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Developmental Biology

माउस अंडाणुओं में डीएनए डबल-फंसे ब्रेक का पता लगाना

Published: June 23, 2023 doi: 10.3791/65494
Automatic Translation
1,2, 1,2, 1, 1,2
1Department of Biological Applications and Technology, University of Ioannina, 2Biomedical Research Institute, Foundation for Research and Technology

Summary

परिणामी भ्रूण में आनुवंशिक निष्ठा सुनिश्चित करने के लिए अंडाणु जीनोम अखंडता को बनाए रखना आवश्यक है। यहां, हम स्तनधारी मादा रोगाणु कोशिकाओं में डीएनए डबल-स्ट्रैंड ब्रेक का पता लगाने के लिए एक सटीक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं।

Abstract

अंडाणु महिला शरीर में सबसे बड़ी और सबसे लंबे समय तक जीवित रहने वाली कोशिकाओं में से एक हैं। वे भ्रूण के विकास के दौरान अंडाशय में बनते हैं और अर्धसूत्रीविभाजन I के प्रोफ़ेज़ में गिरफ्तार रहते हैं। क्विसेंट अवस्था वर्षों तक रह सकती है जब तक कि अंडाणुओं को बढ़ने के लिए उत्तेजना प्राप्त नहीं होती है और अर्धसूत्रीविभाजन को फिर से शुरू करने की योग्यता प्राप्त नहीं होती है। गिरफ्तारी की यह लंबी स्थिति उन्हें डीएनए-हानिकारक अपमान जमा करने के लिए अतिसंवेदनशील बनाती है, जो महिला युग्मकों की आनुवंशिक अखंडता को प्रभावित करती है और इसलिए, भविष्य के भ्रूण की आनुवंशिक अखंडता।

नतीजतन, डीएनए क्षति का पता लगाने के लिए एक सटीक विधि का विकास, जो डीएनए क्षति प्रतिक्रिया तंत्र की स्थापना के लिए पहला कदम है, महत्वपूर्ण महत्व का है। यह पेपर 20 घंटे की अवधि के दौरान प्रोफेज-गिरफ्तार अंडाणुओं में डीएनए क्षति की उपस्थिति और प्रगति का परीक्षण करने के लिए एक सामान्य प्रोटोकॉल का वर्णन करता है। विशेष रूप से, हम माउस अंडाशय को विच्छेदित करते हैं, क्यूमुलस-ओसाइट कॉम्प्लेक्स (सीओसी) को पुनः प्राप्त करते हैं, सीओसी से क्यूमुलस कोशिकाओं को हटाते हैं, और गिरफ्तारी की स्थिति को बनाए रखने के लिए 3-आइसोब्यूटिल-1-मिथाइलक्सैंथिन युक्त μ2 माध्यम में अंडाणुओं को कल्चर करते हैं। इसके बाद, अंडाणुओं को साइटोटोक्सिक, एंटीनियोप्लाज्मिक दवा, एटोपोसाइड के साथ इलाज किया जाता है, ताकि डबल-स्ट्रैंड ब्रेक (डीएसबी) पैदा किया जा सके।

इम्यूनोफ्लोरेसेंस और कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी का उपयोग करके, हम कोर प्रोटीन के स्तर का पता लगाते हैं और मात्रा निर्धारित करते हैं, जो हिस्टोन एच 2 ए एक्स का फॉस्फोराइलेटेड रूप है। डीएनए क्षति के बाद डीएसबी की साइटों पर एच 2 ए एक्स फॉस्फोराइलेटेड हो जाता है। अंडाणुओं में डीएनए क्षति के बाद डीएनए अखंडता को बहाल करने में असमर्थता बांझपन, जन्म दोष और सहज गर्भपात की दर में वृद्धि का कारण बन सकती है। इसलिए, डीएनए क्षति प्रतिक्रिया तंत्र की समझ और, एक ही समय में, इन तंत्रों का अध्ययन करने के लिए एक बरकरार विधि की स्थापना प्रजनन जीव विज्ञान अनुसंधान के लिए आवश्यक है।

Introduction

स्तनधारी मादा रोगाणु कोशिकाओं में अर्धसूत्रीविभाजन की प्रक्रिया जन्म से पहले अंडाशय में शुरू की जाती है। अंडाणुओं की कुल संख्या मुख्य रूप से भ्रूणजनन के दौरान अंडाशय में स्थापित की जाती है। अंडाणु अर्धसूत्रीविभाजन में प्रवेश करते हैं और प्रोफ़ेज़ I1 पर गिरफ्तार रहते हैं। यौवन की शुरुआत और कूप-उत्तेजक हार्मोन (एफएसएच) और ल्यूटिनाइजिंग हार्मोन (एलएच) के उत्पादन और अंतःस्रावी क्रिया के बाद, अंडाणु फिर से शुरू हो सकते हैं और अर्धसूत्रीविभाजन2 को पूरा कर सकते हैं। मनुष्यों में, प्रोफ़ेज़ अरेस्ट 50साल तक रह सकता है। अर्धसूत्रीविभाजन I में प्रवेश के बाद कोशिका विभाजन असममित होते हैं, जिसके परिणामस्वरूप एक छोटे ध्रुवीय शरीर और एक अंडाणु का उत्पादन होता है जो अपने आकार को बरकरार रखता है। इस प्रकार, अधिकांश साइटोप्लाज्मिक घटक प्रारंभिक भ्रूणजनन4 के दौरान ओप्लाज्म में संग्रहीत होते हैं। फिर, अंडाणु अपने नाभिक में सुधार किए बिना या अपने गुणसूत्रों को विघटित किए बिना अर्धसूत्रीविभाजन II में प्रवेश करते हैं, और निषेचन5 तक मेटाफ़ेज़ II में गिरफ्तार रहते हैं।

एक अनूठी विशेषता जो दैहिक कोशिकाओं से अंडाणुओं को अलग करती है, वह है प्रोफ़ेज़ 1 में गिरफ्तारी की स्थिति, जब अंडाणु में एक बरकरार नाभिक (जर्मिनल पुटिका [जीवी] गिरफ्तारी) होती है, जिसे जीवी चरण6 कहा जाता है। क्रोमैटिन संगठन के आधार पर, जीवी-चरण अंडाणुओं को दो श्रेणियों में वर्गीकृत किया जाता है: गैर-घिरे न्यूक्लियोलस (एनएसएन) और घिरे हुए न्यूक्लियोलस (एसएन) 7,8। एनएसएन जीवी-स्टेज ओसाइट्स में, क्रोमैटिन पूरे परमाणु क्षेत्र में फैलता है, और प्रतिलेखन सक्रिय होता है, जबकि एसएन अंडाणुओं में, क्रोमैटिन एक कॉम्पैक्ट रिंग बनाता है जो न्यूक्लियोलस को घेरता है, और प्रतिलेखन मौनहोता है। दोनों प्रकार के जीवी-चरण अंडाणु मियोटिक क्षमता दिखाते हैं; वे एक ही दर पर अर्धसूत्रीविभाजन में प्रवेश करते हैं, लेकिन एनएसएन अंडाणु कम विकास क्षमता पेश करते हैं और दो-कोशिका चरण भ्रूण10 से आगे विकसित नहीं हो सकते हैं।

