Agrobacterium tumefaciens-Medited Genetic Engineering of Green Microalgae, Chlorella vulgaris (녹색 미세 조류, 클로렐라 심가리스의 Agrobacterium tumefaciens-Mediated Genetic Engineering of Green Microalgae, Chlorella vulgaris)
Summary
이 프로토콜은 녹색 미세조류 클로렐라 심가리스(Chlorella vulgaris)의 핵 게놈에 관심 유전자를 통합하기 위한 Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation(AMT)의 활용을 간략하게 설명하여 안정적인 형질전환체를 생산합니다.
Abstract
Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation(AMT)은 식물 게놈을 조작하는 데 널리 사용되는 도구 역할을 합니다. 그러나 A. tumefaciens 는 다양한 종으로 유전자를 전달하는 능력을 나타냅니다. 수많은 미세조류 종은 관심 유전자를 핵 게놈에 안정적으로 통합하기 위한 잘 확립된 방법이 부족합니다. 미세조류 생명공학의 잠재적 이점을 활용하려면 간단하고 효율적인 게놈 조작 도구가 중요합니다. 본 명세서에서는 리포터 그린 형광 단백질(mGFP5) 및 히그로마이신 B에 대한 항생제 내성 마커를 이용하는 산업용 미세조류 종인 클로렐라 불가리스(Chlorella vulgaris)에 대해 최적화된 AMT 프로토콜이 제시된다. 돌연변이체는 하이그로마이신 B 및 세포탁심(cefotaxime)을 함유하는 트리스-아세테이트-포스페이트(TAP) 배지 상의 도금을 통해 선택된다. mGFP5의 발현은 10세대 이상의 과배양 후 형광을 통해 정량화되며, 이는 T-DNA 카세트의 안정적인 형질전환을 나타냅니다. 이 프로토콜은 상업적으로 이용 가능한 pCAMBIA1302 식물 발현 벡터를 사용하여 2주 이내에 여러 형질전환 C. vulgaris 콜로니를 안정적으로 생성할 수 있습니다.
Introduction
그람 음성 토양 매개 박테리아인 Agrobacterium tumefaciens는 독특한 왕국 간 유전자 전달 능력을 가지고 있어 “자연 유전 공학자”라는 칭호를 얻었습니다.1 이 박테리아는 종양 유도 플라스미드(Ti-Plasmid)에서 Type IV 분비 시스템을 통해 숙주 세포로 DNA(T-DNA)를 전달하여 숙주 게놈 1,2,3,4 내에서 T-DNA의 통합 및 발현을 유도할 수 있습니다. 자연 환경에서 이 과정은 일반적으로 크라운 담즙 질환으로 알려진 식물의 종양 형성으로 이어집니다. 그러나 아그로박테리움은 T-DNA를 효모, 균류, 조류, 성게 배아, 심지어 실험실 조건 하에서 인간 세포를 포함한 다양한 다른 유기체로 옮길 수도 있다 5,6,7,8.
이러한 자연 시스템을 이용하여, 아그로박테리움 투메파시엔스 매개 형질전환(AMT)은 Ti-플라스미드의 T-DNA 영역을 변형시킴으로써 관심 유전자를 숙주 세포의 핵 게놈에 무작위로 통합할 수 있습니다. 이를 위해 널리 사용되는 AMT 식물 발현 벡터는 pCAMBIA13029입니다. 연구자들은 원하는 벡터를 A. tumefaciens로 전송하기 전에 E. coli에서 간단한 클로닝 워크플로우를 사용하여 관심 호스트로 후속 전송할 수 있습니다.
녹조류는 육상 식물과 많은 유사점을 공유하지만 유전자 변형에 매우 난해한 진핵생물입니다. 그러나 유전자 형질전환은 미세조류의 기초 및 생명공학 연구에서 중요한 역할을 합니다. 여러 미세조류 종, 특히 클라미도모나스 라인하르트티(Chlamydomonas reinhardtii)에서 AMT를 통한 유전자 변형은 인간 인터루킨-2(hIL-2), 중증 급성 호흡기 증후군 코로나바이러스 2 수용체 결합 도메인(SARS-CoV-2 RBD) 및 두 가지 항균 펩타이드(AMP)10,11,12,13과 같은 전이유전자를 성공적으로 도입했습니다. 이 중 덜 까다롭고 빠르게 성장하는 녹조류 종인 클로렐라 불가리스(Chlorella vulgaris)는 탄수화물, 단백질, 기능 식품, 안료 및 기타 고부가가치 화합물의 지속 가능한 생산에 상당한 잠재력을 가지고 있습니다14. 그러나 C. vulgaris의 형질전환 균주를 만들기 위한 신뢰할 수 있는 도구의 부족은 상업적 발전을 방해합니다. C. vulgaris15에서 AMT를 활용한 발표된 연구의 수가 제한되어 있고 식물과 미세조류 재배 간의 상당한 차이를 감안할 때 AMT 프로토콜을 최적화하는 것이 필수적입니다.
