Waiting
Traitement de la connexion…

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

Histologisk undersøkelse av mitokondriell morfologi i en modell for Parkinsons sykdom

Published: June 23, 2023 doi: 10.3791/65453
Automatic Translation
*1, *1, 1, 1, 1, 1, 1,2,3,4
1Achucarro Basque Center for Neuroscience, 2Department of Neuroscience, University of the Basque Country (UPV/EHU), 3Ikerbasque - Basque Foundation for Science, 4Oxford Parkinson’s Disease Centre and Department of Physiology, Anatomy and Genetics, University of Oxford
* These authors contributed equally

Summary

Denne studien presenterer en metode for å analysere morfologien til mitokondrier basert på immunfarging og bildeanalyse i musehjernevev in situ. Det beskriver også hvordan dette gjør det mulig å oppdage endringer i mitokondriell morfologi indusert av proteinaggregering i Parkinsons sykdomsmodeller.

Abstract

Mitokondrier spiller en sentral rolle i cellens energimetabolisme, og deres funksjon er spesielt viktig for nevroner på grunn av deres høye energibehov. Derfor er mitokondriell dysfunksjon et patologisk kjennetegn ved ulike nevrologiske lidelser, inkludert Parkinsons sykdom. Formen og organisasjonen av mitokondrienettverket er svært plastisk, noe som gjør at cellen kan reagere på miljømessige signaler og behov, og strukturen av mitokondrier er også tett knyttet til deres helse. Her presenterer vi en protokoll for å studere mitokondriell morfologi in situ basert på immunfarging av mitokondrieproteinet VDAC1 og påfølgende bildeanalyse. Dette verktøyet kan være spesielt nyttig for studiet av nevrodegenerative lidelser fordi det kan oppdage subtile forskjeller i mitokondrielle tall og form indusert av aggregater av α-synuclein, et aggregeringsutsatt protein som er sterkt involvert i patologien til Parkinsons sykdom. Denne metoden tillater en å rapportere at substantia nigra pars compacta dopaminerge nevroner som har pS129-lesjoner, viser mitokondriell fragmentering (som foreslått av deres reduserte Aspect Ratio, AR) sammenlignet med deres sunne naboneuroner i en forhåndsformet fibril intrakraniell injeksjon Parkinson-modell.

Introduction

Sentralnervesystemet har en intens etterspørsel etter ATP: nevroner bruker ATP for å støtte ioniske gradienter, nevrotransmittersyntese, synaptisk vesikkelmobilisering, frigjøring og resirkulering, og for å muliggjøre lokal proteinoversettelse og nedbrytning. Mer enn 95% av ATP som brukes av hjernen, produseres av mitokondriene1. Derfor er det ikke overraskende at mitokondriell dysfunksjon er spesielt skadelig for nevroner. Faktisk spiller mitokondrielle funksjonsnedsettelser en viktig rolle i flere nevrologiske sykdommer, inkludert nevrodegenerative tilstander, som Parkinsons sykdom (PD) og Alzheimers sykdom (AD) 2,3.

Flere gener er entydig knyttet til PD-kodende proteiner som er relevante for mitokondriefunksjon og homeostase, som Parkin 4,5,6, PTEN-indusert kinase 1 (PINK1)7,8 og DJ-19. Ytterligere bevis for en rolle for mitokondriell dysfunksjon i PD er at behandlinger med hemmere av kompleks I i mitokondriell elektrontransportkjede (som rotenon og MPTP) rekapitulerer flere aspekter av PD in vitro og in vivo10. Det er imidlertid viktig å si at mange patologiske prosesser kan drive nevrontap i PD, sammen med mitokondrielle underskudd: oksidativt stress, endret kalsiumhomeostase, svikt i ubiquitin-proteasomet og autofagi-lysosomale systemer og proteinaggregering er blant de mest studerte (gjennomgått i 11,12,13 og).

Mitokondrier er heterogene i form: i tillegg til individuelle enheter, blir de ofte funnet som utvidede retikulære og rørformede nettverk. Strukturen og den cellulære plasseringen av mitokondrier er kritiske for deres funksjon14; Faktisk er mitokondrielle nettverk ekstremt dynamiske, gjennomgår hyppige prosesser med fisjon, fusjon og mitofagi for å møte cellens behov og å reagere på miljøsignaler15,16. I tillegg er morfologien til mitokondrier nært knyttet til deres helsestatus. For eksempel, i human optisk atrofi, fører genetiske mutasjoner som reduserer mitokondriell aktivitet til unormale, slanke og hypersmeltede mitokondrier17. På den annen side presenterer en rekke menneskelige sykdommer avvikende mitokondriell morfologi, inkludert mitokondriell fragmentering eller overdreven mitokondriell fusjon, som har skadelige effekter på mitokondriell funksjon (gjennomgått i18). I PD-sammenheng har vi og andre tidligere vist at unormal mitokondriell form korrelerer med dysfunksjon som respons på α-synucleinaggregater19. Mens mitokondriell morfologi har blitt grundig studert in vitro både i sammenheng med PD og andre sykdommer 20,21,22, mangler protokoller for evaluering av mitokondriell morfologi fra in vivo-seksjoner. Dette gjør in vivo-studien av mitokondrier i sammenheng med sykdommer som PD svært avhengig av transgene dyr23 eller evalueringen av midtveisekstrakter som ikke kan gi cellulær oppløsning.

