicas de C. vulgaris em menos de duas semanas, empregando o vetor de expressão vegetal pCAMBIA1302 comercialmente disponível.
Introduction
Agrobacterium tumefaciens, uma bactéria gram-negativa transmitida pelo solo, possui uma capacidade única de transferência de genes entre reinos, o que lhe rendeu o título de “engenheiro genético natural”1. Essa bactéria pode transferir DNA (T-DNA) de um plasmídeo indutor de tumor (Ti-Plasmid) para as células hospedeiras através de um sistema de secreção Tipo IV, resultando na integração e expressão do DNA-T no genoma do hospedeiro1,2,3,4. No ambiente natural, esse processo leva à formação de tumores em plantas, comumente conhecida como doença da galha da coroa. No entanto, a Agrobacterium também pode transferir o DNA-T para vários outros organismos, incluindo leveduras, fungos, algas, embriões de ouriço-do-mar e até mesmo células humanas em condições de laboratório 5,6,7,8.
Explorando este sistema natural, a transformação mediada por Agrobacterium tumefaciens (AMT) permite a integração aleatória de gene(s) de interesse no genoma nuclear de uma célula hospedeira, modificando a região T-DNA do plasmídeo Ti. Para isso, um vetor de expressão de plantas AMT amplamente utilizado é o pCAMBIA13029. Os pesquisadores podem empregar fluxos de trabalho de clonagem simples em E. coli antes de transferir o vetor desejado para A. tumefaciens para posterior transferência para o hospedeiro de interesse.
As microalgas verdes são eucariotos que compartilham muitas semelhanças com as plantas terrestres, mas são altamente recalcitrantes à modificação genética. No entanto, a transformação genética desempenha um papel crucial na pesquisa fundamental e biotecnológica de microalgas. Em várias espécies de microalgas, particularmente Chlamydomonas reinhardtii, a transformação genética via AMT introduziu com sucesso transgenes como a interleucina-2 humana (hIL-2), o domínio de ligação ao receptor 2 da síndrome respiratória aguda grave coronavirus 2 (SARS-CoV-2 RBD) e dois peptídeos antimicrobianos (AMPs)10,11,12,13. Dentre estas, Chlorella vulgaris, uma espécie de alga verde menos fastidiosa e de crescimento rápido, possui significativo potencial para a produção sustentável de carboidratos, proteínas, nutracêuticos, pigmentos e outros compostos de alto valor14. No entanto, a falta de ferramentas confiáveis para a criação de cepas transgênicas de C. vulgaris dificulta seu progresso comercial. Uma vez que há apenas um número limitado de trabalhos publicados utilizando AMT em C. vulgaris15, e dadas as diferenças consideráveis entre o cultivo de plantas e microalgas, a otimização do protocolo AMT torna-se essencial.
Neste estudo, os pesquisadores inseriram a proteína fluorescente verde (mGFP5) a jusante do promotor 35S do Cauliflower Mosaic Virus (CamV) e adicionaram uma etiqueta de histidina para usá-la como um gene repórter para a expressão da proteína. Os transformantes foram selecionados usando higromicina B e, após subcultivo por mais de vinte gerações, a transformação permaneceu estável. O plasmídeo pCAMBIA1302 empregado neste trabalho pode ser facilmente adaptado para conter qualquer gene de interesse. Além disso, o método e os materiais apresentados podem ser ajustados para outras espécies de algas verdes com um promotor CamV35S ativo, uma vez que este promotor é usado para a seleção de higromicina.
Protocol
Representative Results
Discussion
A eficiência da transformação está associada a vários parâmetros diferentes. A escolha das cepas de A. tumefaciens utilizadas para TMA é crucial. A AGL-1 é uma das cepas mais invasivas descobertas e, por esse motivo, tem sido rotineiramente utilizada em plantas AMT. A suplementação do meio de indução com glicose (15-20 mM) também é importante para a eficiência da AMT. Considerando que C. vulgaris pode crescer em condições fototróficas e heterotróficas, glicose ou outras fontes de carb…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Os autores gostariam de agradecer ao Prof. Paul Hooykaas por gentilmente fornecer o vetor pCAMBIA1302 e Agrobacterium tumefaciens AGL1 do Instituto de Biologia de Leiden, Universidade de Leiden, Holanda. Os autores também gostariam de agradecer a Eva Colic por sua ajuda no crescimento dos transformantes fluorescentes. Este trabalho foi financiado pelo Conselho de Pesquisa em Ciências Naturais e Engenharia do Canadá e pelo programa Mitacs Acelerar.