प्रोफेज़ 1 गिरफ्तारी की लंबी स्थिति डीएनए क्षति संचय की घटनाओं को बढ़ातीहै। इसलिए, अंडाणुओं में डीएनए क्षति प्रतिक्रिया तंत्र आनुवंशिक अखंडता के साथ युग्मकों के उत्पादन की अनुमति देने और यह सुनिश्चित करने के लिए आवश्यक है कि परिणामस्वरूप भ्रूण में शारीरिक गुणसूत्र सामग्री है।

डीएनए क्षति प्रतिक्रिया का एक केंद्रीय पहलू डीएनए की मरम्मत है। यूकेरियोटिक कोशिकाओं में डीएसबी मरम्मत के लिए मुख्य मार्गों में गैर-समरूप अंत शामिल होना (एनएचईजे), समरूप पुनर्संयोजन (एचआर), और वैकल्पिक एनएचईजे12,13,14,15 शामिल हैं। NHEJ एक तेज लेकिन अधिक त्रुटि-प्रवण तंत्र है, जबकि HR को पूरा करने के लिए अधिक समय की आवश्यकता होती है लेकिन इसमें उच्च निष्ठा16 है।

डीएनए क्षति की मरम्मत के लिए अंडाणुओं द्वारा उपयोग किए जाने वाले तंत्र के बारे में पर्याप्त ज्ञान नहीं है। अध्ययनों से पता चला है कि जीनोटॉक्सिक एजेंटों, जैसे कि एटोपोसाइड, डॉक्सोर्यूबिसिन, या यूवीबी या आयनकारी विकिरण के उपयोग से पूरी तरह से विकसित स्तनधारी अंडाणुओं में प्रेरित डीएनए क्षति, प्रोफेज 1 गिरफ्तारी17 से बाहर निकलने के समय और दरों को प्रभावित नहीं करती है। क्षति के ऊंचे स्तर की उपस्थिति में भी अंडाणु जीवी ब्रेकडाउन (जीवीबीडी) से गुजर सकते हैं। इस क्षति को 3H2AX के अवलोकन द्वारा निर्धारित किया जा सकता है। H2AX का यह फॉस्फोराइलेटेड रूप एक DSB मार्कर है, जो टूटने की जगह पर स्थित है और टूटेहुए सिरों पर जमा होने वाले कारकों और प्रोटीन की मरम्मत में मदद करने के लिए एक मचान के रूप में कार्य करता है।

डीएनए क्षति के बाद सेल चक्र गिरफ्तारी की अनुपस्थिति एक अपर्याप्त डीएनए क्षति चेकपॉइंट के कारण होती है जो बिना मरम्मत वाले डीएनए के साथ अंडाणुओं को फिर से अर्धसूत्रीविभाजन में प्रवेश करने की अनुमति देती है। डीएनए क्षति के उच्च स्तर के बाद, एक चेकपॉइंट एटीएम / सीएचके 1-निर्भर मार्ग के सक्रियण के माध्यम से प्रोफ़ेज़ गिरफ्तारी को बनाए रख सकता है। डीएसबी के लिए सीमित चेकपॉइंट प्रतिक्रिया एटीएम17,19 के सीमित सक्रियण के कारण है। अर्धसूत्रीविभाजन I के एम-चरण में, अनुसंधान से पता चला है कि डीएनए क्षति एक स्पिंडल असेंबली चेकपॉइंट (एसएसी) -प्रेरित अर्धसूत्रीविभाजन आई चेकपॉइंट को सक्रिय कर सकती है, जो ई 3 यूबिकिटिन लिगेज एनाफेज-प्रमोटिंग कॉम्प्लेक्स / साइक्लोसोम (एपीसी / सी) के सक्रियण को रोकती है और इसलिए, एम-चरण निकास। इसके अलावा, एसएसी प्रोटीन का पृथक्करण एम-चरण गिरफ्तारी की स्थिति को दूर करता है, इस प्रकार अर्धसूत्रीविभाजन आई चेकपॉइंट20 की स्थापना में एसएसी के महत्व को रेखांकित करता है।

जैसा कि पिछले शोध से स्पष्ट रूप से पता चलता है, डीएसबी माउस अंडाणुओं में एक मजबूत प्रोफ़ेज़ चेकपॉइंट को प्रेरित नहीं कर सकते हैं। यदि इस तरह की क्षति को बिना मरम्मत के छोड़ दिया जाता है, तो इससे क्रोमोसोमल असामान्यताएं ले जाने वाले भ्रूण हो सकते हैं। इसलिए, मादा गैमेटोजेनेसिस के विभिन्न चरणों में डीएनए क्षति प्रतिक्रिया का अध्ययन करना महत्वपूर्ण है ताकि उन अद्वितीय मार्गों को बेहतर ढंग से समझा जा सके जो अंडाणु संभावित आनुवंशिक अपमान से निपटने के लिए उपयोग करते हैं।

Protocol

सभी चूहों के प्रयोगों को स्थानीय अधिकारियों (आयोनिना, ग्रीस के क्षेत्र) द्वारा अनुमोदित किया गया था और यूरोपीय समुदाय परिषद के निर्देशों 2010/63 / यूरोपीय संघ के अनुसार आयोजित किया गया था। 3आर के सिद्धांतों के संबंध में प्रयोग किए गए थे। प्रयोगों के लिए उपयोग किए गए सभी सीडी -1 चूहों को नियंत्रित तापमान (22 डिग्री सेल्सियस) और आर्द्रता (60%) वाले कमरे में ग्रीस के आयोनिना विश्वविद्यालय के पशु घर सुविधा में रखा गया था और उन्हें एड लिबिटम खिलाया गया था। पशु घर के पास प्रजनन (EL33-BIObr01), आपूर्ति (EL33-BIOsup01), और प्रयोगों (EL33BIO-exp01) के लिए एक सुविधा संचालित करने का लाइसेंस है।

