Polymerasekædereaktion og dot-blot-hybridisering til detektion af leptospira i vandprøver

Summary

I denne undersøgelse blev en dot-blot-applikation designet til at detektere Leptospira fra de tre hovedklader i vandprøver. Denne metode gør det muligt at identificere minimale DNA-mængder, der specifikt er målrettet mod en digoxigenin-mærket sonde, der let detekteres af et anti-digoxigenin-antistof. Denne tilgang er et værdifuldt og tilfredsstillende redskab til screeningsformål.

Abstract

Dot-blot er en enkel, hurtig, følsom og alsidig teknik, der muliggør identifikation af minimale mængder DNA, der specifikt er målrettet mod sondehybridisering i nærvær af bærer-DNA. Det er baseret på overførsel af en kendt mængde DNA til en inert fast støtte, såsom en nylonmembran, ved hjælp af dot-blot-apparatet og uden elektroforetisk adskillelse. Nylonmembraner har fordelen ved høj nukleinsyrebindingskapacitet (400 μg /^cm2), høj styrke og er positivt eller neutralt ladede. Den anvendte sonde er et meget specifikt ssDNA-fragment på 18 til 20 baser langt mærket med digoxigenin (DIG). Sonden vil konjugere med Leptospira DNA. Når sonden er hybridiseret med mål-DNA’et, detekteres den af et anti-digoxigenin-antistof, hvilket gør det let at detektere det gennem dets emissioner afsløret i en røntgenfilm. Prikkerne med en emission svarer til DNA-fragmenterne af interesse. Denne metode anvender den ikke-isotopiske mærkning af sonden, som kan have en meget lang halveringstid. Ulempen ved denne standard immunetiket er en lavere følsomhed end isotopprober. Ikke desto mindre afbødes det ved kobling af polymerasekædereaktion (PCR) og dot-blot-assays. Denne fremgangsmåde muliggør berigelse af målsekvensen og dens detektion. Derudover kan det bruges som en kvantitativ anvendelse sammenlignet med en seriel fortynding af en velkendt standard. En dot-blot-applikation til påvisning af Leptospira fra de tre hovedklader i vandprøver præsenteres her. Denne metode kan anvendes på store mængder vand, når de er blevet koncentreret ved centrifugering for at give bevis for tilstedeværelsen af leptospiral-DNA. Dette er et værdifuldt og tilfredsstillende værktøj til generelle screeningsformål og kan bruges til andre ikke-dyrkelige bakterier, der kan være til stede i vand, hvilket forbedrer forståelsen af økosystemet.

Introduction

Leptospirose hos mennesker stammer hovedsageligt fra miljømæssige kilder ^1,2. Tilstedeværelsen af Leptospira i søer, floder og vandløb er en indikator for leptospiroseoverførsel blandt dyreliv og husdyr og produktionsdyr, der i sidste ende kan komme i kontakt med disse vandområder ^1,3,4. Desuden er Leptospira blevet identificeret i ikke-naturlige kilder, herunder spildevand, stillestående vand og postevand ^5,6.

Leptospira er en verdensomspændende distribueret bakterie ^7,8, og miljøets rolle i dets bevarelse og transmission er blevet anerkendt. Leptospira kan overleve i drikkevand under variabel pH og mineraler⁹ og i naturlige vandområder¹. Det kan også overleve i lange perioder i destilleret vand¹⁰, og under konstant pH (7,8) kan det overleve op til 152 dage¹¹. Desuden kan Leptospira interagere i bakteriekonsortier for at overleve barske forhold^12,13. Det kan indgå i biofilm i ferskvand med Azospirillum og Sphingomonas og er endda i stand til at vokse og udholde temperaturer på over 49 °C^14,15. Det kan også formere sig i vandtæt jord og forblive levedygtigt i op til 379 dage¹⁶ og bevare dets evne til at forårsage sygdommen i så længe som et år^17,18. Imidlertid er der lidt kendt om økologien inden for vandlegemer og hvordan den fordeles i dem.

