Réaction en chaîne par polymérase et hybridation par transfert de points pour la détection de leptospires dans des échantillons d’eau

Summary

Dans cette étude, une application dot-blot a été conçue pour détecter Leptospira dans les trois clades principaux dans des échantillons d’eau. Cette méthode permet d’identifier des quantités minimales d’ADN spécifiquement ciblées par une sonde marquée à la digoxigénine, facilement détectées par un anticorps anti-digoxigénine. Cette approche est un outil précieux et satisfaisant à des fins de dépistage.

Abstract

Le dot-blot est une technique simple, rapide, sensible et polyvalente qui permet d’identifier des quantités minimales d’ADN spécifiquement ciblées par hybridation par sonde en présence d’ADN porteur. Il est basé sur le transfert d’une quantité connue d’ADN sur un support solide inerte, tel qu’une membrane en nylon, à l’aide de l’appareil dot-blot et sans séparation électrophorétique. Les membranes en nylon ont l’avantage d’avoir une capacité de liaison élevée des acides nucléiques (400 μg/cm²), une résistance élevée et une charge positive ou neutre. La sonde utilisée est un fragment d’ADNsb très spécifique de 18 à 20 bases de long marqué à la digoxigénine (DIG). La sonde se conjuguera avec l’ADN de Leptospira . Une fois que la sonde s’est hybridée avec l’ADN cible, elle est détectée par un anticorps anti-digoxigénine, ce qui permet sa détection facile grâce à ses émissions révélées dans un film radiographique. Les points avec une émission correspondront aux fragments d’ADN d’intérêt. Cette méthode utilise le marquage non isotopique de la sonde, qui peut avoir une demi-vie très longue. L’inconvénient de cet immuno-marqueur standard est une sensibilité plus faible que celle des sondes isotopiques. Néanmoins, elle est atténuée par le couplage de la réaction en chaîne par polymérase (PCR) et des tests dot-blot. Cette approche permet l’enrichissement de la séquence cible et sa détection. De plus, il peut être utilisé comme une application quantitative par rapport à une dilution en série d’un étalon bien connu. Une application dot-blot pour détecter Leptospira dans les trois clades principaux dans des échantillons d’eau est présentée ici. Cette méthodologie peut être appliquée à de grandes quantités d’eau une fois qu’elles ont été concentrées par centrifugation pour fournir des preuves de la présence d’ADN leptospiralé. Il s’agit d’un outil précieux et satisfaisant à des fins de dépistage général, et il peut être utilisé pour d’autres bactéries non cultivables qui peuvent être présentes dans l’eau, améliorant ainsi la compréhension de l’écosystème.

Introduction

La leptospirose chez l’homme provient principalement de sources environnementales ^1,2. La présence de Leptospira dans les lacs, les rivières et les ruisseaux est un indicateur de la transmission de la leptospirose chez les animaux sauvages et les animaux domestiques et de production qui peuvent éventuellement entrer en contact avec ces plans d’eau ^1,3,4. De plus, Leptospira a été identifié dans des sources non naturelles, notamment dans les eaux usées, l’eau stagnante et l’eau du robinet ^5,6.

Leptospira est une bactérie distribuée dans le monde entier ^7,8, et le rôle de l’environnement dans sa préservation et sa transmission a été bien reconnu. Leptospira peut survivre dans l’eau potable sous un pH variable et des minéraux⁹, et dans des plans d’eau naturels¹. Il peut également survivre pendant de longues périodes dans l’eau distillée¹⁰, et sous un pH constant (7,8), il peut survivre jusqu’à 152 jours¹¹. De plus, Leptospira peut interagir dans des consortiums bactériens pour survivre à des conditions difficiles^12,13. Il peut faire partie de biofilms en eau douce avec Azospirillum et Sphingomonas et est même capable de croître et de supporter des températures supérieures à 49 °C^14,15. Il peut également se multiplier dans un sol gorgé d’eau et rester viable jusqu’à 379 jours¹⁶, préservant sa capacité à provoquer la maladie jusqu’à un an^17,18. Cependant, on sait peu de choses sur l’écologie des masses d’eau et sur la façon dont elle y est distribuée.