1. अभिकर्मकों की तैयारी

  1. डाइमिथाइल सल्फोक्साइड (डीएमएसओ) (सामग्री की तालिका देखें) में 200 एमएम की अंतिम एकाग्रता के लिए 3-आइसोब्यूटिल-1-मिथाइलक्सैंथिन (आईबीएमएक्स) पाउडर (सामग्री की तालिका देखें) को पतला करें। μake 10 μL एलिकोट, और -20 °C पर स्टोर करें। 1 महीने के भीतर समाधान का उपयोग करें।
    नोट: आईबीएमएक्स पाउडर -20 डिग्री सेल्सियस पर रखा जाता है।
  2. सभी इम्यूनोफ्लोरेसेंस बफर तैयार करें, और उन्हें 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
    1. एक पीबीएस टैबलेट ( सामग्री की तालिका देखें) को 200 एमएल डीडीएच2में पतला करके बाँझ फॉस्फेट-बफर्ड सेलाइन (पीबीएस) तैयार करें।
    2. चुंबकीय हलचल (सामग्री तालिका देखें) के साथ आंदोलन करते हुए 80 मिलीलीटर डीडीएच 2 डिग्री, 0.59575 ग्राम एचईपीईएस, 1.81422 ग्राम पाइप, 0.38035 ग्राम ईजीटीए, और 0.04066 ग्राम एमजीसीएल2 (सामग्री की तालिका देखें) जोड़कर पीएचईएम बफर बनाएं, और साथ ही साथ एनएओएच (सामग्री की तालिका देखें) जोड़ें। फिर, 100 एमएल की अंतिम मात्रा में डीडीएच2को जोड़ें।
    3. 4% पीएफए की अंतिम सांद्रता पर हीटिंग के तहत चुंबकीय हलचल के साथ आंदोलन करते हुए पीएचईएम बफर में पीएफए पाउडर (सामग्री की तालिका देखें) को पतला करके पैराफॉर्मलडिहाइड-ट्राइटन-एक्स -100 (पीएफए-टीएक्स -100) बफर तैयार करें। फिर, एक सिरिंज और 0.2 μm फ़िल्टर (सामग्री की तालिका देखें) का उपयोग करके बफर को फ़िल्टर करें, और 0.5% Tx-100 जोड़ें (सामग्री की तालिका देखें)। पीएफए-टीएक्स -100 के लगभग 10 एमएल (पीएफए के 0.4 ग्राम, टीएक्स -100 के 50 μL) तैयार करें, जो एक प्रयोग के लिए पर्याप्त है। इसे अधिकतम 1 सप्ताह के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
      सावधानी: पीएफए को संभालने के लिए दस्ताने पहनें, और त्वचा और आंखों के संपर्क से बचें।
    4. पीबीएस में गोजातीय सीरम एल्बुमिन (अंतिम एकाग्रता: 0.5% डब्ल्यू / वी बीएसए) (सामग्री की तालिका देखें) जोड़कर वॉशिंग बफर तैयार करें, और यांत्रिक रूप से आंदोलन करें। फंगल और बैक्टीरियल संदूषण के जोखिम को कम करने के लिए 1: 1,000 कमजोर पड़ने पर 10% डब्ल्यू / वी एनएएन3 बफर (सोडियम एजाइड) जोड़ें। 10 एमएल डीडीएच2ओ में 1 ग्राम एनएएन 3 पाउडर (सामग्री की तालिका देखें) जोड़कर 10% डब्ल्यू / वी एनएएन3 बफर बनाएं; कमरे के तापमान पर एनएएन3 बफर स्टोर करें।
    5. पीबीएस में बीएसए (अंतिम एकाग्रता: 3% डब्ल्यू / वी) जोड़कर और यांत्रिक रूप से आंदोलन करके ब्लॉकिंग बफर तैयार करें। 1: 1,000 कमजोर पड़ने पर 10% एनएएन3 बफर जोड़ें।

2. विच्छेदित अंडाशय से जीवी अंडाणुओं का संग्रह और डीएसबी का प्रेरण

नोट: सभी उपकरण और समाधान बाँझ होना चाहिए। अंडाणु हैंडलिंग एक स्टीरियो माइक्रोस्कोप के तहत एक मुंह के पिपेट का उपयोग करके आयोजित की जाती है (सामग्री की तालिका देखें), और सभी बूंदों को खनिज तेल के साथ कवर किया जाता है (सामग्री की तालिका और चित्रा 1 ई देखें)।

  1. गर्भाशय ग्रीवा अव्यवस्था द्वारा चूहों को मारने से पहले 46-48 घंटे में गर्भवती घोड़ी के सीरम गोनाडोट्रोपिन (पीएमएसजी) की 7 अंतरराष्ट्रीय इकाइयों (आईयू) के साथ चूहों को इंट्रापरिटोनियल रूप से इंजेक्ट करें।
    नोट: उपयोग किए गए सभी चूहों को 8-12 सप्ताह का होना चाहिए।
  2. एक सिरिंज और 0.2 μm फ़िल्टर के साथ M2 कल्चर माध्यम (सामग्री की तालिका देखें) फ़िल्टर करें, और IBMX 200 mM को 14 mL राउंड-बॉटम ट्यूब (सामग्री की तालिका देखें) में अंतिम एकाग्रता 200 μM में जोड़ें ताकि अंडाणुओं को प्रोफ़ेज़ I में गिरफ्तार रखा जा सके। फिर, एक प्लास्टिक टिशू कल्चर डिश (सामग्री की तालिका देखें) में एम 2-आईबीएमएक्स माध्यम की बूंदें तैयार करें, और इसे अंडाणु अलगाव से पहले कम से कम 30 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर एक गर्म ब्लॉक (सामग्री की तालिका देखें) पर रखें। M2 को 4 °C पर स्टोर करें।
  3. गर्भाशय ग्रीवा अव्यवस्था द्वारा चूहों का बलिदान करें, अंडाशय को विच्छेदित करें, और उन्हें एम 2-आईबीएमएक्स के साथ 5 एमएल गोल-नीचे ट्यूब ( सामग्री की तालिका देखें) में रखें।
  4. अंडाशय को 1.5 मिलीलीटर एम 2-आईबीएमएक्स युक्त प्लास्टिक के ढक्कन में स्थानांतरित करें, किसी भी पेरी-डिम्बग्रंथि वसा ऊतक या फैलोपियन ट्यूब खंडों को हटा दें, और 27 ग्राम सुई के साथ अंडाशय के यांत्रिक छिद्र द्वारा सीओसी को छोड़ दें (सामग्री की तालिका और चित्रा 1 ए-सी देखें)।
  5. सीओसी को एम 2-आईबीएमएक्स (लगभग 25-30 μL प्रत्येक) की बूंदों के साथ एक कल्चर डिश में स्थानांतरित करें, और एक संकीर्ण-बोर ग्लास पाश्चर पिपेट का उपयोग करके बार-बार पाइपिंग करके क्यूमुलस कोशिकाओं को हटा दें ( सामग्री की तालिका और चित्रा 1 डी देखें)।
  6. एसएन जीवी-चरण अंडाणुओं का चयन करें, और उन्हें प्रकाश से सुरक्षित 37 डिग्री सेल्सियस पर गर्म ब्लॉक पर एम 2-आईबीएमएक्स माध्यम की एक बूंद (25 μL) में स्थानांतरित करें (चित्रा 1 एफ)।
    1. एसएन अंडाणुओं के विपरीत उनके बड़े आकार और केंद्रीय रूप से रखे गए नाभिक के आधार पर एसएन अंडाणुओं की तलाश करें, जिसमें नाभिक परिधीय रूप से21 स्थित होते हैं। किसी भी मामले में, जीवी अंडाणु (एसएन या एनएसएन) के प्रकार के बारे में अंतिम निर्णय लेने से पहले एक कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप के तहत डीएनए कॉन्फ़िगरेशन का निरीक्षण करें।
  7. ईटोपोसाइड का उपयोग करके डीएसबी को प्रेरित करें ( सामग्री की तालिका देखें)। अंधेरे परिस्थितियों में 37 डिग्री सेल्सियस पर गर्म ब्लॉक पर 1 घंटे के लिए जीनोटॉक्सिक एजेंट की बूंदों (25 μL प्रत्येक) में जीवी-चरण अंडाणुओं को रखें।
    नोट: एटोपोसाइड एक टोपोइसोमेरेस द्वितीय अवरोधक है जो डीएसबी को डीएनए22 में पेश करता है। प्रकाश से सुरक्षित कमरे के तापमान पर 20 मिलीग्राम / एमएल के 10 μL एलिकोट में एटोपोसाइड रखें। परीक्षण किए गए सांद्रता 5 μg / mL, 20 μg / mL, और 50 μg / mL हैं।
  8. जीवी-स्टेज अंडाणुओं को लंबे समय तक रोककर रखने के लिए, अंडाणुओं को एम 16 कल्चर माध्यम (सामग्री की तालिका देखें) की बूंदों में एक इनक्यूबेटर (सामग्री की तालिका देखें) में 37 डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ 2 पर 400 μM IBMX के साथ पूरक रखें। एम 16 को 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें, माध्यम को सिरिंज और 0.2 μm फ़िल्टर के साथ फ़िल्टर करें, और उपयोग करने से पहले इसे कम से कम 1 घंटे के लिए इनक्यूबेट करें।