Her presenteres en protokoll for å studere mitokondriell morfologi in situ som en indikator på deres funksjonelle status og helse, basert på immunfarging av mitokondrieproteinet VDAC124 etterfulgt av bildeanalyse i parafininnebygde vevssnitt. Vi viser også resultatene av denne protokollen in vitro og in vivo PD-modeller: neuroblastomceller som overuttrykker SNCA (Synuclein Alpha) og hjernevev fra mus utsatt for intrakraniell injeksjon av α-synuclein Pre-Formed Fibrils (PFFs). Samtidig immunfarging med antistoff mot α-synuclein (i celler) eller fosfoSer129- α-synuclein pS129 (i musehjerner) tillot oss å identifisere celler med samlet proteinpatologi (henholdsvis overuttrykt α-synuclein og α-synuclein fibriller) i prøvene, mens negative celler fungerte som en ikke-patologisk kontroll innenfor de samme prøvene. Gjennom denne analysen og dataene beskrevet her, ble det observert et redusert størrelsesforhold, noe som indikerer fragmentering av mitokondrier i celler som overuttrykker SNCA eller presenterer pS129-lesjoner.

Protocol

Alle prosedyrer beskrevet i dette avsnittet er utført i henhold til det etiske rammeverket gitt av Universitetet i Baskerland Referanse M20/2022/212, regjeringen i Baskerland, den spanske regjeringen og EU.

1. Mitokondriell morfologianalyse i SNCA-overuttrykkende SH-SY5Y-celler

MERK: Her gis en kort beskrivelse av genereringen av in vitro-materialet for studien, som vil tjene som en sammenligning for in situ oppnådde resultater. Det anbefales at denne typen analyse utføres før lansering av et in vivo-eksperiment for mitokondriell morfologi, da det vil sikre at alle passende bildebehandlings- og analyseoppsett er på plass.

  1. For å øke cellulær tilknytning og lette cellulær adhesjon på flate optiske bunnplater med 96-brønn, tilsett 25 μL / brønn av beleggmatrise 1: 1000 i DMEM F12 ved pipettering (se materialtabell). Inkuber platene i 1 time ved 37 °C og 5 % CO2.
  2. Grev SH-SY5Y ved hjelp av Neubauer-kammeret. Fjern belegningsmatrisen ved pipettering, og frø 10.000 celler / brønn på den belagte 96-brønnplaten i 50 μL / brønn av DMEM F-12 supplert med 10% FBS, 2 mM glutamin og penicillin / streptomycin (se materialtabell).
  3. Inkuber cellene ved 37 °C og 5 %CO2i 24 timer.
  4. Forbered en blanding av 250 ng pcDNA3.1 som bærer human villtype SNCA, 0,250 μL av transfeksjonsreagenset, 0,250 liter transfeksjonsadjuvans og transfeksjonsmedium opptil 50 μL for hver brønn (se materialtabell). Utarbeide en masterløsning med tanke på totalt antall brønner i forsøket.
  5. Fjern dyrkningsmediet ved manuell pipettering og tilsett 50 μL/brønn av oppløsningen tilberedt i trinn 1.4 ved pipettering. Inkuber ved 37 °C, 5 % CO2.
  6. h etter transfeksjon, fjern transfeksjonsmediet ved pipettering og tilsett 25 μL/brønn med 4 % paraformaldehyd (PFA) i PBS.
    FORSIKTIG: Paraformaldehyd er et giftig fikseringsmiddel; bruk egnet PPE.
  7. Inkuber i 5 minutter ved romtemperatur (R.T). Fjern festeoppløsningen ved å pipettere og vask én gang ved å tilsette 50 μL/brønn PBS. Fjern PBS ved pipettering.
  8. Pipette 25 μL/brønn TBS med 0,05 % Tween (TBS-T) og 10 % normalt eselserum (NDS, se Materialtabell). Inkuber i 1 time ved RT for å blokkere ethvert uspesifikt signal.
  9. Forbered en løsning av Rabbit-anti-α-synuclein antistoff MJFR1 1:1000 sammen med Mouse-anti-TOMM20 antistoff 1:100 i TBS-T (se materialtabell) i henhold til antall brønner som skal analyseres.
  10. Fjern blokkeringsoppløsningen fra trinn 1.8 ved pipettering og tilsett 25 μl/brønn av blandingen av primære antistoffer fremstilt i trinn 1.9. Inkuber over natten ved 4 °C.
  11. Fjern den primære antistoffløsningen og vask tre ganger ved å tilsette og fjerne 50 μL / brønn TBS-T ved pipettering.
  12. Forbered en løsning av grønt sekundært antistoff anti-Mouse 1: 1000 sammen med rødt sekundært antistoff antikanin 1: 1000 i TBS-T (se materialtabell) i henhold til antall brønner som skal analyseres.
  13. Etter aspirasjon av PBS fra siste vask beskrevet i trinn 1.11, tilsett 25 μL/brønn av den sekundære antistoffblandingen ved hjelp av en pipette og inkuber platen i 1 time ved R.T.
  14. Fjern den sekundære antistoffløsningen ved pipettering og tilsett 25 μL/brønn på 2 g/ml DAPI i TBS-T. Inkuber platen i 5 min ved R.T.
  15. Fjern DAPI-oppløsningen med en pipette og vask tre ganger ved å tilsette og fjerne 50 μL/brønn TBS-T med en pipette.
  16. Pipette 80 μL/brønn PBS med 0,02 % natriumazid og oppbevar platen ved 4 °C.
    FORSIKTIG: Natriumazid er giftig; bruk egnet PPE.
  17. Ta bilder med et automatisert fluorescensmikroskop med høyt innhold eller tilsvarende konfokalbildesystem utstyrt med et 60x-objektiv (se materialfortegnelse).
  18. Utfør analyse av TOMM20-signalet til enkeltceller ved hjelp av Fiji ved å følge trinn 3.15-3.21. Unngå celler som gjennomgår apoptose, nekrose eller mitose.
    MERK: For å gjøre det, utelukker vi fra analysen cellene som viser de morfologiske egenskapene til apoptose, nekrose eller mitose som er synlige under mikroskopet, for eksempel cellekrymping, membranblebbing, celleavløsning, kjernefysisk kondensasjon, DNA-fragmentering og kondensert kjernekromatin organisert i tykke tråder justert i et enkelt plan.