Materials
| 1 Kb Plus DNA ladder | FroggaBio | DM015 | |
| Acetosyringone | Fisher Scientific | D26665G | |
| Agrobacterium tumefaciens | Gold Biotechnologies | Strain: AGL-1; Gift from Prof. Paul Hooykaas | Genotype: C58 RecA (RifR/CarbR) pTiBo542DT-DNA |
| Biotin | Enzo Life Sciences | 89151-400 | |
| CaCl2·2H2O | VWR | BDH9224-1KG | |
| Cefotaxime | AK Scientific | J90010 | |
| Chlorella vulgaris | University of Texas at Austin Culture Collection of Algae | Strain: UTEX 395 | Wildtype strain |
| CoCl2·6H2O | Sigma Aldrich | C8661-25G | |
| CuSO4·5H2O | EMD Millipore | CX2185-1 | |
| FeCl3·6H2O | VWR | BDH9234-500G | |
| Gene Pulser Xcell Electroporator | Bio-Rad | 1652662 | Main unit equipped with PC module. |
| GeneJET Plant Genome Purification Kit | Thermo Scientific | K0791 | |
| Glacial acetic acid | VWR | CABDH3093-2.2P | |
| Glycerol | BioBasic | GB0232 | |
| HEPES Buffer | Sigma Aldrich | H-3375 | |
| Hygromycin B | Fisher Scientific | AAJ6068103 | |
| K2HPO4 | VWR | BDH9266-500G | |
| Kanamycin | Gold Biotechnologies | K-250-25 | |
| KH2PO4 | VWR | BDH9268-500G | |
| MgSO4·7H2O | VWR | 97062-134 | |
| MnCl2·4H2O | JT Baker | BAKR2540-01 | |
| Na2CO3 | VWR | BDH7971-1 | |
| Na2EDTA·2H2O | JT Baker | 8993-01 | |
| Na2MoO4·2H2O | JT Baker | BAKR3764-01 | |
| NaCl | VWR | BDH7257-7 | |
| NaH2PO4 H2O | Millipore Sigma | CA80058-650 | |
| NaNO3 | VWR | BDH4574-500G | |
| NEBExpress Ni Resin | NewEngland BioLabs | NEB #S1427 | |
| NH4Cl | VWR | BDH9208-500G | |
| pCAMBIA1302 | Leiden University | Gift from Prof. Paul Hooykaas | pBR322, KanR, pVS1, T-DNA(CaMV 35S/HygR/CaMV polyA, CaMV 35S promoter/mgpf5-6xhis/NOS terminator) |
| Polypropylene Columns (5 mL) | QIAGEN | 34964 | |
| Precision Plus Protein Unstained Protein Standards, Strep-tagged recombinant, 1 mL | Bio-Rad | 1610363 | |
| Rifampicin | Millipore Sigma | R3501-1G | |
| SunBlaster LED Strip Light 48 Inch | SunBlaster | 210000000906 | |
| Synergy 4 Microplate UV/Vis spectrometer | BioTEK | S4MLFPTA | |
| Tetracycline | Thermo Scientific Chemicals | CAAAJ61714-14 | |
| TGX Stain-Free FastCast Acrylamide Kit, 12% | Bio-Rad | 1610185 | |
| Thiamine | TCI America | T0181-100G | |
| Tris Base | Fisher Scientific | BP152-500 | |
| Tryptone | BioBasic | TG217(G211) | |
| Vitamin B12 (cyanocobalamin) | Enzo Life Sciences | 89151-436 | |
| Yeast Extract | BioBasic | G0961 | |
| ZnSO4·7H2O | JT Baker | 4382-01 |
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