Figure 1
चित्र 1: अंडाणु अलगाव प्रक्रिया । (ए) आईबीएमएक्स के साथ एम 2 माध्यम में अंडाशय से पेरी-डिम्बग्रंथि वसा ऊतक और बचे हुए फैलोपियन ट्यूब खंडों को हटाना। स्टीरियो माइक्रोस्कोप आईपीस के माध्यम से प्राप्त तस्वीर। स्केल बार = 1 मिमी (बी) आईबीएमएक्स के साथ एम 2 माध्यम में पृथक अंडाशय। स्टीरियो माइक्रोस्कोप आईपीस के माध्यम से प्राप्त छवि। स्केल बार = 1 मिमी (सी) आईबीएमएक्स के साथ एम 2 माध्यम में 27 ग्राम सुई का उपयोग करके अंडाशय का यांत्रिक छिद्र। स्टीरियो माइक्रोस्कोप आईपीस के माध्यम से प्राप्त छवि। स्केल बार = 1 मिमी (डी) आईबीएमएक्स के साथ एम 2 माध्यम में छिद्र के बाद अंडाशय से जारी सीओसी। स्टीरियो माइक्रोस्कोप आईपीस के माध्यम से प्राप्त छवि। स्केल बार = 100 μm. (E) मुंह के पिपेट का उपयोग करके अंडाणु संग्रह। (एफ) आईबीएमएक्स के साथ एम 2 माध्यम में आसपास के क्यूमुलस कोशिकाओं को हटाने के बाद डिन्यूडेड अंडाणु। स्टीरियो माइक्रोस्कोप आईपीस के माध्यम से प्राप्त छवि। स्केल बार = 100 μm. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

3. अंडाणु निर्धारण और इम्यूनोफ्लोरेसेंस

नोट: अंडाणु से निपटने का संचालन स्टीरियो माइक्रोस्कोप के तहत एक मुंह के पाइप का उपयोग करके किया जाता है, और सभी बूंदों को खनिज तेल से कवर किया जाता है।

  1. कमरे के तापमान पर 40 मिनट के लिए पीएफए-टीएक्स -100 बफर के साथ विभिन्न प्लास्टिक टिशू कल्चर व्यंजनों में नियंत्रण और एटोपोसाइड-उपचारित जीवी अंडाणुओं को रखें।
  2. कमरे के तापमान पर वाशिंग बफर (50 μL प्रत्येक) की तीन अलग-अलग बूंदों में अंडाणुओं को धोएं। प्रत्येक बूंद में अंडाणुओं को 5 मिनट के लिए छोड़ दें।
  3. अंडाणुओं को 37 डिग्री सेल्सियस पर गर्म ब्लॉक पर 1 घंटे के लिए ब्लॉकिंग बफर (25 μL प्रत्येक) की बूंदों में रखें।
  4. प्राथमिक एंटीबॉडी तैयार करें जो कि H2AX (खरगोश फॉस्फो-2A) (Ser139) ( सामग्री की तालिका देखें) (स्टॉक समाधान: 1 मिलीग्राम / एमएल) को पहचानता है। बफर को अवरुद्ध करने में 1: 200 कमजोर पड़ने का उपयोग करें, और रात भर 4 डिग्री सेल्सियस पर प्राथमिक एंटीबॉडी (15 μL प्रत्येक) की बूंदों में अंडाणुओं को रखें।
    नोट: फॉस्फो-2 ए एक्स ( 3 एच 2 ए एक्स) दैहिक कोशिकाओं और जीवीअंडाणुओं 18,23 दोनों में डीएसबी का पता लगाने के लिए एक सामान्य मार्कर है।
  5. अगले दिन, कमरे के तापमान पर वॉशिंग बफर (50 μL प्रत्येक) की तीन अलग-अलग बूंदों में अंडाणुओं को धोएं। प्रत्येक बूंद में अंडाणुओं को 5 मिनट के लिए छोड़ दें।
  6. द्वितीयक एंटीबॉडी, एलेक्सा फ्लुर 488-संयुग्मित बकरी विरोधी खरगोश ( सामग्री की तालिका देखें) (स्टॉक समाधान: 2 मिलीग्राम / एमएल) तैयार करें। बफर को अवरुद्ध करने में 1:200 कमजोर पड़ने का उपयोग करें, और प्रकाश से सुरक्षित 37 डिग्री सेल्सियस पर गर्म ब्लॉक पर 1 घंटे के लिए द्वितीयक एंटीबॉडी (15 μL प्रत्येक) की बूंदों में अंडाणुओं को रखें।
  7. अंडाणुओं को डीआरएक्यू 7 (25 μL प्रत्येक) (स्टॉक समाधान: 0.3 mM; सामग्री की तालिका देखें) की बूंदों में स्थानांतरित करें, जो एक दूर-लाल फ्लोरोसेंट डीएनए डाई है जो केवल परमेबिलाइज्ड कोशिकाओं में डीएनए पर दाग लगाता है। अंधेरे परिस्थितियों में कमरे के तापमान पर 10 मिनट के लिए वॉशिंग बफर में 1:250 तनुकरण का उपयोग करें।
  8. कमरे के तापमान पर वाशिंग बफर (50 μL प्रत्येक) की तीन अलग-अलग बूंदों में अंडाणुओं को धोएं। उन्हें प्रत्येक बूंद में 5 मिनट के लिए छोड़ दें, और फिर उन्हें कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी (चित्रा 2 ए) के लिए 35 मिमी ग्लास-बॉटम पेट्री डिश (सामग्री की तालिका देखें) में वॉशिंग बफर की छोटी बूंदों (लगभग 5 μL प्रत्येक) में स्थानांतरित करें।
    नोट: डीएनए दाग और द्वितीयक एंटीबॉडी दोनों की धुलाई एक ही समय में की जाती है।

4. कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी

नोट: कांच-तल के व्यंजनों में अंडाणुओं के प्लेसमेंट के बाद प्रतिदीप्ति तीव्रता में कमी से बचने के लिए कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी तुरंत की जानी चाहिए। मोटरचालित चरण के साथ एक कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप ( सामग्री की तालिका देखें) तक पहुंच की आवश्यकता होती है।

  1. माइक्रोस्कोप सेटअप
    1. कॉन्फोकल सिस्टम में, लेजर नियंत्रक, लेजर, माइक्रोस्कोप नियंत्रक, प्रेषित प्रकाश के लिए लैंप और पीसी (चित्रा 2 बी, डी) पर स्विच करें।
    2. कॉन्फोकल सॉफ्टवेयर खोलें, और 40x तेल लेंस चुनें।
    3. पकवान को नमूना धारक में रखें, और जॉयस्टिक (चित्रा 2 सी) का उपयोग करके एक्सवाई और जेड अक्षों पर मंच को स्थानांतरित करके अंडाणुओं पर ध्यान केंद्रित करने का प्रयास करें।
  2. अंडाणुओं की स्कैनिंग
    1. किसी भी संतृप्ति को कम करने के लिए प्रत्येक प्रयोग के लिए लेजर शक्ति, लाभ और पिनहोल आकार को स्वतंत्र रूप से सेट करें।
    2. प्रत्येक अंडाणु के लिए, रुचि का क्षेत्र निर्धारित करें, विशेष रूप से डीएनए क्षेत्र में नाभिक में। डीएनए क्षेत्र की सीमाओं को परिभाषित करें, और जेड चरण आकार को 3 μm में समायोजित करें। फिर, स्कैनिंग शुरू करें।
    3. चयनित फ़ोल्डर में प्रत्येक कक्ष के लिए छवियाँ सहेजें.
    4. जब स्कैनिंग पूरी हो जाती है, तो सॉफ़्टवेयर से बाहर निकलें, कंप्यूटर को बंद करें, और प्रेषित प्रकाश के लिए लेजर नियंत्रक, लेजर, माइक्रोस्कोप नियंत्रक और लैंप बंद करें।

Figure 2
चित्रा 2: कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी। (ए) इम्यूनोफ्लोरेसेंस प्रोटोकॉल और डीएनए धुंधला करने के बाद अंडाणुओं को स्थिर किया जाता है, जो वॉशिंग बफर की अलग-अलग बूंदों में होते हैं, खनिज तेल से ढके होते हैं, ग्लास-बॉटम डिश में रखे जाते हैं, और कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी इमेजिंग के लिए तैयार किए जाते हैं। प्रत्येक बूंद में एक अलग प्रयोगात्मक श्रेणी होती है। स्टीरियो माइक्रोस्कोप आईपीस के माध्यम से प्राप्त छवि। स्केल बार = ज़ूम-इन भाग के लिए 1 मिमी / 100 μm। (बी) कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप स्टेज पर रखी गई ग्लास-बॉटम प्लेट। (सी) कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी के माध्यम से प्राप्त अंडाणुओं की ब्राइटफील्ड छवि। स्केल बार = 100 μm. (D) कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी सिस्टम। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

5. इमेजिंग विश्लेषण

  1. ब्राउज़र (https://imagej.net/software/fiji/downloads) में फिजी इमेजजे-विन 64 डाउनलोड करें, इसे खोलें, और डेटा को टीआईएफएफ स्टैक फ़ाइलों के रूप में आयात करें।
    नोट: प्रत्येक अंडाणु फ़ाइल को अलग से खोलें।
  2. छवि पर क्लिक करें | रंग | सभी चैनलों को विभाजित करने के लिए चैनलों को विभाजित करें।
  3. एलयूटी (लुक अप टेबल) पर क्लिक करें, और प्रत्येक चैनल के लिए पसंदीदा रंग चुनें।
  4. छवि पर क्लिक करें | रंग | चैनलों को मर्ज करें चैनलों को 322 और DNA के लिए मर्ज करें। ब्राइटफील्ड चैनल को अमर्ज छोड़ दें।
  5. एनएसएन अंडाणुओं में और डीएनए क्षति के निम्न स्तर वाले एसएन अंडाणुओं में, डीएनए क्षेत्र में फॉसी के रूप में इसका पता लगाया जाता है। इस मामले में, " मल्टी-पॉइंट" या पॉइंट कमांड पर क्लिक करें, और डीएनए के साथ मेल खाने वाले प्रत्येक फोकस का चयन करें। सभी ढेर के लिए इस चरण को दोहराएं।
  6. डीएनए क्षति के उच्च स्तर के साथ एसएन अंडाणुओं में, पूरे डीएनए क्षेत्र में 322 संकेत वितरित किया जाता है। इस मामले में, छवि पर क्लिक करें | ढेर | जेड प्रोजेक्ट, और फ्रीहैंड चयन कमांड के साथ, पूरे डीएनए क्षेत्र का चयन करें।
  7. प्रतिदीप्ति को मापने के लिए, विश्लेषण पर क्लिक करें | मापन करें, और माप को .xlsx फ़ाइल में कॉपी करें। फिर, औसत प्रतिदीप्ति की गणना करें, मूल्यों को सामान्य करें, और किसी भी ग्राफ़ को बनाने से पहले फॉसी की संख्या की गणना करें।
  8. विश्लेषण पर क्लिक करें | स्केल सेट करने के लिए स्केल सेट करें और फिर विश्लेषण करें | उपकरण | चैनलों में स्केल बार जोड़ने के लिए स्केल बार.