2. Genereringen av PFF og PFF intrakranielle injeksjoner hos mus

MERK: Genereringen av injeksjonsmateriale og den intrakranielle injeksjonsprosessen presenteres her. Denne protokollen er tilpasset fra Luk et al.25.

  1. For å oppnå PFF, plasser en tube/kolbe inneholdende 0,5 ml α-syn (5 mg/ml; Peptid, se materialfortegnelse) på en shaker ved 37 °C og 250 r.p.m. i 7 dager for å indusere aggregering av α-synuclein.
  2. Sonikere det aggregerte α-synuclein ved 20% amplitude og 0,25 syklusplikt til optimal fragmentering ble oppnådd og observert ved negativ farging av prøvene med transmisjonselektronmikroskopi.
  3. For å forberede hann- og hunnmus av villtype C57Bl/6 (3 måneder gamle) til striatale PFF-injeksjoner, administrer Meloxicam/Metacam (5 mg/kg) i saltoppløsning subkutant. Administrer også 1 ml av den sterile saltoppløsningen via to 0,5 ml subkutane injeksjoner per dyr. Disse behandlingene forhindrer dehydrering, betennelse og smerte.
  4. Indusere anestesi med 4 % isofluran og 0,7 l/mino2 i et induksjonskammer. Kontroller dybden av anestesi ved mangel på pedalrespons.
  5. Barbere den øvre delen av musehodet og sett dyret forsiktig inn i rammen av det stereotaktiske apparatet på en varmematte.
  6. Oppretthold anestesiplanet ved å gi anestesi på dyr (1%-2% isofluran i 0,7 l / min o2) gjennom en ansiktsmaske under hele injeksjonsprosessen.
  7. Plasser dyret på den stereotaktiske rammen. Desinfiser operasjonsområdet med tre runder vekslende klorhexidinskrubb og 70% etanol. Påfør Marcaine/Bupivacaine lokalt (ca. 100 μL) som en subkutan infiltrasjon på 0,25 %.
  8. Utfør et 0,5 cm snitt av huden for å eksponere skallen og bor et hull på 1 mm diameter inn i skallen for å eksponere hjerneoverflaten, i følgende koordinater fra Bregma: - 0,5 mm anteroposterior, +/- 2,5 mm mediolateral.
  9. Injiser 1,5 l PFF oppnådd i trinn 2.2 ved stereotaktisk levering til koordinatene angitt i trinn 2.8 fra Bregma og -2,7 mm dorsoventral (fra øverste hjerne) med en strømningshastighet på 100 nl/min med en 32-G Hamilton sprøyte. Trekk ut sprøyten 5 minutter etter injeksjon.
  10. Sutur (størrelse: 4-0, 45 cm, se materialtabell) såret med tre til fem sting etter behov, og bind hver av dem med 2 doble knuter og deretter en enkelt knute. Stopp bedøvelsesinnånding og fjern musen fra rammen.
  11. La musen komme seg i et passende restitusjonsbur før du returnerer den til hjemmeburet.
  12. I løpet av den følgende uken, utfør daglige postoperative kontroller. Ethvert dyrs smerte, nød eller ubehag bør doseres med Meloxicam/Metacam som angitt i trinn 2.3 hver 24. time.
  13. Tre måneder senere, injiser 300 mikrol 200 mg/ml natriumpentobarbital i saltoppløsning via en intraperitoneal injeksjon. Når smerterefleksen er tapt, gjør et snitt (2-3 cm) på brystet og løft ribbeina for å eksponere hjertet.
  14. Transkardial perfusasjon med 10 ml PBS og 35 ml 4 % paraformaldehyd i PBS etter hverandre ved 5 ml/min ved bruk av en 50 ml sprøyte koblet til en 23 G sommerfuglnål.
  15. Fjern hjernen og postfix i 4 % PFA i ytterligere 24 timer ved 4 °C. Oppbevar den i 70 % etanol ved 4 °C etter PFA-behandling.
  16. Sett hjernen i passende plastinnbyggingsbokser (se materialtabell) og rug i 95% etanol i 1 time ved RT Gjenta trinnet i fersk 95% etanol og inkuber igjen i 1 time.
  17. Overfør hjernen til 100% etanol i 1 time ved RT Gjenta trinnet i fersk 100% etanol og inkuber igjen i 1 time.
  18. Overfør hjerner til xylen eller xylenerstatning i 1 time ved RT Gjenta i frisk oppløsning og inkuber igjen i 1 time.
  19. Fjern xylen- eller xylenerstatningen og inkuber prøven i varm parafin i 1 time. Bytt paraffin og inkuber i en ekstra time.
  20. Monter hjernen på innebyggingsboksene med varm parafin og la den tørke over natten. Forbered 5 μm seksjoner ved hjelp av en mikrotome (se materialfortegnelse) og monter dem på glassglass.