Siden opdagelsen var undersøgelsen af slægten Leptospira baseret på serologiske tests. Det var først i det nuværende århundrede, at molekylære teknikker blev mere udbredt i undersøgelsen af denne spirochaete. Dot-blottet er næsten ikke blevet anvendt til identifikation ved hjælp af (1) en isotopsonde baseret på 16S rRNA og på en inter-simple sekvensgentagelse (ISSR)^19,20, (2) som et nanoguldbaseret immunoassay for human leptospirose anvendt på urin²¹ eller (3) som et antistofbaseret assay til kvægurinprøver²². Teknikken faldt i brug, fordi den oprindeligt var baseret på isotopsonder. Det er imidlertid en velkendt teknik, der kombineret med PCR giver forbedrede resultater, og det betragtes som sikkert på grund af brugen af ikke-isotopiske sonder. PCR spiller en afgørende rolle i berigelsen af Leptospira-DNA’et ved at amplificere et specifikt DNA-fragment, der kan findes i spormængder i en prøve. Under hver PCR-cyklus fordobles mængden af det målrettede DNA-fragment i reaktionen. I slutningen af reaktionen er amplikonen blevet ganget med en faktor på mere end en million²³. Produktet forstærket af PCR, ofte ikke synligt i agaroseelektroforese, bliver synligt gennem specifik hybridisering med en DIG-mærket sonde i dot-blot 24,25,26.

Dot-blot-teknikken er enkel, robust og velegnet til adskillige prøver, hvilket gør den tilgængelig for laboratorier med begrænsede ressourcer. Det har været anvendt i en række bakterieundersøgelser, herunder (1) orale bakterier²⁷, (2) andre prøvetyper såsom mad og afføring²⁸ og (3) identifikation af udyrkelige bakterier²⁹, ofte i overensstemmelse med andre molekylære teknikker. Blandt fordelene ved dot-blot-teknikken er: (1) Membranen har en høj bindingskapacitet, der er i stand til at binde over 200 μg/^cm2 nukleinsyrer og op til 400 μg/^cm2; (2) Dot-blot-resultater kan fortolkes visuelt uden behov for særligt udstyr, og (3) de kan nemt opbevares i årevis ved stuetemperatur (RT).

Slægten Leptospira er blevet klassificeret i patogene, mellemliggende og saprofytiske klader^30,31. Sondringen mellem disse klader kan opnås baseret på specifikke gener såsom lipL41, lipL32 og 16S rRNA. LipL32 er til stede i de patogene klader og udviser høj følsomhed i forskellige serologiske og molekylære værktøjer, mens det er fraværende i saprofytarter²¹. Husholdningsgenet lipL41 er kendt for sit stabile udtryk og anvendes i molekylære teknikker³², mens 16S rRNA-genet bruges til deres klassificering.

Denne metode kan anvendes på store mængder vand, når de er blevet koncentreret ved centrifugering. Det gør det muligt at vurdere forskellige punkter og dybder i et vandlegeme for at detektere tilstedeværelsen af leptospiral-DNA og den klade, som den tilhører. Dette værktøj er værdifuldt til både økologiske og generelle screeningsformål og kan også anvendes til at detektere andre ikke-dyrkelige bakterier, der kan være til stede i vand.

Derudover er PCR- og dot-blot-assays teknisk og økonomisk overkommelige for en lang række laboratorier, selv dem, der mangler sofistikeret eller dyrt udstyr. Denne undersøgelse har til formål at anvende den digoxigeninbaserede dot-blot til identifikation af de tre Leptospira-klader i vandprøver indsamlet fra naturlige vandområder.

Bakteriestammer
Tolv Leptospira serovarer (Autumnalis, Bataviae, Bratislava, Canicola, Celledoni, Grippothyphosa, Hardjoprajitno, Icterohaemorrhagiae, Pomona, Pyrogenes, Tarassovi og Wolffi) blev inkluderet i denne undersøgelse. Disse serovarer er en del af samlingen på Institut for Mikrobiologi og Immunologi, Det Veterinærmedicinske Fakultet og Zooteknik, National Autonomous University of Mexico, og de bruges i øjeblikket i mikroagglutinationstesten (MAT).