Depuis sa découverte, l’étude du genre Leptospira s’est basée sur des tests sérologiques. Ce n’est qu’au cours du siècle actuel que les techniques moléculaires sont devenues plus répandues dans l’étude de ce spirochète. Le dot-blot a été à peine utilisé pour son identification à l’aide (1) d’une sonde isotopique basée sur l’ARNr 16S et sur une répétition de séquence inter-simple (ISSR)^19,20, (2) en tant qu’immunodosage basé sur le nanogold pour la leptospirose humaine appliquée à l’urine²¹, ou (3) en tant que test basé sur des anticorps pour des échantillons d’urine bovine²². La technique est tombée en désuétude car elle était à l’origine basée sur des sondes isotopiques. Cependant, il s’agit d’une technique bien connue qui, associée à la PCR, donne de meilleurs résultats et est considérée comme sûre en raison de l’utilisation de sondes non isotopiques. La PCR joue un rôle crucial dans l’enrichissement de l’ADN de Leptospira en amplifiant un fragment d’ADN spécifique qui peut être trouvé à l’état de traces dans un échantillon. Au cours de chaque cycle de PCR, la quantité du fragment d’ADN ciblé est doublée dans la réaction. À la fin de la réaction, l’amplicon a été multiplié par un facteur de plus d’un million²³. Le produit amplifié par PCR, souvent non visible dans l’électrophorèse de l’agarose, devient visible par hybridation spécifique avec une sonde marquée DIG dans le dot-blot 24,25,26.

La technique dot-blot est simple, robuste et adaptée à de nombreux échantillons, ce qui la rend accessible aux laboratoires disposant de ressources limitées. Il a été utilisé dans une variété d’études sur les bactéries, y compris (1) les bactéries buccales²⁷, (2) d’autres types d’échantillons tels que les aliments et les matières fécales²⁸, et (3) l’identification de bactéries incultivables²⁹, souvent en accord avec d’autres techniques moléculaires. Parmi les avantages offerts par la technique dot-blot figurent : (1) La membrane a une capacité de liaison élevée, capable de lier plus de 200 μg/^cm2 d’acides nucléiques et jusqu’à 400 μg/^cm2 ; (2) Les résultats Dot-blot peuvent être interprétés visuellement sans nécessiter d’équipement spécial, et (3) ils peuvent être stockés pendant des années à température ambiante (RT).

Le genre Leptospira a été classé en clades pathogènes, intermédiaires et saprophytes^30,31. La distinction entre ces clades peut être obtenue sur la base de gènes spécifiques tels que lipL41, lipL32 et l’ARNr 16S. LipL32 est présent dans les clades pathogènes et présente une grande sensibilité dans divers outils sérologiques et moléculaires, alors qu’il est absent chez les espèces de saprophytes²¹. Le gène ménager lipL41 est connu pour son expression stable et utilisé dans les techniques moléculaires³², tandis que le gène de l’ARNr 16S est utilisé pour leur classification.

Cette méthodologie peut être appliquée à de grands volumes d’eau une fois qu’ils ont été concentrés par centrifugation. Il permet d’évaluer différents points et profondeurs au sein d’un plan d’eau afin de détecter la présence d’ADN leptospiralé et du clade auquel il appartient. Cet outil est précieux à des fins de dépistage écologique et général et peut également être utilisé pour détecter d’autres bactéries non cultivables qui peuvent être présentes dans l’eau.

De plus, les tests PCR et dot-blot sont techniquement et économiquement abordables pour un large éventail de laboratoires, même ceux qui ne disposent pas d’équipements sophistiqués ou coûteux. Cette étude vise à appliquer le dot-blot à base de digoxigénine pour l’identification des trois clades de Leptospira dans des échantillons d’eau prélevés dans des plans d’eau naturels.

Souches bactériennes
Douze sérovars de Leptospira (Autumnalis, Bataviae, Bratislava, Canicola, Celledoni, Grippothyphosa, Hardjoprajitno, Icterohaemorrhagiae, Pomona, Pyrogenes, Tarassovi et Wolffi) ont été inclus dans cette étude. Ces sérotypes font partie de la collection du Département de microbiologie et d’immunologie de la Faculté de médecine vétérinaire et de zootechnie de l’Université nationale autonome du Mexique, et ils sont actuellement utilisés dans le test de microagglutination (MAT).