3. Mitokondriell morfologianalyse ved immunhistokjemi på parafininnebygde hjerneskiver fra PFF-injiserte mus

  1. Devoks lysbildene ved å dyppe i xylenerstatning ti ganger. Inkuber lysbildene i 2 minutter i xylenerstatning. Dip igjen ti ganger i xylen erstatning.
    NOTAT: Dette trinnet er nødvendig for å fjerne parafinen og muliggjøre rehydrering av prøvene.
  2. Rehydrering: Gjenta prosedyren beskrevet i trinn 3.1 med følgende løsninger: 100% EtOH, 95% EtOH, 70% EtOH og to ganger med ddH2O i rekkefølge.
  3. Utfør antigenuthenting og immunfarging ved å følge trinnene nedenfor.
    1. Start med å overføre prøvene til en mikrobølgebeholder med ddH2O.
    2. Varm opp 100x citratbuffer pH 6 (se materialfortegnelse) lagret ved 4 °C (vaskemidler kan ha utfelt) og tilbered 350 ml fersk 1x citratbuffer. Hell deretter citratbufferen i en praktisk plastbeholder med lokket.
    3. Sett lysbildene i citratbufferbeholderen (KRITISK: sjekk at lysbildene er under buffernivået) og sett lokket på.
      FORSIKTIG: Forsikre deg om at lokket IKKE er helt lukket, ellers kan beholderen sprekke i mikrobølgeovnen.
    4. Mikrobølgeovn ved 700 W: 4 min + 5 min hvile, 1,5 min + 5 min hvile. Fyll på citratbuffer og mikrobølgeovn igjen 1,5 min + 5 min hvile, 1,5 min + 5 min hvile, 1,5 min + 5 min hvile.
    5. Kjøl ned prøvene i sitratbuffer på is i 20 min. Vask prøven med ddH2O.
      MERK: Antigenhenting kan variere i henhold til spesifikke antistoffkrav.
  4. Tørk prøvelysbildene med papirhåndkle uten å berøre vevet. Tegn rektangler med en pap penn (se Tabell over materialer) rundt biter av vev.
  5. Overfør alle lysbildene til en glideboks for immunfarging og vask forsiktig et par ganger med TBS + 0,05 % TWEEN (TBS-T). Sjekk TBS-T dråper holde seg inne i pap-penn rektangler.
  6. Fjern TBS-T fra prøvene ved å trykke på papirhåndkle. Tilsett 50 μL av en blokkeringsløsning (10% NDS i TBS-T) i hvert rektangel (uten å berøre vevet) og inkuber i 1 time ved RT.
    MERK: Volumene kan variere i henhold til vevets størrelse. Prøv å sikre at: (1) det pap-skrevne området er likt på tvers av prøver, og (2) området er fullt dekket av det valgte buffervolumet.
  7. Fjern blokkeringsløsningen fra prøvene ved å trykke på et papirhåndkle. Forsiktig pipette 50 μL/rektangel av følgende primære antistoffblanding i TBS-T: anti-tyrosinhydroksylase 1:250 sammen med anti-VDAC1 1:100 og anti-pSer129 α-synuclein EP1536Y 1:2000 (se materialfortegnelse).
  8. Inkuber over natten ved 4 °C.
  9. Vask ved å pipette TBS-T på lysbildene og fjern det ved å trykke på papirhåndkle. Gjenta tre ganger.
  10. Legg til ved pipettering 50 μL / rektangel av sekundær antistoffblanding: grønn sekundær anti-kylling, rød sekundær anti-mus og langt rød sekundær antikanin 1: 1000 i TBS-T (se materialfortegnelse). Inkuber ved 37 °C i 1 time i mørket.
  11. Vask tre ganger med TBS-T som beskrevet i trinn 3.13.
  12. Inkuber med DAPI 2 μg/ml i TBS-T i 1 min. Fjern DAPI-løsningen ved å trykke på papirhåndkle. Vask tre ganger med TBS-T som beskrevet i trinn 3.13.
  13. Monter en glassdekselslip på prøvene ved hjelp av 2 dråper / lysbilde av monteringsreagens (se materialfortegnelse). Trykk forsiktig på dekslet for å fjerne bobler og la prøvene tørke i 1 time ved R.T. Etterpå oppbevares ved 4 °C i mørket.
  14. Avbilde minst 50 celler i forskjellige felt ved hjelp av strukturert belysning, fluorescensavbildningssystem utstyrt med 60x olje, objektiv eller konfokal teknologi.
  15. Utfør analyse av VDAC1-signalet til enkeltceller ved hjelp av Fiji som angitt i følgende trinn.
    1. Først velger og isolerer du interesseområdet (ROI) ved å tegne en kontur rundt den positive eller negative cellen (etter behov) og bruke "Beskjær"-funksjonen. For å unngå skjevhet i ROI-valg, velg det ved å vurdere fluorescenssignalet til en markør som ikke er relatert til analysen (dvs. ikke en mitokondriemarkør).
  16. Valgfritt: Hvis bildet er for pikselert, bruk "glatt" -funksjonen for å få en høyere kantdefinisjon.
    MERK: Hvis den jevne funksjonen brukes på et bilde, må du bruke den på alle påfølgende bilder.
  17. Valgfritt: bruk "Convolve"-funksjonen (kjernemodus, i Process > Filters) for å redusere bakgrunnen.
    MERK: Dette er valgfritt og vanligvis ikke nødvendig når du bruker seksjoner på 5 m på grunn av seksjonenes tynnere natur.
  18. Aktiver formbeskrivelsene og begrens til terskelalternativene i funksjonen "Angi måling" (sørg for at disse aktiveres gjennom analysen).
  19. I "Juster" -menyen velger du terskelfunksjonen og justerer terskelnivået. Terskelinnstillingene må opprettholdes for alle celler i samme utvalg.
    1. Prøv å sikre tilstrekkelig visualisering av mitokondrienettverket, som vist i de representative bildene i denne artikkelen, mens du kaster bakgrunnspiksler.
  20. Bruk verktøyet Analyser partikler i kategorien Analyser. Angi en passende størrelse for å fange mitokondriene. I dette eksemplet størrelse: 25-Infinity, aktiver: Pikselenheter og velg: Vis: Masker-kommandoer ble brukt til å visualisere resultatet. Fiji vil beregne og vise teller, størrelsesforhold (AR) og andre formparametere i et nytt panel.
  21. Utfør statistisk analyse av dataene etter behov. I dette eksperimentet ble t-testen brukt til å analysere forskjellen i gjennomsnittlig Aspect Ratio (AR) og Counts beregnet av Fiji mellom eksperimentgruppene etter normalitetstesting med D'Agostino og Pearson normalitetstester.