이 연구에서 연구원들은 콜리플라워 모자이크 바이러스(CamV) 35S 프로모터의 다운스트림에 녹색 형광 단백질(mGFP5)을 삽입하고 히스티딘 태그를 추가하여 단백질 발현을 위한 리포터 유전자로 사용했습니다. 형질전환체는 Hygromycin B를 사용하여 선택하였고, 20세대 이상 과배양 후에, 형질전환은 안정적으로 유지되었다. 이 연구에 사용된 pCAMBIA1302 플라스미드는 관심 유전자를 포함하도록 쉽게 적응할 수 있습니다. 또한, 제시된 방법 및 물질은 활성 CamV35S 프로모터를 갖는 다른 녹조류 종에 대해 조정할 수 있는데, 이 프로모터는 Hygromycin 선택에 사용되기 때문입니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
변환의 효율성은 여러 가지 매개 변수와 관련이 있습니다. AMT에 사용되는 A. tumefaciens 균주의 선택은 매우 중요합니다. AGL-1은 발견된 가장 침습적인 균주 중 하나이며, 이러한 이유로 식물 AMT에서 일상적으로 사용되어 왔습니다. 유도 매체에 포도당(15-20mM)을 보충하는 것도 AMT 효율에 중요합니다. C. vulgaris 는 광영양 및 종속영양 조건 모두에서 자랄 수 있다는 점을 고려할 때, 포도당 ?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
저자들은 네덜란드 라이덴 대학교 라이덴 생물학 연구소(Institute of Biology Leiden, Leiden)에서 pCAMBIA1302 벡터와 Agrobacterium tumefaciens AGL1을 제공해준 Paul Hooykaas 교수에게 감사의 뜻을 전합니다. 저자들은 또한 형광 변환체를 성장시키는 데 도움을 준 Eva Colic에게 감사의 뜻을 전합니다. 이 연구는 캐나다 자연 과학 및 공학 연구 위원회(Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada)와 Mitacs Accelerate 프로그램의 지원을 받았습니다.
Materials
| 1 Kb Plus DNA ladder | FroggaBio | DM015 | |
| Acetosyringone | Fisher Scientific | D26665G | |
| Agrobacterium tumefaciens | Gold Biotechnologies | Strain: AGL-1; Gift from Prof. Paul Hooykaas | Genotype: C58 RecA (RifR/CarbR) pTiBo542DT-DNA |
| Biotin | Enzo Life Sciences | 89151-400 | |
| CaCl2·2H2O | VWR | BDH9224-1KG | |
| Cefotaxime | AK Scientific | J90010 | |
| Chlorella vulgaris | University of Texas at Austin Culture Collection of Algae | Strain: UTEX 395 | Wildtype strain |
| CoCl2·6H2O | Sigma Aldrich | C8661-25G | |
| CuSO4·5H2O | EMD Millipore | CX2185-1 | |
| FeCl3·6H2O | VWR | BDH9234-500G | |
| Gene Pulser Xcell Electroporator | Bio-Rad | 1652662 | Main unit equipped with PC module. |
| GeneJET Plant Genome Purification Kit | Thermo Scientific | K0791 | |
| Glacial acetic acid | VWR | CABDH3093-2.2P | |
| Glycerol | BioBasic | GB0232 | |
| HEPES Buffer | Sigma Aldrich | H-3375 | |
| Hygromycin B | Fisher Scientific | AAJ6068103 | |
| K2HPO4 | VWR | BDH9266-500G | |
| Kanamycin | Gold Biotechnologies | K-250-25 | |
| KH2PO4 | VWR | BDH9268-500G | |
| MgSO4·7H2O | VWR | 97062-134 | |
| MnCl2·4H2O | JT Baker | BAKR2540-01 | |
| Na2CO3 | VWR | BDH7971-1 | |
| Na2EDTA·2H2O | JT Baker | 8993-01 | |
| Na2MoO4·2H2O | JT Baker | BAKR3764-01 | |
| NaCl | VWR | BDH7257-7 | |
| NaH2PO4 H2O | Millipore Sigma | CA80058-650 | |
| NaNO3 | VWR | BDH4574-500G | |
| NEBExpress Ni Resin | NewEngland BioLabs | NEB #S1427 | |
| NH4Cl | VWR | BDH9208-500G | |
| pCAMBIA1302 | Leiden University | Gift from Prof. Paul Hooykaas | pBR322, KanR, pVS1, T-DNA(CaMV 35S/HygR/CaMV polyA, CaMV 35S promoter/mgpf5-6xhis/NOS terminator) |
| Polypropylene Columns (5 mL) | QIAGEN | 34964 | |
| Precision Plus Protein Unstained Protein Standards, Strep-tagged recombinant, 1 mL | Bio-Rad | 1610363 | |
| Rifampicin | Millipore Sigma | R3501-1G | |
| SunBlaster LED Strip Light 48 Inch | SunBlaster | 210000000906 | |
| Synergy 4 Microplate UV/Vis spectrometer | BioTEK | S4MLFPTA | |
| Tetracycline | Thermo Scientific Chemicals | CAAAJ61714-14 | |
| TGX Stain-Free FastCast Acrylamide Kit, 12% | Bio-Rad | 1610185 | |
| Thiamine | TCI America | T0181-100G | |
| Tris Base | Fisher Scientific | BP152-500 | |
| Tryptone | BioBasic | TG217(G211) | |
| Vitamin B12 (cyanocobalamin) | Enzo Life Sciences | 89151-436 | |
| Yeast Extract | BioBasic | G0961 | |
| ZnSO4·7H2O | JT Baker | 4382-01 |
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