Tous les sérotypes de Leptospira ont été cultivés dans l’EMJH, et leur ADN a été extrait à l’aide d’une trousse d’extraction d’ADN commerciale (voir le tableau des matériaux). Un mélange d’ADN génomique des douze sérovars a été utilisé comme contrôle positif pour le clade pathogène de Leptospira . En tant que contrôle positif du clade intermédiaire de Leptospira , l’ADN génomique de la souche BUT6 du sérotype Hurstbridge de Leptospira fainei a été inclus, et en tant que contrôle positif du clade des saprophytes de Leptospira , l’ADN génomique de la sérotype de Leptospira biflexa de la souche Patoc I a également été inclus.

Les témoins négatifs étaient constitués d’un plasmide vide, d’ADN provenant de bactéries non apparentées (Ureaplasma urealyticum, Staphylococcus aureus, Brucella abortus, Salmonella typhimurium, Shigella boydii, Klebsiella pneumoniae, Acinetobacter baumannii et Escherichia coli) et d’eau de qualité PCR, qui a servi de témoin non matriciel.

Échantillons d’eau
Douze échantillons choisis ont été prélevés à l’aide d’une méthode d’échantillonnage stratifié-aléatoire du Centre de recherche biologique et aquacole de Cuemanco (CIBAC) (19° 16′ 54 » N 99° 6′ 11 » O). Ces échantillons ont été obtenus à trois profondeurs : superficielle, 10 et 30 cm (figures 1A, B). Les procédures de collecte de l’eau n’ont eu aucun impact sur les espèces menacées ou protégées. Chaque échantillon a été prélevé dans un tube à microcentrifuger stérile de 15 ml. Pour recueillir l’échantillon, chaque tube a été doucement immergé dans l’eau, rempli à la profondeur sélectionnée, puis scellé. Les échantillons ont été maintenus à 22 °C et rapidement transportés au laboratoire pour être traités.

Chaque échantillon a été concentré par centrifugation dans des tubes de microcentrifugation stériles de 1,5 mL à 8000 x g pendant 20 min à température ambiante. Cette étape a été répétée jusqu’à ce que tous les échantillons soient concentrés dans un seul tube, qui a ensuite été utilisé pour l’extraction de l’ADN (figure 1C).

Figure 1 : Concentration des échantillons d’eau par centrifugation. (A) Bassins d’échantillonnage d’eau, et (B) Cours d’eau naturels. (C) Traitement d’échantillons d’eau par centrifugation en plusieurs étapes autant de fois que nécessaire (n). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Extraction de l’ADN
L’ADN total a été isolé à l’aide d’un kit d’ADN génomique commercial conformément aux instructions du fabricant (voir le tableau des matériaux). Les extractions d’ADN ont été éluées dans 20 μL de tampon d’élution, et la concentration d’ADN a été déterminée par un spectrophotomètre UV à 260-280 nm, et stockée à 4 °C jusqu’à l’utilisation.

Amplification par PCR
Les cibles de la PCR étaient les 16 gènes de l’ARNrS, lipL41 et lipL32, qui identifient l’ADN du genre Leptospira et permettent de distinguer les trois clades : pathogène, saprophyte et intermédiaire. Les conceptions des amorces et des sondes étaient basées sur les travaux antérieurs d’Ahmed et al., Azali et al., Bourhy et al., Weiss et al., et Branger et al.33,34,35,36,37. La séquence de chaque sonde, amorce et fragment amplifié est décrite dans le Tableau 1, et leur alignement avec les séquences de référence est fourni dans le Fichier supplémentaire 1, le Fichier supplémentaire 2, le Fichier supplémentaire 3, le Fichier supplémentaire 4 et le Fichier supplémentaire 5. Les réactifs de PCR et les conditions de thermocyclage sont décrits dans la section protocole.

Les produits d’amplification ont été visualisés par séparation électrophorétique sur un gel d’agarose à 1 % dans un TAE (40 mM de base Tris, 20 mM d’acide acétique et 1 mM d’EDTA ; pH 8,3), à 60 V pendant 45 min avec détection au bromure d’éthidium, comme le montre la figure supplémentaire 1. L’ADN génomique obtenu à partir de chaque sérotype a été utilisé avec des concentrations allant de 6 x 10⁶ à 1 x 10⁴ copies équivalentes génomiques (GEq) dans chaque réaction PCR, sur la base de la taille du génome de L. interrogans (4 691, 184 pb)³⁸ pour Leptospira pathogène, de la taille du génome de L. biflexa (3 956, 088 pb)³⁹ pour Leptospira saprophyte, et la taille du génome de la souche BUT6 du sérovar de L. fainei Hurstbridge (4 267, 324 pb) avec le numéro d’accession AKWZ00000000,2.

La sensibilité des sondes a été évaluée à l’aide de l’ADN de chaque sérotype pathogène, de la souche sérovar Patoc I de L. biflexa et de la souche BUT6 de Hurstbridge sérovar de L. fainei . Pour évaluer la spécificité de la PCR et de l’essai d’hybridation par transfert de points, on a inclus de l’ADN de bactéries non apparentées.

Tableau 1 : Amorces et sondes PCR pour amplifier les produits d’identification des clades pathogènes, saprophytes et intermédiaires de Leptospira. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce tableau.

Essai d’hybridation dot-blot
La technique est appelée dot-blot car les trous dans lesquels l’échantillon d’ADN est placé ont une forme de point, et lorsqu’ils sont aspirés pour être fixés en place par aspiration sous vide, ils acquièrent cette forme. Cette technique a été mise au point par Kafatos et ^al.40. La technique permet la semi-quantification de Leptospira dans chaque échantillon positif à la PCR. Le protocole consiste en une dénaturation avec du NaOH 0,4 M à température ambiante, des échantillons avec de l’ADN de Leptospira de 30 ng à 0,05 ng, correspondant à 6 x 10⁶ à 1 x 10⁴ leptospires, sont tamponnés sur une membrane en nylon avec un appareil de transfert de points de 96 puits. Après l’immobilisation, l’ADN est lié à la membrane par l’exposition à une lumière UV de 120 mJ. Chaque sonde d’ADN est conjuguée avec la digoxigénine-11 dUTP par une étape de catalyse terminale de la transférase à l’extrémité 3′ (la digoxigénine est un stéroïde végétal obtenu à partir de Digitalis purpurea, utilisé comme rapporteur⁴¹). Suite à l’hybridation rigoureuse de la sonde d’ADN marquée (50 pmol) à la température spécifique sur l’ADN cible, les hybrides d’ADN sont visualisés par la réaction de chimiluminescence avec l’anticorps anti-digoxigénine phosphatase alcaline conjugué de manière covalente avec son substrat CSPD. La luminescence est capturée par l’exposition à un film radiographique (figure 2).

Figure 2 : Étapes de la procédure pour le test PCR-dot-blot. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Protocol

1. Préparation de l’échantillon Concentrer chaque échantillon d’eau dans des tubes de microcentrifugation de 1,5 mL par centrifugation à 8 000 x g pendant 10 min à 4 °C. Répétez cette étape, autant de fois que nécessaire, pour concentrer l’échantillon dans un volume de 250 μL. Utilisez le kit d’extraction d’ADN conformément aux instructions du fabricant (voir le tableau des matériaux). Effectuez la PCR spécifique en fonctio…

Representative Results

Pour évaluer l’efficacité de la technique, l’ADN génomique de cultures pures de chaque sérovar de Leptospira a été utilisé, ainsi que la sonde spécifique au clade. Des membranes ont été préparées avec 100 ng d’ADN génomique par réaction PCR pour chaque sérotype, suivis de huit ADN génomiques de bactéries non apparentées et de concentrations variables d’ADN génomique des sérovars ad hoc de Leptospira. Chaque test comprenait des contrôles positifs, négatifs et non matrimoniau…

Discussion

Les étapes critiques de la technique dot-blot comprennent (1) l’immobilisation de l’ADN, (2) le blocage des sites de liaison libres sur la membrane avec de l’ADN non homologue, (3) la complémentarité entre la sonde et le fragment cible dans des conditions de recuit, (4) l’élimination de la sonde non hybridée et (5) la détection de la molécule rapporteure⁴¹.

La PCR-Dot-blot présente certaines limites, telles que la technique ne fournit pas d’information…

Materials

REAGENTS
Purelink DNA extraction kit	Invitrogen	K182002
Gotaq Flexi DNA Polimerase (End-Point PCR Taq polymerase kit)	Promega	M3001
Whatman filter paper, grade 1,	Merk	WHA1001325
Nylon Membranes, positively charged Roll 30cm x 3 m	Roche	11417240001
Anti-Digoxigenin-AP, Fab fragments Sheep Polyclonal Primary-antibody	Roche	11093274910
Medium Base EMJH	Difco	S1368JAA
Leptospira Enrichment EMJH	Difco	BD 279510
Blocking Reagent	Roche	11096176001
CSPD ready to use Disodium 3-(4-methoxyspiro {1,2-dioxetane-3,2′-(5′-chloro) tricyclo [3.3.1.13,7] decan}8-4-yl) phenyl phosphate	Merk	11755633001
Deoxyribonucleic acid from herring sperm	Sigma Aldrich	D3159
Developer Carestream	Carestream Health Inc	GBX5158621
Digoxigenin-11-ddUTP	Roche	11363905910
EDTA, Disodium Salt (Dihydrate)	Promega	H5032
Ficoll 400	Sigma Aldrich	F8016
Fixer Carestream	Carestream Health Inc	GBX 5158605
Lauryl sulfate Sodium Salt (Sodium dodecyl sulfate; SDS) C12H2504SNa	Sigma Aldrich	L5750
N- Lauroylsarcosine sodium salt CH3(CH2)10CON(CH3) CH2COONa	Sigma Aldrich	L-9150	It is an anionic surfactant
Polivinylpyrrolidone (PVP-40)	Sigma Aldrich	PVP40
Polyethylene glycol Sorbitan monolaurate (Tween 20)	Sigma Aldrich	9005-64-5
Sodium Chloride (NaCl)	Sigma Aldrich	7647-14-5
Sodium dodecyl sulfate (SDS)	Sigma Aldrich	151-21-3
Sodium hydroxide (NaOH)	Sigma Aldrich	1310-73-2
Sodium phosphate dibasic (NaH2PO4)	Sigma-Aldrich	7558-79-4
Terminal transferase, recombinant	Roche	3289869103
Tris hydrochloride (Tris HCl)	Sigma-Aldrich	1185-53-1
SSPE 20X	Sigma-Aldrich	S2015-1L	It can be Home-made following Supplementary File 6
Primers	Sigma-Aldrich	On demand	Follow table 1
Probes	Sigma-Aldrich	On demand	Follow table 1
Equipment
Nanodrop™ One Spectrophotometer	Thermo-Scientific	ND-ONE-W
Refrigerated microcentrifuge Sigma 1-14K, suitable for centrifugation of 1.5 ml microcentrifuge tubes at 14,000 rpm	Sigma-Aldrich	1-14K
Disinfected adjustable pipettes, range 2-20 µl, 20-200 µl	Gilson	SKU:F167360
Disposable 1.5 ml microcentrifuge tubes (autoclaved)	Axygen	MCT-150-SP
Disposable 600 µl microcentrifuge tubes (autoclaved)	Axygen	3208
Disposable Pipette tips 1-10 µl	Axygen	T-300
Disposable Pipette tips 1-200 µl	Axygen	TR-222-Y
Dot-Blot apparatus Bio-Dot	BIORAD	1706545
Portable Hergom Suction	Hergom	7E-A
Scientific Light Box (Visible-light PH90-115V)	Hoefer	PH90-115V
UV Crosslinker	Hoefer	UVC-500
Thermo Hybaid PCR Express Thermocycler	Hybaid	HBPX110
Radiographic cassette with IP Plate14 X 17	Fuji