Representative Results

For å sikre at passende bilde- og analysebetingelser er på plass for in situ evaluering av mitokondriell morfologi i vev, anbefales en in vitro utforskning av mitokondriell morfologi som respons på en kjent modulator av mitokondriell morfologi (avsnitt 1). Som et eksempel ble SNCA genetisk overuttrykt i SH-SY5Y-celler for å indusere endringer i mitokondriell morfologi som tidligere beskrevet26. Andre fornærmelser som kan brukes som en kontroll for å forverre mitokondriell morfologi ville være sult eller bruk av mitokondrielle aktivitetshemmere som MPP +. Cellene ble transfeksjonert og farget for α-synuclein (AS) for å skille SNCA+ (AS+) og SNCA- (AS-) celler. De ble også farget med TOMM2027 for å visualisere det mitokondrielle nettverket av celler. For å gjøre denne analysen så lik som mulig for en 5 μm vevsseksjon, ble ett konfokalplan analysert i motsetning til en maksimal projeksjon av flere plan. Morfologisk analyse av ett konfokalplan av TOMM20 viste at både det totale antallet mitokondrier og deres størrelsesforhold eller AR (som korrelerer med forlengelsen av organellen) ble redusert som respons på SNCA-overuttrykk (figur 1).

Immunfarging ble utført for mitokondrieproteinet VDAC1 i 5 μm parafininnebygde musehjernesnitt fra dyr injisert med PFF som beskrevet i protokollavsnittet ovenfor. Substantia nigra pars compacta (SNc) dopaminerge nevroner, som gjennomgår degenerasjon i PD, ble avslørt ved samtidig immunfarging med antityrosinhydroksylase (TH) og ble regionalt separert fra det ventrale tegmentale området og substantia nigra pars lateralis. På den annen side tillot anti-fosfoSer129-α-synuclein (pS129) farging oss å diskriminere celler som hadde pS129-lesjoner fra friske celler (pS129+ versus pS129-). Det ble tatt SNc-bilder av tre ulike dyr, og påfølgende bildeanalyse av VDAC1-farging av TH-positive nevroner viste reduksjon av både mitokondrielt tallantall og aspektratio mellom nevroner med pS129-lesjoner og nevroner som manglet disse (figur 2). Disse resultatene indikerer at mitokondriell morfologi av nevroner som har pS129-lesjoner er svekket sammenlignet med celler som mangler pS129-lesjoner.

Mens dette spesielle eksperimentet viser en reduksjon i AR, og dermed fremhever en reduksjon i forlengelsen av mitokondrier sammen med en reduksjon i globale tellinger, noe som indikerer en forverring av mitokondriell morfologi, bør tolkningen av dataene være eksperimentavhengig. For eksempel kan en reduksjon i AR og tellinger peke på en global reduksjon i mitokondrielt innhold samt fragmentering, mens en reduksjon i AR, men en økning i globale tellinger, vil peke på en mitokondriell fragmenteringsfenotype. Derfor er det viktig å tolke dataene i sammenheng med begge tiltakene.

Figure 1
Figur 1: Mitokondriell morfologi i en SNCA-overuttrykkende in vitro-modell . Samtidig immunfarging for TOMM20 (grønn), α-synuclein (AS, rød) og DAPI (blå) på SNCA-overuttrykkende og ikke overuttrykkende (henholdsvis AS+ og AS-) celler (A). Detalj av en AS-celle (B) og en AS+-celle (C). Svart-hvitt-bilder i panelene (B) og (C) representerer maskene til TOMM20-signalet etter bruk av Fiji-funksjonen beskrevet i protokolldelen. Denne masken muliggjør kvantifisering av formen på de resulterende strukturene. Mitokondrietall og Aspect Ratio (AR) verdier av AS- og AS+ celler (N = 25 celler per tilstand) ble kvantifisert og representert som individuelle verdier samt gjennomsnittlig ± SEM; **p-verdi < 0,05 t-test (D). Normalitet ble vurdert gjennom normalitetstestene D'Agostino og Pearson. Skala barer: A, 30 μm; B,C, 5 μm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 2
Figur 2 Mitokondriell morfologi påvirkes i nevroner med pS129-lesjoner. Co-immunfarging for TH (grønn), VDAC1 (rød), fosfoS129-α-synuclein (magenta) og DAPI (blå) av SNc av PFF-injiserte mus (A). Detaljen av et fosfoS129-α-synuclein-negativt (pS129-) dopaminergt nevron (B) og av et fosfoS129-α-synuclein-positivt (pS129+) dopaminergt nevron (C). Svart-hvitt-bilder i panelene (B) og (C) representerer maskene til TOMM20-signalet etter bruk av Fiji-funksjonen beskrevet i protokolldelen. Denne masken muliggjør kvantifisering av formen på de resulterende strukturene. Negative og positive celler ble talt i prøver fra tre forskjellige dyr som illustrert av de forskjellige fargene på de individuelle grafverdiene (blå, grønn og oransje). Mitokondrietall og AR-kvantifisering av pS129- (N = 29) versus pS129+ (N = 22) i dopaminerge nevroner ble representert som gjennomsnitt ± SEM samt individuelle celleverdier; **p-verdi < 0,05 t-test (D). Normalitet ble vurdert gjennom normalitetstestene D'Agostino og Pearson. Skala barer: A, 30 μm; B,C, 5 μm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Discussion