Representative Results

यहां प्रदर्शित प्रक्रिया का उपयोग करके, माउस अंडाशय को विच्छेदित किया गया, वसा को हटा दिया गया, और पूरी तरह से विकसित जीवी-चरण अंडाणुओं को एकत्र किया गया। फिर, क्यूमुलस कोशिकाओं को एक संकीर्ण पिपेट का उपयोग करके दोहराए जाने वाले पाइपिंग द्वारा हटा दिया गया था और एम 2-आईबीएमएक्स माध्यम की ताजा बूंदों में रखा गया था और एक गर्म ब्लॉक (37 डिग्री सेल्सियस) पर खनिज तेल के साथ कवर किया गया था (चित्रा 1 ए-एफ)। तीन अलग-अलग एटोपोसाइड सांद्रता तैयार की गई (5 μg / mL, 20 μg / mL, और 50 μg / mL) 20 mg / mL की स्टॉक एटोपोसाइड एकाग्रता का उपयोग करके। जीवी-स्टेज अंडाणुओं को खनिज तेल से ढकी बूंदों में 1 घंटे के लिए तीन अलग-अलग एटोपोसाइड सांद्रता में रखा गया था और 37 डिग्री सेल्सियस पर प्रकाश से संरक्षित किया गया था। इम्यूनोफ्लोरेसेंस प्रोटोकॉल का पालन किया गया था, जैसा कि प्रोटोकॉल अनुभाग में विस्तार से वर्णित है, और अंडाणुओं को ग्लास-बॉटम व्यंजनों में रखा गया था और कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी (चित्रा 2) द्वारा देखा गया था।

एसएन जीवी-चरण अंडाणुओं में, डीएनए क्षति के तुरंत बाद, सभी एटोपोसाइड सांद्रता (5 μg / mL, 20 μg / mL, और 50 μg / mL) पर 3H2AX की उपस्थिति बढ़ गई, और पूरे डीएनए क्षेत्र में 3H2AX वितरित किया गया (चित्रा 3)। डीएसबी परिमाणीकरण और आकलन डीएनए साइटों पर 3एच 2 ए एक्स प्रतिदीप्ति तीव्रता का अवलोकन करके किया गया था। एटोपोसाइड सांद्रता बढ़ने के साथ आनुपातिक रूप से एच2एएक्स प्रतिदीप्ति तेज हो गई। इसके अलावा, लंबे समय तक प्रोफ़ेज़ अरेस्ट (एटोपोसाइड उपचार के 20 घंटे बाद) के बाद, जीवी-स्टेज अंडाणुओं ने ओएच2एएक्स फॉसी संख्या और तीव्रता को कम करने की क्षमता दिखाई, जिसका अर्थ है जीवी-चरण-गिरफ्तार अंडाणुओं में सक्रिय मरम्मत प्रक्रियाओं की उपस्थिति (चित्रा 3 ई)।

एसएन अंडाणुओं के विपरीत, जिसमें डीएनए के माध्यम से 3H2AX प्रतिदीप्ति वितरित की गई थी, NSN अंडाणुओं में, 20 μg / mL पर etoposide के साथ उपचार के तुरंत बाद 4H2AX को फॉसी में दिखाया गया था। हमने डीएनए क्षेत्र के साथ मेल खाने वाले फॉसी की संख्या का अनुमान लगाया, हर फोकस की प्रतिदीप्ति की गणना की, और सभी अंडाणुओं की औसत प्रतिदीप्ति प्रस्तुत की। फ्लोरेसेंस और फॉसी की संख्या दोनों ने दो अंडाणु श्रेणियों (चित्रा 4) के बीच सांख्यिकीय रूप से महत्वपूर्ण अंतर दिखाया।

कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी विभिन्न जेड स्टैक्स में फॉसी की संख्या और तीव्रता पर जानकारी प्रदान करती है, इस प्रकार डीएनए क्षति की उपस्थिति और अलग-अलग समय बिंदुओं पर मरम्मत की गतिशीलता की पहचान करने में मदद करती है। गैल्वानो स्कैनिंग कम पृष्ठभूमि और स्कैनिंग छवियों के बेहतर विश्लेषण के साथ सटीक स्कैनिंग प्रदान करता है।

Figure 3
चित्रा 3: लंबे जीवी गिरफ्तारी के बाद तीन अलग-अलग एटोपोसाइड सांद्रता के साथ इलाज किए गए एसएन जीवी-स्टेज अंडाणुओं में 3एच2एएक्स की कमी। (ए) एटोपोसाइड उपचार के बाद 0 घंटे बाद एसएन जीवी-स्टेज अंडाणुओं में एच 2 ए एक्स प्रतिदीप्ति। सभी एटोपोसाइड सांद्रता पर एक्सपोजर के तुरंत बाद 3H2AX बढ़ जाता है, और वृद्धि एकाग्रता-निर्भर होती है (हरा: हरा: 22A, मैजेंटा: डीएनए)। छवियां जेड-स्टैक प्रोजेक्शन हैं, और फिजी / इमेजजे का उपयोग करके प्रत्येक चैनल के लिए चमक / कंट्रास्ट समायोजित किया गया है। स्केल बार = 10 μm. (B) अलग-अलग एटोपोसाइड सांद्रता के साथ उपचार के बाद SN GV-चरण अंडाणुओं में 0 घंटे में 3H2AX प्रतिदीप्ति का ग्राफ। डेटा एसईएम ± माध्य का प्रतिनिधित्व करता है। प्रत्येक बिंदु एक अंडाणु का प्रतिनिधित्व करता है (अंडाणुओं की संख्या ग्राफ में दिखाई गई है), (एनएस = गैर-महत्वपूर्ण, * * पी < 0.005, **** पी < 0.0001, टकी के कई तुलना परीक्षण के साथ एक-तरफा एनोवा)। (सी) एटोपोसाइड उपचार के 20 घंटे बाद एसएन जीवी-स्टेज अंडाणुओं में एच 2 ए एक्स प्रतिदीप्ति। सभी एटोपोसाइड सांद्रता पर एक्सपोजर के बाद 20 घंटे कम हो जाता है (हरा: हरा: 2 ए, मैजेंटा: डीएनए)। छवियां जेड-स्टैक अनुमान हैं, और फिजी / इमेजजे का उपयोग करके प्रत्येक चैनल के लिए चमक / कंट्रास्ट समायोजित किया गया है। स्केल बार = 10 μm. (D) अलग-अलग एटोपोसाइड सांद्रता के साथ उपचार के 20 घंटे बाद SN GV-स्टेज अंडाणुओं में 3H2AX प्रतिदीप्ति का ग्राफ। डेटा एसईएम ± माध्य का प्रतिनिधित्व करता है। प्रत्येक बिंदु एक अंडाणु का प्रतिनिधित्व करता है (अंडाणुओं की संख्या ग्राफ में दिखाई गई है), (एनएस = गैर-महत्वपूर्ण, * पी < 0.05, ** पी < 0.005, *** पी < 0.0005, **** पी < 0.0001, टकी के कई तुलना परीक्षण के साथ वन-वे एनोवा)।  (ई) एटोपोसाइड-उपचारित अंडाणुओं में प्रोफेज ़ अरेस्ट के बाद एसएन जीवी-स्टेज अंडाणुओं में 3एच2एएक्स प्रतिदीप्ति कमी का बार ग्राफ। प्रत्येक स्तंभ के ऊपर की संख्या 3H2AX प्रतिदीप्ति में प्रतिशत गिरावट को इंगित करती है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 4
चित्र 4: 20 μg /mL पर एटोपोसाइड के साथ उपचार के बाद NSN GV-चरण अंडाणुओं में Η2A3 का फास्फारिलीकरण। (ए) एक नियंत्रण एनएसएन जीवी-स्टेज अंडाणु की प्रतिनिधि कॉन्फोकल छवियां (हरा: 32ए, मैजेंटा: डीएनए)। छवियां जेड-स्टैक अनुमान हैं, और फिजी / इमेजजे का उपयोग करके प्रत्येक चैनल के लिए चमक / कंट्रास्ट समायोजित किया गया है। स्केल बार = 10 μm. (B) एक एटोपोसाइड-उपचारित NSN GV-स्टेज अंडाणु की प्रतिनिधि कॉन्फोकल छवियां (हरा: 323, magenta: DNA)। एटोपोसाइड उपचार के बाद अंडाणुओं को 0 घंटे के लिए तय किया गया था। छवियां जेड-स्टैक अनुमान हैं, और फिजी / इमेजजे का उपयोग करके प्रत्येक चैनल के लिए चमक / कंट्रास्ट समायोजित किया गया है। स्केल बार = 10 μm. (C) 20 μg/mL etoposide उपचार के बाद NSN GV-चरण अंडाणुओं में सामान्यीकृत प्रतिदीप्ति डेटा एसईएम ± माध्य का प्रतिनिधित्व करता है। प्रत्येक बिंदु एक अंडाणु का प्रतिनिधित्व करता है (अंडाणुओं की संख्या ग्राफ में दिखाई गई है), जो दो स्वतंत्र प्रयोगों (*** पी < 0.0001, अप्रकाशित गैर-पैरामीट्रिक टी-टेस्ट, मैन-व्हिटनी यू-टेस्ट) से लिया गया है। (डी) 20 μg/mL etoposide उपचार के बाद NSN GV-स्टेज अंडाणुओं में 40000 00000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000 डेटा एसईएम ± माध्य का प्रतिनिधित्व करता है। प्रत्येक बिंदु एक अंडाणु का प्रतिनिधित्व करता है (अंडाणुओं की संख्या ग्राफ में दिखाई गई है), जो दो स्वतंत्र प्रयोगों (*** पी < 0.0001, अप्रकाशित गैर-पैरामीट्रिक टी-टेस्ट, मैन-व्हिटनी यू-टेस्ट) से लिया गया है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Discussion

यहां वर्णित विधि का उपयोग करके, हमने स्तनधारी अंडाणुओं में डीएसबी का पता लगाया। यह विधि अंडाणुओं में डीएनए मरम्मत प्रक्रिया का पता लगाने और अध्ययन करने की अनुमति देती है। इसी प्रोटोकॉल का उपयोग अन्य प्रोटीनों का विश्लेषण करने के लिए भी किया जा सकता है जो स्तनधारी अंडाणुओं में शारीरिक प्रक्रियाओं में भाग लेते हैं। यह अध्ययन करना महत्वपूर्ण है कि मनुष्यों में महिला उप-प्रजनन क्षमता के कारण को बेहतर ढंग से समझने के लिए अंडाणु संभावित डीएनए क्षति का जवाब कैसे देते हैं।

अंडाणुओं की संवेदनशीलता के कारण स्तनधारी अंडाणुओं में डीएनए क्षति प्रतिक्रिया का अध्ययन करना चुनौतीपूर्ण हो सकता है। अंडाणु से निपटने के लिए विशिष्ट तापमान और सीओ 2 और ओ2 सांद्रता की आवश्यकता होती है। इसी समय, अंडाणुओं को प्रकाश से बचाया जाना चाहिए। एल हैंडलिंग ग्लास पिपेट का उपयोग करके किया जाना चाहिए जो संकीर्ण नहीं हैं, क्योंकि यह अंडाणुओं के लिए हानिकारक हो सकता है, लेकिन चौड़ा भी नहीं हो सकता है, क्योंकि इससे माध्यम कमजोर पड़ सकता है और इस प्रकार, निर्धारण प्रक्रिया को नकारात्मक रूप से प्रभावित कर सकता है। निर्धारण के प्रत्येक चरण में, कमजोर पड़ने के प्रभाव को कम करने के लिए बफर की कई बूंदों का उपयोग किया जाता है। डीएसबी को देखने का एक वैकल्पिक तरीका धूमकेतुपरख 24 है। भले ही यह तकनीक अधिक संवेदनशील है, लेकिन यह अधिक जटिल है। इसी समय, धूमकेतु परख का उपयोग करके, सटीक डीएनए क्षेत्र का पता लगाना संभव नहीं है जहां क्षति होती है, और प्रचुर मात्रा में आरएनए अणुओं वाली कोशिकाओं में, जैसे जीवी-स्टेज अंडाणु25, पृष्ठभूमि को बढ़ाया जा सकता है, जिससे गलत डीएनए क्षति संकेत26 हो सकता है।

यहां वर्णित इम्यूनोफ्लोरेसेंस प्रोटोकॉल का उपयोग करके, हम सटीकता के साथ डीएसबी का पता लगा सकते हैं और जीवी-चरण अंडाणुओं में मरम्मत की प्रगति का अनुमान लगा सकते हैं, जैसा कि समय के साथ 3एच 2 ए एक्स प्रतिदीप्ति में कमी से संकेत मिलता है। फिर भी, इस विधि की एक सीमा यह है कि कुछ एंटीबॉडी पूरे ओप्लाज्म में निरर्थक वितरण पेश कर सकते हैं, इस प्रकार उच्च पृष्ठभूमि प्रतिदीप्ति वाली छवियों को जन्म दे सकते हैं। पीएफए-टीएक्स -100 बफर का उपयोग अनुक्रमिक पीएफए और टीएक्स -100 के बजाय किया जाता है, क्योंकि हमने देखा है कि यह कम पृष्ठभूमि और गैर-विशिष्ट प्रतिदीप्ति का पता लगाने की अनुमति देकर निर्धारण प्रक्रिया में सुधार करता है। डीएसबी का पता लगाने के लिए 3H2AX का उपयोग करने की दूसरी सीमा यह है कि अर्धसूत्रीविभाजन23 में 3H2AX के सहज फॉस्फोराइलेशन के कारण जीवीबीडी के बाद क्षति का अनुमान नहीं लगाया जा सकता है।

इस इम्यूनोफ्लोरेसेंस प्रोटोकॉल में, अंडाणु एक तरल बफर में रहते हैं और स्लाइड के भीतर संग्रहीत नहीं किए जा सकते हैं। यह तथ्य माध्यमिक एंटीबॉडी को जोड़ने के बाद दिनों तक निश्चित कोशिकाओं को संरक्षित करना मुश्किल बनाता है। अच्छी गुणवत्ता वाली छवियों को प्राप्त करने और सिग्नल न खोने के लिए, द्वितीयक एंटीबॉडी को जोड़ने के बाद कुछ घंटों के भीतर इमेजिंग करना बेहतर होता है। यह भी ध्यान दिया जाना चाहिए कि जेड-अक्ष के माध्यम से नाभिक की स्कैनिंग ओवरएक्सपोजर के कारण सिग्नल को कमजोर बना सकती है। उस कारण से, लेजर शक्ति को कम करना और स्कैनिंग की गति को बढ़ाना बेहतर है।

अंत में, इम्यूनोफ्लोरेसेंस प्रोटोकॉल की एक और सीमा यह है कि इसका उपयोग केवल निश्चित / गैर-जीवित कोशिकाओं के लिए किया जा सकता है। इसलिए, हम केवल विशिष्ट समय बिंदुओं पर कारकों की उपस्थिति और अनुपस्थिति का अनुमान लगा सकते हैं, यह जाने बिना कि क्या समय के माध्यम से उनकी एकाग्रता या उनके व्यवहार में कोई उतार-चढ़ाव है। लाइव-सेल इमेजिंग और फ्लोरोसेंटली टैग किए गए मार्करों का उपयोग करके इस समस्या को दूर किया जा सकता है।

Disclosures

लेखकों के हितों का कोई टकराव नहीं है।

Acknowledgments

हम "बायोमेडिकल रिसर्च (बायोमेड -20) में 'क्षमता निर्माण' बुनियादी ढांचे की स्थापना" (एमआईएस 5047236) परियोजना से इस काम के लिए समर्थन स्वीकार करते हैं, जिसे परिचालन कार्यक्रम "प्रतिस्पर्धात्मकता, उद्यमिता और नवाचार" (एनएसआरएफ 2014-2020) द्वारा वित्त पोषित कार्रवाई "अनुसंधान और नवाचार बुनियादी ढांचे के सुदृढीकरण" के तहत लागू किया गया है, और ग्रीस और यूरोपीय संघ (यूरोपीय क्षेत्रीय विकास कोष) द्वारा सह-वित्तपोषित है।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
3 mL Pasteur pipettes in LDPE, graduated APTACA 1502
10 cc syringes SoftCare 114.104.21
Alexa Fluor 488-conjugated goat anti-rabbit Secondary Ab Biotium 20012
Anti-phospho-H2A.X (Ser139) Merck Millipore 07-164
ARE Heating Magnetic Stirrer VELP Scientifica F20500162
BD FALCON 5 mL Polystyrene Round-Bottom Tubes BD Biosciences 352054
BD Microlance 3 Needles 27 G - 0.40 x 13 mm Becton Dickinson 300635
Bovine Serum Albumin Fraction V Roche 10735078001
DMSO Anhydrous Biotium 90082
DRAQ7 DNA dye BioStatus DR71000
EGTA Sigma-Aldrich E4378-25G
EMSURE MgCl2. 6H2O Merck Millipore 1058330250
Etoposide CHEMIPHARM L01CB01
FALCON 14 mL Polystyrene Round-Bottom Tubes Corning Science 532057
FALCON Tissue Culture Dishes, Easy-Grip, 35 x 10 mm Style Corning Science 353001
Glass Bottom Culture Dishes (35 mm Petri dish/ 14 mm Microwell, No. 0 coverglass) MatTek Corporation P35G-0-14-C
HEPES Sigma-Aldrich H6147-25G
HERACELL 150i CO2 Incubator ThermoFisher Scientific 50116048
IBMX powder Sigma-Aldrich I5879-100MG
Leica M125 Stereo Microscope Leica Microsystems
M16 Medium Sigma-Aldrich M7292
M2 Medium Sigma-Aldrich M7167
Mineral Oil Sigma-Aldrich M5310
NaN3 Honeywell 13412H
NaOH Merck Millipore 1064981000
Nikon AX ECLIPSE Ti2 Confocal Microscope Nikon Corporation
Nikon SMZ800N Stereo Microscope Nikon Corporation
Paraformaldehyde Sigma-Aldrich 158127
Pasteur pippettes, glass, long form 230 mm DURAN WHEATON KIMBLE 357335
pH/ORP meter  Hanna Instruments Ltd HI2211
Phosphate buffered saline tablets Sigma-Aldrich P4417-100TAB
PIPES Sigma-Aldrich P1851
PMSG Protein Lyophilised Genway Biotech (now AVIVA Systems Biology) GWB-2AE30A (now OPPA01037)
QBD4 Dry block heater Grant Instruments (Cambridge) Ltd A25218
Triton X-100 Sigma-Aldrich T8787
Whatman Puradisc 25 mm 0.2 μm filters GE Healthcare 6780-2502

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विकासात्मक जीवविज्ञान अंक 196 अंडाणुओं डीएनए क्षति डबल-स्ट्रैंड ब्रेक (डीएसबी) एटोपोसाइड डीएनए क्षति प्रतिक्रिया इम्यूनोफ्लोरेसेंस कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी,
माउस अंडाणुओं में डीएनए डबल-फंसे ब्रेक का पता लगाना
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Zorzompokou, C., Ipeirotis, M., Martzoukos, M. K., Marangos, P. Detection of DNA Double-Stranded Breaks in Mouse Oocytes. J. Vis. Exp. (196), e65494, doi:10.3791/65494 (2023).

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