Alle Leptospira serovarer blev dyrket i EMJH, og deres DNA blev ekstraheret ved hjælp af et kommercielt DNA-ekstraktionssæt (se materialetabel). En genomisk DNA-blanding af de tolv serovarer blev anvendt som en positiv kontrol for den Leptospira-patogene klade. Som en positiv kontrol af Leptospira-mellemkladen blev genomisk DNA fra Leptospira fainei serovar Hurstbridge-stammen BUT6 inkluderet, og som en positiv kontrol for Leptospira-saprofytkladen blev genomisk DNA fra Leptospira biflexa serovar Patoc-stammen Patoc I også inkluderet.

Negative kontroller bestod af et tomt plasmid, DNA fra ikke-relaterede bakterier (Ureaplasma urealyticum, Staphylococcus aureus, Brucella abortus, Salmonella typhimurium, Shigella boydii, Klebsiella pneumoniae, Acinetobacter baumannii og Escherichia coli) og vand af PCR-kvalitet, der fungerede som ikke-skabelonkontrol.

Vandprøver
Tolv prøvetagningsprøver blev indsamlet ved hjælp af en stratificeret-tilfældig prøveudtagningsmetode fra Cuemanco Biological and Aquaculture Research Center (CIBAC) (19° 16′ 54″ N 99° 6′ 11″ W). Disse prøver blev opnået på tre dybder: overfladisk, 10 og 30 cm (figur 1A, B). Vandopsamlingsprocedurerne påvirkede ikke nogen truede eller beskyttede arter. Hver prøve blev opsamlet i et sterilt 15 ml mikrocentrifugeglas. For at indsamle prøven blev hvert rør forsigtigt nedsænket i vandet, fyldt på den valgte dybde og derefter forseglet. Prøverne blev opbevaret ved 22 °C og straks transporteret til laboratoriet til forarbejdning.

Hver prøve blev koncentreret ved centrifugering i sterile 1,5 ml mikrocentrifugeglas ved 8000 x g i 20 minutter ved stuetemperatur. Dette trin blev gentaget, indtil alle prøverne var koncentreret i et rør, som derefter blev brugt til DNA-ekstraktion (figur 1C).

Figur 1: Koncentration af vandprøver ved centrifugering. (A) Vandprøvetagningsdamme, og (B) Naturlige vandløb. C) Centrifugeringsbaseret behandling af vandprøver i gentagne trin så mange gange som nødvendigt (n). Klik her for at se en større version af denne figur.

DNA-ekstraktion
Total DNA blev isoleret ved hjælp af et kommercielt genomisk DNA-sæt i henhold til producentens instruktioner (se materialetabel). DNA-ekstraktioner blev elueret i 20 μL elueringsbuffer, og DNA-koncentrationen blev bestemt af et UV-spektrofotometer ved 260-280 nm og opbevaret ved 4 °C indtil brug.

PCR-forstærkning
PCR-målene var generne 16S rRNA, lipL41 og lipL32, som identificerer DNA fra slægten Leptospira og tillader sondring mellem de tre klader: patogen, saprofytisk og mellemliggende. Både primere og sondedesign var baseret på de tidligere værker af Ahmed et al., Azali et al., Bourhy et al., Weiss et al. og Branger et al.33,34,35,36,37. Sekvensen af hver sonde, primer og forstærket fragment er beskrevet i tabel 1, og deres tilpasning til referencesekvenser er angivet i supplerende fil 1, supplerende fil 2, supplerende fil 3, supplerende fil 4 og supplerende fil 5. PCR-reagenserne og termocykelbetingelserne er beskrevet i protokolafsnittet.

Amplifikationsprodukter blev visualiseret ved elektroforetisk separation på en 1% agarosegel i TAE (40 mM Tris-base, 20 mM eddikesyre og 1 mM EDTA; pH 8,3) ved 60 V i 45 minutter med ethidiumbromiddetektion, som vist i supplerende figur 1. Genomisk DNA opnået fra hver serovar blev anvendt med koncentrationer fra 6 x 10⁶ til 1 x 10⁴ genomiske ækvivalente kopier (GEq) i hver PCR-reaktion baseret på genomstørrelsen af L. interrogans (4, 691, 184 bp)³⁸ for patogen Leptospira, genomstørrelsen af L. biflexa (3, 956, 088 bp)³⁹ for saprofytisk Leptospira, og genomstørrelsen af L. fainei serovar Hurstbridge stamme BUT6 (4.267, 324 bp) med tiltrædelsesnummer AKWZ00000000.2.

Sondernes følsomhed blev vurderet med DNA fra hver patogen serovar, L. biflexa serovar Patoc stamme Patoc I og L. fainei serovar Hurstbridge stamme BUT6 i hvert forsøg. For at vurdere specificiteten af PCR- og dot-blot-hybridiseringsanalysen blev DNA fra ikke-relaterede bakterier inkluderet.

Tabel 1: PCR-primere og sonder til forstærkning af produkter til identifikation af patogene, saprofytiske og mellemliggende klader af Leptospira. Klik her for at downloade denne tabel.

Dot-blot hybridiseringsassay
Teknikken kaldes dot-blot, fordi hullerne, hvori DNA-prøven er placeret, har en prikform, og når de suges til at blive fastgjort på plads ved vakuumsugning, får de denne form. Denne teknik blev udviklet af Kafatos et ^al.40. Teknikken muliggør semikvantificering af Leptospira i hver PCR-positiv prøve. Protokollen består af en denaturering med NaOH 0,4 M ved stuetemperatur, prøver med Leptospira DNA fra 30 ng til 0,05 ng, svarende til 6 x 10⁶ til 1 x 10⁴ leptospirer, blottes på en nylonmembran med et 96-brønds dot-blot-apparat. Efter immobilisering bindes DNA’et til membranen ved udsættelse for 120 mJ UV-lys. Hver DNA-sonde konjugeres med digoxigenin-11 dUTP ved et terminalt transferasekatalysetrin i 3′-enden (Digoxigenin er et plantesteroid opnået fra Digitalis purpurea, der anvendes som reporter⁴¹). Efter den strenge hybridisering af den mærkede DNA-sonde (50 pmol) ved den specifikke temperatur på mål-DNA’et visualiseres DNA-hybriderne ved kemiluminescensreaktionen med anti-digoxigenin alkalisk fosfataseantistof kovalent konjugeret med dets substrat CSPD. Luminescensen fanges ved udsættelse for en røntgenfilm (figur 2).

Figur 2: Trin i proceduren for PCR-dot-blot-assayet. Klik her for at se en større version af denne figur.

Protocol

1. Forberedelse af prøver Hver vandprøve koncentreres i 1,5 ml mikrocentrifugeglas ved centrifugering ved 8.000 x g i 10 minutter ved 4 °C. Dette trin gentages så mange gange som nødvendigt for at koncentrere prøven i et volumen på 250 μl. Brug DNA-ekstraktionssættet i henhold til producentens anvisninger (se materialetabel). Udfør den specifikke PCR i henhold til den dot-blot-sonde, der skal bruges (tabel 1).Der …

Representative Results

For at vurdere effektiviteten af teknikken blev genomisk DNA fra rene kulturer af hver Leptospira serovar anvendt sammen med den kladespecifikke sonde. Membraner blev fremstillet med 100 ng genomisk DNA pr. PCR-reaktion for hver serovar, efterfulgt af otte genomisk DNA fra ikke-beslægtede bakterier og variable koncentrationer af genomisk DNA fra ad hoc Leptospira serovarer. Hver analyse omfattede positiv, negativ og ikke-skabelonkontrol. Disse ikke-relaterede genomiske DNA viste ikke en affinitet for d…

Discussion

De kritiske trin i dot-blot-teknikken inkluderer (1) DNA-immobilisering, (2) blokering af de frie bindingssteder på membranen med ikke-homologt DNA, (3) komplementariteten mellem sonden og målfragmentet under udglødningsbetingelser, (4) fjernelse af den uhybridiserede sonde og (5) påvisning af reportermolekylet⁴¹.

PCR-Dot-blot har visse begrænsninger, såsom teknikken giver ikke information om størrelsen af det hybridiserede fragment³⁷, det…

Materials

REAGENTS
Purelink DNA extraction kit	Invitrogen	K182002
Gotaq Flexi DNA Polimerase (End-Point PCR Taq polymerase kit)	Promega	M3001
Whatman filter paper, grade 1,	Merk	WHA1001325
Nylon Membranes, positively charged Roll 30cm x 3 m	Roche	11417240001
Anti-Digoxigenin-AP, Fab fragments Sheep Polyclonal Primary-antibody	Roche	11093274910
Medium Base EMJH	Difco	S1368JAA
Leptospira Enrichment EMJH	Difco	BD 279510
Blocking Reagent	Roche	11096176001
CSPD ready to use Disodium 3-(4-methoxyspiro {1,2-dioxetane-3,2′-(5′-chloro) tricyclo [3.3.1.13,7] decan}8-4-yl) phenyl phosphate	Merk	11755633001
Deoxyribonucleic acid from herring sperm	Sigma Aldrich	D3159
Developer Carestream	Carestream Health Inc	GBX5158621
Digoxigenin-11-ddUTP	Roche	11363905910
EDTA, Disodium Salt (Dihydrate)	Promega	H5032
Ficoll 400	Sigma Aldrich	F8016
Fixer Carestream	Carestream Health Inc	GBX 5158605
Lauryl sulfate Sodium Salt (Sodium dodecyl sulfate; SDS) C12H2504SNa	Sigma Aldrich	L5750
N- Lauroylsarcosine sodium salt CH3(CH2)10CON(CH3) CH2COONa	Sigma Aldrich	L-9150	It is an anionic surfactant
Polivinylpyrrolidone (PVP-40)	Sigma Aldrich	PVP40
Polyethylene glycol Sorbitan monolaurate (Tween 20)	Sigma Aldrich	9005-64-5
Sodium Chloride (NaCl)	Sigma Aldrich	7647-14-5
Sodium dodecyl sulfate (SDS)	Sigma Aldrich	151-21-3
Sodium hydroxide (NaOH)	Sigma Aldrich	1310-73-2
Sodium phosphate dibasic (NaH2PO4)	Sigma-Aldrich	7558-79-4
Terminal transferase, recombinant	Roche	3289869103
Tris hydrochloride (Tris HCl)	Sigma-Aldrich	1185-53-1
SSPE 20X	Sigma-Aldrich	S2015-1L	It can be Home-made following Supplementary File 6
Primers	Sigma-Aldrich	On demand	Follow table 1
Probes	Sigma-Aldrich	On demand	Follow table 1
Equipment
Nanodrop™ One Spectrophotometer	Thermo-Scientific	ND-ONE-W
Refrigerated microcentrifuge Sigma 1-14K, suitable for centrifugation of 1.5 ml microcentrifuge tubes at 14,000 rpm	Sigma-Aldrich	1-14K
Disinfected adjustable pipettes, range 2-20 µl, 20-200 µl	Gilson	SKU:F167360
Disposable 1.5 ml microcentrifuge tubes (autoclaved)	Axygen	MCT-150-SP
Disposable 600 µl microcentrifuge tubes (autoclaved)	Axygen	3208
Disposable Pipette tips 1-10 µl	Axygen	T-300
Disposable Pipette tips 1-200 µl	Axygen	TR-222-Y
Dot-Blot apparatus Bio-Dot	BIORAD	1706545
Portable Hergom Suction	Hergom	7E-A
Scientific Light Box (Visible-light PH90-115V)	Hoefer	PH90-115V
UV Crosslinker	Hoefer	UVC-500
Thermo Hybaid PCR Express Thermocycler	Hybaid	HBPX110
Radiographic cassette with IP Plate14 X 17	Fuji