Samlet sett viser denne studien at immunfarging kombinert med bildeanalyse er en pålitelig metode for å analysere mitokondriell morfologi. Faktisk tillater det kvantifisering av antall mitokondrier, samt noen morfologiske parametere som størrelsesforhold i både cellekultur og vev. Antallet mitokondrier er direkte knyttet til den funksjonelle statusen til fisjons- og fusjonsmekanismene til prøvene, mens AR-verdien er avhengig av forlengelsen av organellen. Denne metoden kan være spesielt verdifull for rask evaluering av mitokondrieavvikene i modeller av PD der endret mitokondriell morfologi, dynamikk og funksjoner er velkjente patologiske mekanismer28,29. α-synuclein spiller også en relevant rolle i PD: faktisk er α-synuclein en av komponentene i Lewy-legemer, de cytoplasmatiske fibrillære aggregatene som brukes til post mortem-diagnose av PD-pasienter30. Videre ble mutasjoner i SNCA-genet funnet hos pasienter med både kjent og sporadisk PD (gjennomgått i31). Fosforylering av α-synuclein ved Ser129 har i stor grad vist seg å merke Lewy-Body-lignende patologi, som oppstår etter PFF-fornærmelse og fremkaller forskjellige toksiske effekter32,26.

Ved hjelp av verktøyet som presenteres her, var vi i stand til å oppdage en reduksjon i mitokondrietall og AR-verdier i nærvær av både overuttrykt og aggregert α-synuclein (celler med henholdsvis α-synuclein-farging og nevroner som bærer fosfoSer129a-synuclein-positive lesjoner) sammenlignet med celler som mangler slike lesjoner (α-synuclein- og fosfoS129a-synuclein-negative celler). Disse resultatene stemmer overens med tidligere rapporter som viser hvordan direkte α-synuclein-mitokondrier-interaksjoner gir toksiske effekter på mitokondriell funksjon og homeostase i PD26,33, 34. Faktisk ble det rapportert at mus med α-synuclein mutasjoner utviser økt mitokondriell DNA-skade35 og mitofagi 36,37. Videre ble det beskrevet at økte α-synucleinnivåer fremmer mitokondriell fisjon / fragmentering, induserer reaktive oksygenarter i mitokondrier, og dysregulerer mitokondrielt proteinuttrykk i cellelinjer og musemodeller som overuttrykker α-synuclein 26,38,39.

Det er viktig å fremheve at dette verktøyet i stor grad avhenger av antistoffene som brukes til studien; Nøye morfologisk evaluering av antistoffflekken som brukes er avgjørende for å oppdage det passende subcellulære rommet. Siden denne teknikken er basert på 5 μm seksjoner og derfor krever enkle fokalplan for analyse av mitokondrielle strukturer, vil fraværet av en fenotype ikke utelukke eksistensen av en fenotype, da det er mulig at subtile forskjeller i mitokondriell morfologi kanskje ikke oppdages ved denne metoden.

Selv om dette arbeidet og andre tidligere har brukt lignende tilnærminger for å evaluere mitokondriell morfologi in vivo40, er det behov for at en detaljert protokoll gjøres tilgjengelig for forskningsmiljøet for denne vurderingen. Betydningen av denne studien er at det er mulig å anvende denne metoden på forskjellige in vivo sykdomsmodeller for å vurdere mitokondrielle morfologiske abnormiteter og identifisere potensiell patologi, noe som til slutt kan lette screening av blyforbindelser for behandling av slike lidelser. Selv om denne analysen for tiden er begrenset til parafin-innebygd vev, er fordelen med metoden at den kan brukes på hvilken som helst sykdomsmodell etter terminal vevssamling, noe som gjør den til et svært allsidig verktøy.

Disclosures

Vi ønsker å rapportere ingen interessekonflikter.

Acknowledgments

Vi ønsker å anerkjenne finansiererne av denne studien, spesielt Ikerbasque, det spanske departementet for vitenskap og innovasjon, Michael J Fox Foundation, IBRO og Achucarro Basque Center for Neuroscience.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
32 G Hamilton syringe Hamilton 7632-01
4',6-diamidino-2-fenilindol, dihidrocloruro (DAPI) Invitrogen D1306
4/0 USP 45 cm suture SSa90 pga  32345n-36u
Alexa fluor 488/594-Donkey anti-Mouse  Invitrogen A21202; A21203 green/red dye-Donkey anti-Mouse
Alexa fluor 594/647-Donkey anti-Rabbit  Invitrogen A21207 A31573 red/far red dye-Donkey anti-Rabbit
AlexaFluor 488-Donkey anti-Chicken  Jackson ImmunoResearch 703-545-155 green dye-Donkey anti-Chicken
Anti-PSer129 α-synuclein EP1536Y (Rabbit) antibody Abcam ab51253
Anti-TOM 20 (Mouse) antibody Santa Cruz sc-17764
Anti-Tyrosine Hydroxylase (Chicken) antibody Abcam ab76442
Anti-VDAC1 (Mouse) antibody Santa Cruz sc-390996
Anti-α-synuclein antibody MJFR1 (Rabbit) Abcam ab138501
Citrate buffer 100X stock: 120mM citrate buffer, 5% Tween in water (pH 6) Home-made
Disposable base mold for tissue embedding Fisher 22-363-553 Plastic embedding boxes
D-MEM F12 Gibco A321331020
EVOS M7000 Imaging System ThermoFisher Scientific High-content automated fluorescence microscope
Fetal Bovine Serum Gibco 10270106
Flat optical bottom 96 well plates  Greiner 675090
FluorSave Reagent Millipore 345789-20ML Mounting reagent
Glutamine 200 mM Gibco 25030-024
ImmEdge Hydrophobic Barrier Pen Vector Laboratories H-4000 PAP-pen
Lipofectamine and Plus Reagent  Invitrogen 11668-019; 11514-015 Transfection reagent and transfection adjuvant
Matrigel Corning 354230 Coating matrix
Microtome ThermoFisher Scientific
Normal Donkey Serum  Gibco PCN5000
Opti-MEM Gibco 31985070 Transfection medium
PCDNA4 plasmid (backbone) Addgene 41036
Penicillin/Streptomycin solution Gibco 15140-122
SH-SY5Y cells/well ATCC HTB-11
Xylene substitute Labbox 22L36504
Zeiss Axio Imager Apotome 2 Carl Zeiss Structured illumination fluorescence imaging system 
α-synuclein peptide rpeptide  S-1010-2

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Yang, Y., Lu, B. Mitochondrial morphogenesis, distribution, and parkinson disease. Journal of Neuropathology and Experimental Neurology. 68 (9), 953-963 (2009).
  2. Schapira, A. H. Mitochondria in the aetiology and pathogenesis of Parkinson's disease. The Lancet Neurology. 7 (1), 97-109 (2008).
  3. Swerdlow, R. H. Mitochondria and mitochondrial cascades in alzheimer's disease. Journal of Alzheimer's Disease. 62 (3), 1403-1416 (2018).
  4. Hedrich, K., et al. type, and origin of Parkin mutations: Review and case studies. Movement Disorders. 19 (10), 1146-1157 (2004).
  5. Kahle, P. J., Haass, C. How does parkin ligate ubiquitin to Parkinson's disease. EMBO reports. 5 (7), 681-685 (2004).
  6. Dawson, T. M., Dawson, V. L. The role of parkin in familial and sporadic Parkinson's disease. Movement Disorders. 25, S32-S39 (2010).
  7. Pickrell, A. M., Youle, R. J. The Roles of PINK1, Parkin, and Mitochondrial Fidelity in Parkinson's Disease. Neuron. 85 (2), 257-273 (2015).
  8. Zhi, L., et al. Loss of PINK1 causes age-dependent decrease of dopamine release and mitochondrial dysfunction. Neurobiology of Aging. 75, 1-10 (2019).
  9. Bonifati, V., et al. DJ-1(PARK7), a novel gene for autosomal recessive, early onset parkinsonism. Neurological Sciences. 24 (3), 159-160 (2003).
  10. Chia, S. J., Tan, E. -K., Chao, Y. -X. Historical Perspective: Models of Parkinson's Disease. International Journal of Molecular Sciences. 21 (7), 2464 (2020).
  11. Wilson, D. M., Cookson, M. R., Den Bosch, L. V. an, Zetterberg, H., Holtzman, D. M., Dewachter, I. Hallmarks of neurodegenerative diseases. Cell. 186 (4), 693-714 (2023).
  12. Moore, D. J., West, A. B., Dawson, V. L., Dawson, T. M. Molecular pathophysiology of Parkinson's disease. Annual Review of Neuroscience. 28 (1), 57-87 (2005).
  13. Olanow, C. W., Tatton, W. G. Etiology and pathogenesis of Parkinson's disease. Annual Review of Neuroscience. 22 (1), 123-144 (1999).
  14. Nunnari, J., Suomalainen, A. Mitochondria: In sickness and in health. Cell. 148 (6), 1145-1159 (2012).
  15. Okamoto, K., Shaw, J. M. Mitochondrial Morphology and Dynamics in Yeast and Multicellular Eukaryotes. Annual Review of Genetics. 39 (1), 503-536 (2005).
  16. Malpartida, A. B., Williamson, M., Narendra, D. P., Wade-Martins, R., Ryan, B. J. Mitochondrial Dysfunction and Mitophagy in Parkinson's Disease: From Mechanism to Therapy. Trends in Biochemical Sciences. 46 (4), 329-343 (2021).
  17. Zou, W., et al. Nanoscopic quantification of sub-mitochondrial morphology, mitophagy and mitochondrial dynamics in living cells derived from patients with mitochondrial diseases. Journal of Nanobiotechnology. 19 (1), 136 (2021).
  18. Navaratnarajah, T., Anand, R., Reichert, A. S., Distelmaier, F. The relevance of mitochondrial morphology for human disease. The International Journal of Biochemistry & Cell Biology. 134, 105951 (2021).
  19. Zambon, F., et al. Cellular α-synuclein pathology is associated with bioenergetic dysfunction in Parkinson's iPSC-derived dopamine neurons. Human Molecular Genetics. 28 (12), 2001-2013 (2019).
  20. Cherubini, M., Lopez-Molina, L., Gines, S. Mitochondrial fission in Huntington's disease mouse striatum disrupts ER-mitochondria contacts leading to disturbances in Ca2+ efflux and Reactive Oxygen Species (ROS) homeostasis. Neurobiology of Disease. 136, 104741 (2020).
  21. Parihar, M. S., Parihar, A., Fujita, M., Hashimoto, M., Ghafourifar, P. Alpha-synuclein overexpression and aggregation exacerbates impairment of mitochondrial functions by augmenting oxidative stress in human neuroblastoma cells. The International Journal of Biochemistry & Cell Biology. 41 (10), 2015-2024 (2009).
  22. Wiemerslage, L., Lee, D. Quantification of mitochondrial morphology in neurites of dopaminergic neurons using multiple parameters. Journal of Neuroscience Methods. 262, 56-65 (2016).
  23. Liu, Y. -T., et al. Mt-Keima detects PINK1-PRKN mitophagy in vivo with greater sensitivity than mito-QC. Autophagy. 17 (11), 3753-3762 (2021).
  24. Shoshan-Barmatz, V., Shteinfer-Kuzmine, A., Verma, A. VDAC1 at the intersection of cell metabolism, apoptosis, and diseases. Biomolecules. 10 (11), 1485 (2020).
  25. Luk, K. C., et al. Pathological α-Synuclein transmission initiates parkinson-like neurodegeneration in nontransgenic mice. Science. 338 (6109), 949-953 (2012).
  26. Ryan, B. J., et al. REST protects dopaminergic neurons from mitochondrial and α-synuclein oligomer pathology in an alpha synuclein overexpressing BAC-transgenic mouse model. The Journal of Neuroscience. 41 (16), 3731-3746 (2021).
  27. Yamamoto, H., et al. Dual role of the receptor Tom20 in specificity and efficiency of protein import into mitochondria. Proceedings of the National Academy of Sciences. 108 (1), 91-96 (2011).
  28. Exner, N., Lutz, A. K., Haass, C., Winklhofer, K. F. Mitochondrial dysfunction in Parkinson's disease: molecular mechanisms and pathophysiological consequences. The EMBO Journal. 31 (14), 3038-3062 (2012).
  29. Grünewald, A., Kumar, K. R., Sue, C. M. New insights into the complex role of mitochondria in Parkinson's disease. Progress in Neurobiology. 177, 73-93 (2019).
  30. Baba, M., et al. Aggregation of alpha-synuclein in Lewy bodies of sporadic Parkinson's disease and dementia with Lewy bodies. The American journal of pathology. 152 (4), 879-884 (1998).
  31. Vázquez-Vélez, G. E., Zoghbi, H. Y. Parkinson's disease genetics and pathophysiology. Annual Review of Neuroscience. 44 (1), 87-108 (2021).
  32. Mahul-Mellier, A. -L., et al. The process of Lewy body formation, rather than simply α-synuclein fibrillization, is one of the major drivers of neurodegeneration. Proceedings of the National Academy of Sciences. 117 (9), 4971-4982 (2020).
  33. Ganguly, U., et al. Interaction of α-synuclein and Parkin in iron toxicity on SH-SY5Y cells: implications in the pathogenesis of Parkinson's disease. Biochemical Journal. 477 (6), 1109-1122 (2020).
  34. Ganjam, G. K., et al. Mitochondrial damage by α-synuclein causes cell death in human dopaminergic neurons. Cell Death & Disease. 10 (11), 865 (2019).
  35. Martin, L. J., et al. Parkinson's Disease α-synuclein transgenic mice develop neuronal mitochondrial degeneration and cell death. The Journal of Neuroscience. 26 (1), 41-50 (2006).
  36. Choubey, V., et al. Mutant A53T α-Synuclein induces neuronal death by increasing mitochondrial autophagy. Journal of Biological Chemistry. 286 (12), 10814-10824 (2011).
  37. Chen, L., Xie, Z., Turkson, S., Zhuang, X. A53T Human α-synuclein overexpression in transgenic mice induces pervasive mitochondria macroautophagy defects preceding dopamine neuron degeneration. The Journal of Neuroscience. 35 (3), 890-905 (2015).
  38. Kamp, F., et al. Inhibition of mitochondrial fusion by α-synuclein is rescued by PINK1, Parkin and DJ-1. The EMBO Journal. 29 (20), 3571-3589 (2010).
  39. Nakamura, K., et al. Direct membrane association drives mitochondrial fission by the parkinson disease-associated protein α-synuclein. Journal of Biological Chemistry. 286 (23), 20710-20726 (2011).
  40. Park, J., et al. Abnormal mitochondria in a non-human primate model of MPTP-induced Parkinson's disease: Drp1 and CDK5/p25 signaling. Experimental Neurobiology. 28 (3), 414-424 (2019).

Tags

Histologisk undersøkelse mitokondriell morfologi Parkinsons sykdomsmodell mitokondrier energimetabolisme nevroner mitokondriell dysfunksjon nevrologiske lidelser form og organisering av mitokondrienettverk immunfarging VDAC1-protein bildeanalyse nevrodegenerative lidelser ±-synucleinaggregater Parkinsons sykdomspatologi Substantia nigra pars compacta dopaminerge nevroner PS129-lesjoner mitokondriell fragmentering
Histologisk undersøkelse av mitokondriell morfologi i en modell for Parkinsons sykdom
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Ciceri, D., Gregorio-Zabala, L.,… More

Ciceri, D., Gregorio-Zabala, L., Llama-Pino, X., Kurt, B., Olano-Bringas, J., Villegas-Zafra, P., Bengoa-Vergniory, N. Histological Examination of Mitochondrial Morphology in a Parkinson's Disease Model. J. Vis. Exp. (196), e65453, doi:10.3791/65453 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter