Summary
يمكن أن تؤدي زيادة اكتشاف ذباب الفاكهة التيفريتيد غير الناضج في الحقل إلى بذل جهود في الوقت المناسب للقضاء على مجموعات هذه الآفات المدمرة. يكون اكتشاف اليرقات المتأخرة أسرع وأكثر دقة عند هرس الفاكهة المضيفة في كيس وتمرير اللب عبر سلسلة من المناخل بدلا من القطع اليدوي والفحص البصري.
Abstract
يعتبر ذباب الفاكهة من عائلة Tephritidae من بين أكثر الآفات الزراعية تدميرا وتوغلا في العالم. تقوم العديد من البلدان ببرامج استئصال مكلفة للقضاء على السكان الوليدين. أثناء برامج الاستئصال ، يتم بذل جهود متضافرة للكشف عن اليرقات ، لأن هذا يشير بقوة إلى تكاثر السكان ويساعد على تحديد المدى المكاني للإصابة. يؤدي اكتشاف مراحل الحياة غير الناضجة إلى اتخاذ إجراءات رقابية وتنظيمية إضافية لاحتواء ومنع أي انتشار إضافي للآفة. تقليديا ، يتم الكشف عن اليرقات عن طريق قطع ثمار المضيف الفردية وفحصها بصريا. هذه الطريقة كثيفة العمالة ، حيث لا يمكن معالجة سوى عدد محدود من الفاكهة ، واحتمال فقدان اليرقة مرتفع. تم اختبار تقنية الاستخراج التي تجمع بين i) هرس الفاكهة المضيفة في كيس بلاستيكي ، ii) إجهاد اللب من خلال سلسلة من المناخل ، iii) وضع اللب المحتفظ به في محلول ماء السكر البني ، و iv) جمع اليرقات التي تطفو على السطح. تم تقييم الطريقة في فلوريدا مع الجوافة التي تم جمعها ميدانيا الموبوءة بشكل طبيعي بواسطة Anastrepha suspensa. لتقليد عدد السكان المنخفض الأكثر تمثيلا لبرنامج القضاء على ذبابة الفاكهة ، كانت المانجو والبابايا في هاواي موبوءة بعدد منخفض معروف من يرقات Bactrocera dorsalis . تم اختبار قابلية تطبيق الطريقة في الحقل على الجوافة الموبوءة بشكل طبيعي من قبل B. dorsalis لتقييم الطريقة في ظل الظروف التي مر بها العمال خلال برنامج ذبابة الفاكهة الطارئ. في كل من التجارب الميدانية والمخبرية ، كان هرس اللب وغربلته أكثر كفاءة (يتطلب وقتا أقل) وأكثر حساسية (تم العثور على المزيد من اليرقات) من قطع الفاكهة. ساعد تعويم اللب في محلول ماء السكر البني في اكتشاف اليرقات الداخلية السابقة. قد يؤدي هرس ونخل لب الفاكهة من مضيفات التيفريتيد المهمة إلى زيادة احتمالية اكتشاف اليرقات أثناء برامج الطوارئ.
Introduction
يعد ذباب الفاكهة Tephritid من بين أكثر الآفات الزراعية تدميرا ، حيث تشكل أجناس Anastreva و Bactrocera و Ceratitis أكبر خطر1. العديد من المناطق معرضة لخطر كبير لإنشاء ذبابة الفاكهة الغريبة ، بناء على 1) التوغلات التاريخية وما يرتبط بها من برامج ترسيم الحدود والاستئصال ، 2) ارتفاع معدل وصول المواد المضيفة لذبابة الفاكهة إلى موانئ الدخول ، و 3) الظروف المناخية المواتية لإنشاء مجموعات التكاثر. تشهد ولاية كاليفورنيا عمليات توغل واكتشافات متعددة للتفريتيدات سنويا2. كان هناك أكثر من 200 عملية توغل وبرامج استئصال ضد التيفريتيدات على مستوى العالم خلال القرن الماضي ، وقد تسارع هذا بشكل كبير في العقود الأخيرة3. على الرغم من أن الغالبية العظمى من هذه البرامج نجحت في القضاء على ذبابة الفاكهة الغازية 3,4 ، إلا أن العبء الاقتصادي والبيئي لهذه الغزوات لا يزال مرتفعا ، وإمكانية إنشائها موجودة دائما ؛ ومن الأمثلة الكارثية الحديثة عدوى Bactrocera dorsalis في القارة الأفريقية5.
خلال برامج ذبابة الفاكهة في حالات الطوارئ ، يتم بذل جهود متضافرة للكشف عن مجموعات تكاثر الأنواع الغازية والسيطرة عليها. على سبيل المثال ، تستجيب ولاية فلوريدا لتوغلات التيفريتيد من خلال تطبيق غمر التربة (تحت خط التنقيط للنباتات المضيفة الحاملة للفاكهة) وإزالة الفاكهة المضيفة في دائرة نصف قطرها 200 متر حول المواقع التي توجد فيها إناث و / أو يرقات متزاوجة6. تعمل هذه الإجراءات والتكتيكات على قتل اليرقات والشرانق في التربة وإزالة أي بيض ويرقات من الفاكهة داخل المنطقة. في بعض برامج الاستئصال ، تتم إزالة كمية كبيرة من الفاكهة المضيفة. في عام 2015 ، تم تدمير أكثر من 100000 كجم من الفاكهة خلال برنامج القضاء على B. dorsalis في فلوريدا6. قدرت الخسائر الاقتصادية للمزارعين والصناعات المرتبطة بها في منطقة الحجر الصحي وحدها بأكثر من 10.7 مليون دولار7.
للعثور على يرقات التيفريتيد في مناطق الحجر الصحي ، يقوم فريق صغير من علماء الحشرات بجمع ثمار مضيفة في دائرة نصف قطرها 200 متر حول منطقة اكتشاف الذباب الأنثوي وقطع كل فاكهة وفحصها بصريا بحثا عن اليرقات6. مع محدودية موارد الموظفين ومئات المضيفين المحتملين ، تصبح المهمة صعبة ، لا سيما في المناطق التي يكون فيها التنوع النباتي في كل من مناطق الإنتاج التجاري والساحات السكنية مرتفعا. بالإضافة إلى ذلك ، قد يتم تفويت اليرقات عند قطع ثمار المضيف. في دراسة تقييم قطع الفاكهة في موانئ الدخول ، وجد أن قطع الفاكهة ليس فعالا في اكتشاف A. suspensa عند مقارنته بالاحتفاظ بالثمار المصابة لعدة أسابيع وحساب اليرقات والشرانق الموجودة في ركيزة الجرنق8.
هناك بدائل لتقطيع الفاكهة للكشف عن الإصابة9،10،11،12،13. على سبيل المثال ، يعد كل من تعويم السكر البني وطريقة الماء الساخن من الإجراءات المقبولة المستخدمة للكشف عن ذباب فاكهة الكرز الغربي في الكرز المحصود 9,10. تتضمن طريقة السكر البني وضع الفاكهة المسحوقة في محلول ماء السكر وجمع اليرقات التي تطفو إلى الأعلى. تم تطوير طريقة تعويم السكر البني خصيصا لتلبية القواعد التنظيمية للكرز المصدر ، والتي تتطلب من بيوت التعبئة مراقبة آفات ذبابة الفاكهة في الحجر الصحي. هناك أيضا برنامج معتمد لشهادة التوت الأزرق بين الولايات المتحدة وكندا يتضمن تعويم ماء السكر البني أو تعويم المياه المالحة أو الغليان لدعم الصرف الصحي النباتي14. عند اختبار دقة تعويم السكر والماء الساخن ، استخدم الباحثون طريقة الغربلة لتحديد عدد اليرقات المفقودة9،10،11،12،13. أظهرت دراسة أن خلط التوت الأزرق المسحوق في محلول ملحي وتصفية المحلول من خلال مرشح قهوة قابل لإعادة الاستخدام كان أفضل بأربع مرات في اكتشاف يرقات ذبابة الفاكهة سوزوكي من الفحص البصري لسطح محاليل الملح والسكر14. بالإضافة إلى ذلك ، تم استخدام كروماتوغرافيا الغاز للكشف عن يرقات A. suspensa في الحمضيات15. ولم تختبر هذه النهج للتأكد من إمكانية تطبيقها في الدراسات الاستقصائية الميدانية.
كان هدفنا هو تطوير واختبار طريقة للعثور على يرقات التيفريتيد في الحقل باستخدام الغربلة وتعويم ماء السكر. تسمح هذه الطريقة بالكشف عن ذباب الفاكهة غير الناضج بشكل أكثر كفاءة من طريقة تقطيع الفاكهة التقليدية ، مما يدعم التحكم في الوقت المناسب لمجموعات التكاثر أثناء برامج القضاء على ذبابة الفاكهة.
Protocol
1. اختيار الفاكهة
- حدد الفاكهة المتوفرة في المنطقة المراد مسحها.
- حدد الفاكهة المضيفة بناء على قائمة المضيفين المعروفين لأنواع التيفريتيد المستهدفة.
- اختر الفاكهة الناضجة ذات اللحم الطري ، مثل المانجو والبابايا والجوافة. يجب فحص الفاكهة غير الناضجة أو الصلبة ، مثل اللوز الاستوائي ، بطريقة مختلفة ، مثل قطع الفاكهة.
- اختر الفاكهة المتساقطة أو الناضجة أو الناضجة على الأشجار التي تظهر عليها علامات التلف وندبات وضع البيض والبقع الناعمة.
- معالجة ما يقرب من 2 لتر من الفاكهة دفعة واحدة (على سبيل المثال ، 5 جوافة أو 5 مانجو متوسطة الحجم تشكل عينات كافية لهذه الطريقة). يعتمد عدد الثمار التي يمكن معالجتها مرة واحدة على حجم الثمار (الشكل 1 أ).
2. الهريسة
- قطع الفاكهة إلى قطع كبيرة وضعها في كيس تخزين بسحاب سعة 4 لتر (الشكل 1 ب).
- أضف الماء إلى الكيس حتى يغطي الماء الفاكهة المفرومة بمقدار 25-50 مم (الشكل 1 ج).
- اعصر الثمرة برفق باليد حتى ينفصل كل اللب من القشرة ويكون قوامه سلسا (أي بدون قطع كبيرة) (الشكل 1 د).
3. غربلة لمجموعة instar المتأخرة
- كومة المناخل. استخدم المناخل الكبيرة (قطرها 457 مم) لمعالجة كميات كبيرة من الفاكهة (~ 5 فواكه في وقت واحد) والمناخل الأصغر (قطر 305 مم) للفاكهة الفردية أو العينات الأصغر (< 5 فاكهة).
- قم بتكديس الغربال بشبكة كبيرة (رقم 8 ؛ 2.36 مم) فوق غربال شبكي صغير (رقم 20 ؛ 0.85 مم). للكشف عن النجوم المبكرة ، ضع غربالا ثالثا (رقم 45 ؛ 0.35 مم) في الجزء السفلي من المكدس (الشكل 1E).
- صب اللب في الغربال العلوي (الشكل 1F).
- اغسل اللب جيدا من خلال كومة المناخل باستخدام الماء من صنبور أو خرطوم أو زجاجة حتى يمر اللب الناعم عبر المناخل (الشكل 1 ج).
- امسح بصريا المناخل العلوية بحثا عن اليرقات المتأخرة التي ربما تم الاحتفاظ بها مع القشر أو أي قطع كبيرة من الفاكهة (الشكل 1H).
- تفقد بعناية الغربال الثاني ليرقات instar في وقت متأخر. مع كميات كبيرة من اللب الناعم ، قد يكون من الضروري شطف إضافي.
- جمع اليرقات من المناخل مع ملقط اليرقات ووضعها في قوارير مع 70 ٪ EtOH.
4. تعويم السكر لجمع instar في وقت مبكر
- امزج محلول السكر مسبقا عن طريق إذابة 453 جم (1 صندوق) من السكر البني الداكن في 2 لتر من ماء الصنبور، مما ينتج عنه قراءة بركس تبلغ 19 درجة و10.
- اغسل اللب من المناخل الشبكية الدقيقة (على سبيل المثال ، رقم 20 ورقم 45) إلى حافة الغربال بماء الصنبور ، ثم انقل المادة إلى صحن بلاستيكي (11 لترا).
- أضف محلول السكر البني حتى يغطي اللب بمقدار 25-50 مم وأضف قطرتين من مضاد الرغوة. دع اللب يجلس في محلول السكر البني لمدة 5 دقائق.
- جمع اليرقات التي تطفو على سطح الحل مع ملقط اليرقات في قوارير مع 70 ٪ EtOH.
5. تنظيم اليرقات
- قم بتسمية قارورة بموقع التجميع والتاريخ ونوع الفاكهة وجامعها لفحصها وتحديدها لاحقا.
Representative Results
استخراج Anastrepha suspensa المبكر والمتأخر من الفاكهة التي تم جمعها في الحقل
في هذه التجربة ، قمنا بمقارنة طرق تقطيع الفاكهة وطرق الهرس والغربلة والطفو (MSF) فيما يتعلق بنسبة اليرقات المكتشفة ومتوسط الوقت اللازم لاكتشافها. تم جمع الجوافة ، الموبوءة بشدة بيرقات Anastrepha suspensa ، من نبات يقع في جامعة فلوريدا ، معهد علوم الأغذية والزراعة ، مركز البحوث والتعليم الاستوائي ، هومستيد ، فلوريدا. تم فرز الثمار عشوائيا إلى مجموعات من 5 وتخصيصها لطريقة واحدة من طريقتين لاستخراج اليرقات: 1) القطع اليدوي أو 2) طريقة أطباء بلا حدود. تم تسجيل الوقت لجمع كل اليرقات المرئية للعين المجردة باستخدام كل طريقة استخراج.
اتبعت طريقة القطع اليدوي الطريقة المستخدمة حاليا في برنامج الاستئصال. تم تخصيص 5 فواكه لكل من العمال الخمسة (ن = 5) للبحث عن جميع مراحل اليرقات عن طريق تقطيع الثمار إلى قطع أصغر وفحص اللب بصريا. لتحديد ما إذا كانت اليرقات قد فاتتها في الفحص البصري ، تم إعادة فحص قطع الفاكهة المقطوعة يدويا باستخدام مجهر تشريح (10x).
بالنسبة لطريقة منظمة أطباء بلا حدود، تم تقطيع 5 فواكه إلى قطع كبيرة (50-80 سم)، ووضعها في أكياس بسحاب، وعصرها برفق باليد حتى يتم إزاحة كل اللب من القشرة ويكون اللب ناعما (أي لا توجد قطع كبيرة). تم تصفية الفاكهة المهروسة من خلال سلسلة من المناخل النحاسية الكبيرة (45.7 سم). تم تكديس أكبر شبكة (رقم 8) في الأعلى ، متبوعة برقم 20 وغربال شبكي رقم 45. قام الموظفون المكلفون بهذا العلاج بغسل اللب من خلال الشبكة باستخدام الماء من خرطوم متصل بصنبور الحوض. كانت اليرقات المتأخرة واضحة في المناخل. تم خلط النجوم الأصغر مع اللب ، مما يجعل من الصعب رؤيتها وإزالتها. لذلك ، تم وضع خليط اللب / اليرقات من المناخل في دلاء مع 1 لتر من محلول ماء السكر البني. تطفو اليرقات على الفور على السطح. تم تحريك المحلول بلطف ، وبعد 5 دقائق ، تمت إزالة اليرقات من الدلاء وحسابها. كان وقت معالجة الفاكهة مزيجا من الهريسة والغربلة وإزالة اليرقات من محلول ماء السكر. تم تحليل بيانات عدد اليرقات التي تم العثور عليها من خلال طرق القطع اليدوي أو الغربلة والطفو باستخدام اختبار كروسكال-واليس غير المعلمية (p = 0.05)16.
أسفرت طريقة منظمة أطباء بلا حدود عن أعداد أكبر من اليرقات (الشكل 2 أ) وأعداد أكبر من اليرقات في الدقيقة (الشكل 2 ب) مقارنة بالقطع اليدوي. على الرغم من أن الكشف عن النجوم المختلفة لم يتم تحديده كميا في هذه الدراسة ، فقد لاحظنا أنه تم العثور على جميع النجوم (الأولى والثانية والثالثة) باستخدام المناخل ، بينما شوهدت النجوم اللاحقة فقط (الثانية والثالثة) باستخدام القطع اليدوي. عندما تم إعادة فحص العينات المقطوعة سابقا وفحصها بصريا باستخدام منظار مجهر تشريح ، تم تفويت 40٪ من اليرقات المتأخرة التي تصيب الثمار. ومع ذلك ، تم العثور على instars في وقت سابق في المقام الأول مع إعادة الفحص.
أظهرت هذه التجربة أن استخدام طريقة أطباء بلا حدود أكثر فعالية وكفاءة للعثور على اليرقات في الفاكهة شديدة العدوى. ومع ذلك ، من المرجح أن تصادف الفاكهة الموبوءة بأعداد أقل من اليرقات في برنامج الاستئصال ، حيث تكون الأنواع الغازية نادرة جدا. لذلك ، أجرينا دراسة مخبرية كانت فيها الفاكهة المضيفة موبوءة بعدد قليل معروف من اليرقات.
الإصابة اليدوية بالمانجو والبابايا لمحاكاة الإصابة المنخفضة ب Bactrocera dorsalis
قارنت هذه التجربة بين طرق تقطيع الثمار ومنظمة أطباء بلا حدود فيما يتعلق بنسبة اليرقات المكتشفة والوقت اللازم لاكتشافها عندما كانت الإصابة منخفضة نسبيا. تم استخدام الإصابة اليدوية كأداة تجريبية لتقييم فعالية كل طريقة ، حيث كان عدد اليرقات الموجودة معروفا على وجه اليقين.
تم استخدام حفار الفلين (قطره 1.0 سم) لعمل 5 ثقوب في ثمار المانجو والبابايا الفردية الخالية من يرقات ذبابة الفاكهة. تم وضع يرقة واحدة متأخرة من الثانية إلى أوائل الثالثة من B. dorsalis في كل من الثقوب ال 5 لمجموعة فرعية من الفاكهة. تم تغطية الثقوب باستخدام القطعة التي تم التخلص منها من الفاكهة وتم تغطية الفاكهة المتبقية دون إدخال اليرقة لمحاكاة الإصابة اليدوية بصريا. تم الاحتفاظ بالثمار عند 27 درجة مئوية لمدة 48 ساعة للسماح بنمو اليرقات. أجريت التجربة في مختبر ARS في هيلو ، جزيرة هاواي (ن = 5 عمال) ومختبر APHIS-PPQ في جزيرة أواهو ، هاواي (ن = 4 عمال).
بالنسبة لقطع الفاكهة ، تم إعطاء كل عامل 5 مانجو (1 موبوء يرقات واحدة و 4 غير مصابة) و 4 بابايا (واحدة موبوءة و 3 غير موبوءة). قام عامل بتقطيع كل فاكهة على حدة إلى قطع أصغر وأصغر وفحص اللب باستمرار بحثا عن أي ذباب فاكهة غير ناضج. تم إيقاف البحث عندما تم فحص اللب بدقة. تم تسجيل العدد الإجمالي لليرقات التي تم العثور عليها والوقت الذي يقضيه كل عامل في معالجة جميع الثمار عن طريق القطع (الشكل 3) و (الشكل 4).
تلقى كل عامل مجموعة أخرى مماثلة من الفواكه (5 مانجو و 4 بابايا) للهرس أو الغربلة (دون قطع الفاكهة) ، مع 2 قطعة موبوءة كما هو موضح سابقا. تم سكب اللب في الغربال العلوي وغسله من خلال كومة المناخل باستخدام الماء من صنبور وإزالة اليرقات ، كما هو موضح في البروتوكول. أجريت التجربة مرتين ، مع تعويم السكر وبدون تعويم السكر ، لتحديد ما إذا كانت إزالة خطوة الطفو ستزيد من سرعة العملية دون فقدان الحساسية (أي تم العثور على كل أو معظم اليرقات) (الشكل 3). تم تسجيل عدد اليرقات التي تم العثور عليها والوقت الذي يقضيه كل عامل في معالجة الفاكهة من خلال طريقة القطع أو MSF أو MS.
بالنسبة لكل من المانجو والبابايا، أدت طريقة أطباء بلا حدود الكاملة (بما في ذلك الطفو) إلى اكتشاف أعداد أكبر من اليرقات وكانت أسرع من قطع الفاكهة (الجدول 1). غاب العمال الذين يستخدمون طريقة تقطيع الفاكهة التقليدية عن 32٪ و 35٪ من اليرقات الموضوعة في المانجو والبابايا ، على التوالي (الجدول 1). تتطلب معالجة الفواكه بكميات كبيرة باستخدام تقنية أطباء بلا حدود وقتا أقل بنسبة 30٪ من تقطيع المانجو الفردية ووقتا أقل بنسبة 35٪ من تقطيع البابايا الفردية (الشكل 3). تم العثور على المزيد من اليرقات في الدقيقة باستخدام طريقة MSF للبابايا (الشكل 3C) والمانجو (الشكل 3D) بالمقارنة مع طريقة قطع الفاكهة. جميع اليرقات التي تم العثور عليها كانت حية.
التعرف المورفولوجي لليرقات ممكن فقط للنجوم المتأخرة. كررنا التجربة المذكورة أعلاه ولكننا حذفنا إجراء الطفو لتحديد ما إذا كان انتعاش اليرقات لا يزال مرتفعا وزادت سرعة معالجة الفاكهة. أدت طريقة MS (مع حذف الطفو) إلى المزيد من الكشف عن اليرقات للبابايا (الشكل 4 أ) والمانجو (الشكل 4 ب) مقارنة بالقطع والفحص البصري. بالإضافة إلى ذلك ، كانت التقنية أسرع من قطع البابايا وفحصها بصريا (الشكل 4C) والمانجو (الشكل 4D). أدت إزالة خطوة الطفو من طريقة أطباء بلا حدود إلى تقليل الوقت اللازم للعثور على اليرقات المتأخرة بنسبة 90٪ للبابايا وبنسبة 48٪ للمانجو (الجدول 2). كانت النسبة المئوية لليرقات التي تم العثور عليها عالية لكلتا الطريقتين وكانت أعلى باستمرار بالنسبة لمرض التصلب العصبي المتعدد (تم حذف الطفو). بالنسبة للبابايا ، تم استرداد 80٪ و 85٪ من اليرقات من طرق MSF و MS ، على التوالي (الجدول 1 والجدول 2). بالنسبة للمانجو، تم استرداد 88٪ و 95٪ من طرق MSF و MS ، على التوالي (الجدول 1 والجدول 2).
مقارنة ميدانية بين طرق تقطيع الفاكهة وأطباء بلا حدود
كان الهدف من هذه التجربة هو مقارنة طرق تقطيع الفاكهة وطرق منظمة أطباء بلا حدود في ظل الظروف الحقلية، ومحاكاة برنامج ذبابة الفاكهة في حالات الطوارئ. تم إجراء معالجة الفاكهة دون راحة وبنية تحتية من المختبر لاختبار الاستعداد الميداني لطريقتي استخراج اليرقات. تم إجراء العمل في بستان الجوافة الموجود في وحدة الموارد الوراثية النباتية الاستوائية وأبحاث الأمراض التابعة لوزارة الزراعة الأمريكية بالقرب من هيلو. تم جمع ما مجموعه 40 جوافة تظهر عليها علامات الإصابة وتقسيمها إلى مجموعات 2. وقد خضع ما مجموعه 20 جوافة للقطع/الفحص البصري تلتها منظمة أطباء بلا حدود (بما في ذلك الطفو)، مما سمح بتقييم حساسية طريقة القطع مقارنة بطريقة منظمة أطباء بلا حدود. استمر التشريح كما هو موضح أعلاه. عند اكتشافها ، تمت إزالة اليرقات وعدها. قام أربعة عمال بتشريح 5 جوافة لكل منهم ، وتم تسجيل الوقت اللازم للقطع والتفتيش لكل عامل. تم إجراء عمليات ما بعد القطع على النحو الوارد أعلاه، باستثناء استخدام غربال شبكي ثالث أصغر (رقم 40، 0.420 مم) بالإضافة إلى المناخل رقم 8 ورقم 20 لجمع اليرقات الصغيرة. أما المجموعة الثانية المكونة من 20 جوافة فقد وضعت في كيسين بسحاب (10 فواكه لكل كيس) وخضعت لمنظمة أطباء بلا حدود فقط (أي بدون تقطيع)، مما سمح بمقارنة الوقت اللازم لتقطيع الفاكهة مقابل منظمة أطباء بلا حدود. على النحو الوارد أعلاه ، تم استخدام ثلاثة مناخل في هذا الإجراء. تم تسجيل عدد اليرقات التي تم العثور عليها والوقت الإجمالي لمعالجة الفاكهة (هرس الثمار والاحتفاظ بها لمدة 5 دقائق في الكيس / الغربلة / الطفو في محلول السكر).
وكما وجد في المختبر، فإن قطع الثمار قلل من شأن الإصابة بالفاكهة وكان متغيرا للغاية، حيث اكتشف يرقات أقل بنسبة 25٪ -83٪ مما يمكن استعادته باستخدام طرق منظمة أطباء بلا حدود (الجدول 3). علاوة على ذلك، في العينة التي تحتوي على أعداد منخفضة من اليرقات، استعادت منظمة أطباء بلا حدود يرقات أكثر بنسبة 500٪، مما وفر حساسية أعلى للمقايسة وفرصة أكبر لتحديد الكائن الحي المصاب. تمت معالجة الفواكه بشكل أسرع بكثير باستخدام طريقة أطباء بلا حدود مقارنة بالتقطيع. يتطلب تقطيع وفحص 5 فواكه نفس الوقت تقريبا لمعالجة 10 فواكه عبر منظمة أطباء بلا حدود.
الشكل 1: خطوات بروتوكول استخراج يرقات ذبابة الفاكهة. (أ) معالجة حوالي 2 لتر من حجم الفاكهة دفعة واحدة (على سبيل المثال ، تشكل 5 جوافة أو 5 مانجو متوسطة الحجم عينات كافية لهذه الطريقة). (ب) قطع الفاكهة إلى قطع كبيرة ووضعها في كيس تخزين بسحاب 4 لتر. (ج) أضف الماء إلى الكيس حتى يغطي الماء الفاكهة المفرومة بمقدار 25-50 مم. (د) اعصر الفاكهة برفق باليد حتى ينفصل كل اللب من القشرة ويكون قوامه سلسا (أي بدون قطع كبيرة). (ه) رص المنخل بالشبكة الكبيرة (رقم 8؛ 2.36 مم) فوقه متبوعا بالشبكة الصغيرة (رقم 20؛ 0.85 مم). بالنسبة للنجوم المبكرة ، ضع غربالا ثالثا (رقم 45 ؛ 0.35 مم) في الجزء السفلي من المكدس. (و) صب اللب في الغربال العلوي. (ز) اغسل اللب جيدا من خلال كومة المناخل باستخدام الماء من صنبور أو خرطوم أو زجاجة حتى يمر اللب الناعم عبر الغربال الأول. (H) مسح المناخل العلوية بصريا بحثا عن اليرقات المتأخرة التي ربما تم الاحتفاظ بها مع القشر أو أي قطع كبيرة من الفاكهة. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: استخراج Anastrepha suspensa المبكر والمتأخر من الفاكهة التي تم جمعها في الحقل. متوسط عدد (± خطأ معياري للمتوسط [SE]) ليرقات Anastrepha suspensa من خمس ثمار جوافة تم جمعها عن طريق القطع والفحص البصري (القطع: 70.4 ± 11.9) أو غسل اللب من خلال سلسلة من ثلاثة غربال متبوعة بنقع اللب في محلول ماء السكر (أطباء بلا حدود: 175.6 ± 21.91) (أ). متوسط عدد اليرقات (±SE) التي يتم جمعها في الدقيقة من 5 جوافة تمت معالجتها عن طريق القطع (1.21 ± 0.16) وبواسطة منظمة أطباء بلا حدود (3.71 ± 0.50) (B). تم تكرار كل طريقة 5 مرات ، وتشير العلامات النجمية فوق القضبان إلى اختلافات كبيرة في عدد اليرقات (χ 2 = 6.81 ، p < 0.01) ووقت المعالجة (χ2 = 6.80 ، p < 0.01) بناء على اختبار Kruskal-Wallis. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3: التحقق من صحة طريقة التعويم الكامل للنهبل باستخدام الإصابة اليدوية للمانجو والبابايا لمحاكاة الإصابة المنخفضة ب Bactrocera dorsalis. متوسط عدد يرقات باكتروسيرا الظهرية (±SE) الموجودة في البابايا (القطع: 3.25 ± 0.51 ، أطباء بلا حدود: 4.0 ± 0.4) (أ) والمانجو (القطع: 3.4 ± 0.51 ، أطباء بلا حدود: 4.4 ± 0.4) (ب) الثمار ومتوسط عدد اليرقات (±SE) التي يتم جمعها في الدقيقة من البابايا (القطع: 0.21 ± 0.1 ، أطباء بلا حدود: 0.4 ± 0.15) (C) والمانجو (القطع: 0.14 ± 0.01 ، أطباء بلا حدود: 0.21 ± 0.03) (D). الثمار التي تمت معالجتها باستخدام طرق القطع أو طرق MSF (بما في ذلك الطفو ، ن = 5) موبوءة يدويا ب 5 يرقات ثالثة. تشير العلامات النجمية فوق القضبان إلى اختلافات كبيرة في عدد اليرقات الموجودة في البابايا (χ 2 = 5.39 ، p = 0.02) والمانجو (χ2 = 3.94 ، p = 0.05) عند مقارنتها بقطع الفاكهة بناء على اختبارات Kruskal-Wallis. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 4: التحقق من صحة طريقة غربلة الهريسة (إزالة الطفو) باستخدام الإصابة اليدوية للمانجو والبابايا لمحاكاة الإصابة المنخفضة ب Bactrocera dorsalis. متوسط عدد اليرقات (±SE) الموجودة في البابايا (القطع: 1.25 ± 0.48 ، MS: 4.25 ± 0.48) (A) والمانجو (القطع: 2.5 ± 0.5 ، MS: 4.75 ± 0.25) (B) الثمار ومتوسط عدد اليرقات التي يتم جمعها في الدقيقة (±SE) في البابايا (القطع: 0.15 ± 0.05 ، MS: 0.76 ± 0.15) (C) والمانجو (القطع: 0.16 ± 0.04 ، MS: 0.44 ± 0.04) (D). تم إصابة الثمار يدويا ب 5 يرقات Bactrocera dorsalis ثالثة ومعالجتها عن طريق القطع والفحص البصري (القطع) أو المهروسة في كيس وغسلها من خلال المناخل (فقط الهريسة والغربلة ، بدون تعويم ، ن = 4). تشير العلامات النجمية فوق القضبان إلى اختلافات كبيرة في عدد اليرقات الموجودة في البابايا (χ 2 = 5.46 ، p = 0.02) والمانجو (χ 2 = 5.25 ، p = 0.02) ووقت معالجة البابايا (χ 2 = 5.39 ، p = 0.02) والمانجو (χ 2 = 5.39 ، p = 0.02) مقارنة بقطع الفاكهة ، بناء على اختبارات Kruskal-Wallis. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
| فاكهة | # الفاكهة المصنعة | #Larvae المضافة | طريقة المعالجة | #Larvae موجود | وقت المعالجة (دقيقة)* | ٪ الانتعاش |
| أنبج | 25 | 25 | قطع | 17 | 158 | 68% |
| أنبج | 25 | 25 | أطباء بلا حدود | 22 | 113 | 88% |
| بابايا | 16 | 20 | قطع | 13 | 62 | 65% |
| بابايا | 16 | 20 | أطباء بلا حدود | 16 | 40 | 80% |
| * مجموع الوقت لخص أكثر من 5 عمال. | ||||||
الجدول 1: عدد اليرقات المستعادة ووقت معالجة الفاكهة عن طريق التقطيع والفحص البصري (القطع) أو طريقة الهرس الكامل والغربلة والطفو (MSF). كانت فاكهة الاختبار موبوءة يدويا ب 5 يرقات ثالثة ممزوجة بالفاكهة المملة والمغطاة فقط (1 من 5 مانجو ، 1 من 4 بابايا).
| فاكهة | # الفاكهة المصنعة | #Larvae المضافة | طريقة المعالجة | #Larvae موجود | وقت المعالجة (دقيقة)* | ٪ الانتعاش |
| أنبج | 20 | 20 | قطع | 10 | 66 | 50% |
| أنبج | 20 | 20 | مللي ثانية | 19 | 44 | 95% |
| بابايا | 16 | 20 | قطع | 5 | 38 | 25% |
| بابايا | 16 | 20 | مللي ثانية | 17 | 25 | 85% |
| * مجموع الوقت لخص أكثر من 4 عمال. | ||||||
الجدول 2: عدد اليرقات المستعادة والوقت اللازم لمعالجة الفاكهة عن طريق القطع أو الهرس والغربلة فقط ، تم حذف الطفو (MS). تم إصابة ثمار الاختبار يدويا بخمس يرقات ثالثة ممزوجة بالملل والفاكهة فقط (1 من كل 5 مانجو ، 1 من كل 4 بابايا).
| العامل / الطريقة | #Fruit معالجتها | وقت المعالجة (دقيقة) | #Larvae العثور على قطع | #Larvae وجدت أطباء بلا حدود* | ٪ من إجمالي عدد اليرقات التي تم العثور عليها عن طريق القطع |
| العامل 1: القطع | 5 | 18 | 33 | 14 | 70% |
| العامل 2: القطع | 5 | 18 | 1 | 5 | 17% |
| العامل 3: القطع | 5 | 26 | 9 | 11** | 75% |
| العامل 4: القطع | 5 | 20 | 24 | ||
| العامل 5: أطباء بلا حدود | 10 | 22 | غير متوفر | 22 | غير متوفر |
| العامل 6: أطباء بلا حدود | 10 | 18 | غير متوفر | 37 | غير متوفر |
| * تمت معالجة اللب من القطع والفحص البصري مرة أخرى باستخدام طريقة MSF لتحديد عدد اليرقات المتأخرة 2nd-3 rd instar المفقودة | |||||
| ** لب العمال 2 و 3 الفاكهة المجمعة قبل المعالجة باستخدام طريقة أطباء بلا حدود | |||||
الجدول 3: عدد اليرقات الموجودة في الجوافة التي يتم جمعها ميدانيا عن طريق قطع الفاكهة وفحصها بصريا (تقطيعها) أو عن طريق هرس الفاكهة وغربلتها وتعويمها (MSF).
Discussion
كان هدفنا هو تطوير طريقة فعالة وفعالة للعثور على يرقات التيفريتيد في الحقل. الدافع وراء إطلاق برنامج الاستئصال أو إنشاء منطقة الحجر الصحي هو الكشف عن الإناث المتزاوجة أو اليرقات6 ، مما يشير إلى وجود مجموعة تكاثر. الطريقة الحالية لتقطيع الفاكهة والبحث عنها بصريا غير فعالة في العثور على اليرقات حيث يوجد عادة العديد من الفواكه المضيفة أكثر مما يمكن فحصه بشكل فردي. بالإضافة إلى ذلك ، من المحتمل أن تكون أعداد التيفريتيدات منخفضة في منطقة غزو جديد ، مما يجعل فرص العثور على اليرقات في كمية كبيرة من الفاكهة صعبة للغاية. على سبيل المثال ، في برنامج القضاء على Bactrocera dorsalis لعام 2015 في فلوريدا ، تم تحديد 54 نوعا مضيفا مختلفا ، وتم قطع أكثر من 4000 فاكهة. في برنامج الاستئصال هذا ، تم العثور على عدد قليل فقط من اليرقات في المانجو ، ولم يتم العثور على مضيفين آخرين مصابين6. وجدنا أن طريقة MSF / MS كانت أكثر حساسية وأسرع في اكتشاف يرقات A. suspensa و B. dorsalis عند معالجة الفواكه التي تحتوي على كمية كبيرة من اللب (المانجو والجوافة والبابايا) بكميات كبيرة مقارنة بقطع الفاكهة. يمكن أن تزيد الكمية الأكبر من الثمار المضيفة التي يمكن فحصها باستخدام طريقة الهرس والغربلة ، جنبا إلى جنب مع زيادة اكتشاف يرقة نادرة ، من احتمال اكتشاف الإصابة مبكرا. يمكن أن يؤدي الاكتشاف المبكر لمجموعات التكاثر إلى زيادة احتمالية الاستئصال وتقليل تكاليف البرنامج.
أظهرت تجاربنا أن عدد اليرقات التي اكتشفها العمال الذين يقطعون الثمار ويفحصونها بصريا يختلف اختلافا كبيرا. غاب العمال الذين يقطعون الفاكهة عن 50٪ و 75٪ من يرقات B. dorsalis الموضوعة في المانجو والبابايا ، على التوالي. في المقابل ، تم تفويت 5٪ و 15٪ فقط من اليرقات باستخدام طريقة MS لمعالجة فاكهة المانجو والبابايا ، على التوالي. وبالمثل، أظهرت دراسة لتقييم قطع الفاكهة في موانئ الدخول أن هناك تباينا كبيرا في عدد الفواكه واليرقات المصابة التي عثر عليهاالمفتشون8. أظهرت الدراسة أن مفتشي الموانئ ذوي الخبرة فاتتهم 64٪ -99٪ من يرقات A. suspensa و 16٪ -82٪ من الفاكهة المصابة عندما تم قطع الفاكهة وفحصهابصريا 8. تشير نتائجنا إلى أن طريقة الهرس والغربلة يمكن أن تقلل من احتمالية أن يفوت العامل اكتشاف الفاكهة المصابة.
يتم قبول تعويم السكر والماء الساخن في طريقة نهج الأنظمة لضمان خلو الكرز والتوت الأزرق من ذباب الفاكهة14. يتم سحق مجموعة فرعية من الشحنة في المحلول ، حيث يقوم المفتش بفحص سطح محلول السكر بصريا لوجود البيض واليرقات. على الرغم من أنه يمكن معالجة عدد أكبر من الثمار مقارنة بقطع الفاكهة الفردية ، إلا أن احتمال العثور على اليرقات باستخدام هذه التقنيات لا يزال يتأثر بقدرة المفتش ، ومرحلة وعدد اليرقات الموجودة ، ونوع الفاكهة8. وجدنا أنه ، مثل التيفريتيدات الأخرى ، يتم إزاحة B. dorsalis و A. suspensa من لب الفاكهة وتطفو على السطح. ومن المثير للاهتمام ، وجدنا أنه مع وجود يرقات متأخرة أكبر ، والتي هي الهدف في برامج الطوارئ والاستئصال حيث يمكن تحديدها شكليا ، بما في ذلك تعويم السكر لم يزيد من دقة الطريقة. في الواقع ، أدت إضافة طريقة التعويم إلى زيادة وقت المعالجة بنسبة 90٪ للبابايا وبنسبة 48٪ للمانجو. زيادة وقت المعالجة بالإضافة إلى المواد الإضافية (مثل الماء والصناديق والسكر وما إلى ذلك) لا تدعم من الناحية التشغيلية إضافة هذه الخطوة عند البحث عن instars كبيرة في هذا المجال. قد تكون طريقة تعويم السكر مناسبة عندما يكون الهدف هو اكتشاف جميع المراحل بما في ذلك النجوم المبكرة ، مثل موانئ الدخول ودور التعبئة. من المرجح أن توفر تصفية محلول السكر باستخدام غربال شبكي ناعم الكشف الأكثر دقة عن البيض واليرقات المبكرة11,12.
تعمل تقنيات MS و MSF بشكل جيد مع الفاكهة التي يمكن هرسها بسهولة وتحتوي على كمية كبيرة من اللب. تميل يرقات التيفريتيد إلى الحفر في لب الفاكهة ، مما يجعل الكشف البصري صعبا. يتمثل أحد الجوانب الحاسمة لطرق MS و MSF في فصل اليرقات عن اللب. تزيل عملية الغربلة اللب ، وبالتالي تعرض اليرقات على شاشات الغربال. وبالمثل ، فإن طريقة ماء السكر تفصل اليرقات عن اللب عن طريق جعل اليرقات تطفو ، بينما يغرق اللب في قاع المقلاة. يمكن ملاحظة اليرقات المنفصلة عن اللب بواسطة طرق MS أو MSF وهي تتحرك بسهولة على غربال الغربال أو سطح الماء. على الرغم من أن طريقة الهرس والغربلة والطفو الاختياري حسنت بشكل كبير من سرعة ودقة اكتشاف يرقات التيفريتيد في الفاكهة المضيفة المهمة ، فقد لا تكون العملية مناسبة لجميع الثمار. على سبيل المثال ، قد يكون من الأسهل معالجة الفاكهة المضيفة ذات اللب الصلب ، مثل الأفوكادو الأخضر أو الفاكهة ذات البذور / الحفرة الكبيرة وكمية صغيرة نسبيا من اللب ، مثل اللوز الاستوائي ، عن طريق القطع اليدوي والفحص البصري.
وجدنا أن طرق MS و MSF كانت أسرع عندما تمت معالجة عدد صغير نسبيا من الفاكهة (5-10). من المحتمل أن يكون الفرق أكبر إذا تمت معالجة كميات أكبر من الفاكهة ، والتي قد تكون ضرورية ونموذجية لبرامج ذبابة الفاكهة في حالات الطوارئ. أدت إزالة خطوة الطفو إلى زيادة سرعة الكشف دون المساس بدقة العثور على يرقات التيفريتيد الكبيرة (>3 مم). لقد أظهرنا أنه يمكن نقل هذه التقنيات إلى الميدان ، والتي تحاكي الظروف التي يمر بها العمال خلال برنامج ذبابة الفاكهة في حالات الطوارئ. تشير دراساتنا إلى أن طرق مرض التصلب العصبي المتعدد قد تسمح بالكشف في الوقت المناسب عن اليرقات المتأخرة والقضاء اللاحق على مجموعات تكاثر التيفريتيد. يمكن استخدام منظمة أطباء بلا حدود للكشف عن البويضات والنجوم المبكرة التي لا تستهدفها حاليا برامج الاستئصال.
Disclosures
يعلن أصحاب البلاغ أنه ليس لديهم تضارب في المصالح.
Acknowledgments
نود أن نشكر سيلفيا دوراند وتيري ألين وخوسيه أليجريا وأليخاندرا كانون على المساعدة في معالجة الجوافة في جامعة فلوريدا ، وريك كوراشيما ، وجان أوث ، وبروس إينافوكو للمساعدة في تقييم الفاكهة المصابة صناعيا في هاواي ، ومايكل ستولبرغ على التعليقات المفيدة على الإصدارات السابقة من المخطوطة. تم تمويل هذا المشروع جزئيا من قبل وزارة الزراعة الأمريكية APHIS واتفاقية التعاون بجامعة فلوريدا وبدعم جزئي من USDA-ARS (المشروع 2040-22430-027-00D). لم يتم نشر النتائج والاستنتاجات الواردة في هذا المنشور الأولي رسميا من قبل وزارة الزراعة الأمريكية ولا ينبغي تفسيرها على أنها تمثل أي قرار أو سياسة للوكالة. إن ذكر الأسماء التجارية أو المنتجات التجارية في هذا المنشور هو فقط لغرض توفير معلومات محددة ولا يعني توصية أو تأييد من قبل وزارة الزراعة الأمريكية. وزارة الزراعة الأمريكية هي مزود تكافؤ الفرص وصاحب العمل.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Anti foamer | MicroLubrol | ML200-50-4 | MicroLubrol 2000 Fluid Pure Silicone Oil, https://www.microlubrol.com |
| Brown Sugar | Dominos | 1 lb Box Dark Brown Sugar Crystals, https://www.dominosugar.com/products/dark-brown-sugar | |
| Cutting Boards | KitchenAid | KE703NOSMGA | KitchenAid Classic Nonslip Plastic Cutting Board, 12x18-Inch, https://www.amazon.com/KitchenAid-Classic-Nonslip-Plastic-11x14-Inch/dp/B09117L774/ref=sxin_24_ac_d_mf_brs?ac_md=2-1-S2l0Y2hlbkFpZA%3D%3D-ac_d_mf_brs_brs&content-id=amzn1.sym.1ad31f34-ba12-4dca-be4b-f62f7f5bb10d%3Aamzn1.sym.1ad31f34-ba12-4dca-be4b-f62f7f5bb10d&crid=UXMLNC72BL0 M&cv_ct_cx=cutting%2Bboards&keywords=cutting%2Bboards &pd_rd_i=B091118V8T&pd_rd_r= 4c48b4ad-4d4d-4b4b-8799-fc7313 2f8e34&pd_rd_w=li862&pd_rd_wg =KogbB&pf_rd_p=1ad31f34-ba12-4dca-be4b-f62f7f5bb10d&pf_rd_r=9ATJD6W QBF9DVRY889MP&qid=1673911 429&refresh=1&sprefix=cutting%2Bboards%2Caps%2C198&sr=1-2-8b2f235a-dddf-4202-bbb9-592393927392&th=1 |
| Dish Pans | Sterilite | 06578012 | White 12 qrt Dishpan, https://www.amazon.com/STERILITE-06578012-Sterilite-White-Dishpan/dp/B0039V2G5E/ref=sr_1_1?crid=2SMBMLFJF18U&keywords= white+12+qt+dishpan+sterilite&qid=1673911729&s=home -garden&sprefix=white+12+qr+dishpan+sterlite%2Cgarden%2C184&sr=1-1 |
| EthOH | Fisher Scientific | BP8202500 | Ethanol Solution 96%, Molecular Biology Grade, https://www.fishersci.com/shop/products/ethanol-solution-96-molecular-biology-grade-fisher-bioreagents/BP8202500 |
| Glass Vials | Fisher Scientific | 0333921H | Fisherbrand Class B Clear Glass Threaded Vials With Closures, https://www.fishersci.com/shop/products/class-b-clear-glass-threaded-vials-with-closures-packaged-separately/0333921H |
| Knives | Zyliss | 31380 | 5.25" Utility Knife, https://www.amazon.com/ZYLISS-Utility-Kitchen-5-5-Inch-Stainless/dp/B00421ATJK/ref=sr_1_7?crid=2U27KE1HTG5N1&keywords= fruit%2Bcutting%2Bknives&qid=1673911609&s= home-garden&sprefix=fruit%2Bcutting%2Bknives%2Cgarden%2C145&sr=1-7&th=1 |
| No. 20 Mesh sieves | Hogentogler & Co. Inc. | 4221 | U.S. Standard Testing Sieves, https://www.hogentogler.com/sieves/18-inch-sieves.asp |
| No. 45 Mesh sieves | Hogentogler & Co. Inc. | 4226 | U.S. Standard Testing Sieves, https://www.hogentogler.com/sieves/18-inch-sieves.asp |
| No. 8 Mesh sieves | Hogentogler & Co. Inc. | 4215 | U.S. Standard Testing Sieves, https://www.hogentogler.com/sieves/18-inch-sieves.asp |
| Soft Forceps | DR Instruments | DRENTF01 | DR Instruments Featherweight Entomology Forceps, https://www.amazon.com/DR-Instruments-DRENTF01-Featherweight-Entomology/dp/B008RBLO8Q |
| Zipper Lock Storage Bags | Ziploc | 682254 | Ziploc brand 2 gal Clear Freezer Bags, https://www.amazon.com/Ziploc-Freezer-Bag-Gallon-100/dp/B01NCDWR8A/ref=sr_1_1_sspa?crid=3SQFBT64Z76ES&keywords= ziploc+freezer+bags+2+gallon&qid=1674504602& |
References
- White, I. M., Elson-Harris, M. M. Fruit Files of Economic Significance: Their Identification and Bionomics. , CAB International. Wallingford, UK. (1992).
- Papadopoulos, N. T., Plant, R. E., Carey, J. R. From trickle to flood: the large-scale, cryptic invasion of California by tropical fruit flies. Proceedings of the Royal Society B: Biological Sciences. 280 (1768), 20131466 (2013).
- Suckling, D. M., et al. Eradication of tephritid fruit fly pest populations: outcomes and prospects. Pest Management Science. 72 (3), 456-465 (2016).
- Mcinnis, D. O., et al. Can polyphagous invasive tephritid pest populations escape detection for years under favorable climatic and host conditions. American Entomologist. 63 (2), 89-99 (2017).
- Mutamiswa, R., Nyamukondiwa, C., Chikowore, G., Chidawanyika, F. Overview of oriental fruit fly, Bactrocera dorsalis (Hendel) (Diptera: Tephritidae) in Africa: From invasion, bio-ecology to sustainable management. Crop Protection. 141, 105492 (2021).
- Steck, G., et al. Oriental fruit fly eradication in Florida 2015-2016: program implementation, unique aspects, and lessons learned. American Entomologist. 65 (2), 108-121 (2019).
- Alvarez, S., Evans, E., Hodges, A. W. Estimated costs and regional economic impacts of the oriental fruit fly (Bactrocera dorsalis) outbreak in Miami-Dade County, Florida. University of Florida Institute of Food and Agricultural Sciences Extension. , FE988 (2016).
- Gould, W. Probability of detecting Caribbean fruit fly (Diptera: Tephritidae) infestation by fruit dissection. Florida Entomologist. 73 (3), 502-507 (1995).
- Yee, W. L. Detection of Rhagoletis indifferens (Diptera: Tephritidae) larvae using brown sugar flotation and hot water methods. Journal of Applied Entomology. 136 (7), 549-560 (2012).
- Yee, W. L. Comparison of the brown sugar, hot water, and salt methods for detecting western cherry fruit fly (Diptera: Tephritidae) larvae in sweet cherry. Florida Entomologist. 97 (2), 422-430 (2014).
- Van Timmeren, S., Diepenbrock, L. M., Bertone, M. A., Burrack, H. J., Isaacs, R. A filter method for improved monitoring of Drosophila suzukii (Diptera: Drosophilidae) larvae in fruit. Journal of Integrated Pest Management. 8 (1), 23 (2017).
- Van Timmeren, S., Davis, A. R., Isaacs, R. Optimization of a larval sampling method for monitoring Drosophila suzukii (Diptera: Drosophilidae) in blueberries. Journal of Economic Entomology. 114 (4), 1690-1700 (2021).
- Balagawi, S., et al. Evaluation of brown sugar flotation for detecting Queensland and Mediterranean fruit fly (Diptera: Tephritidae) infestation in Australian cherries. Crop Protection. 151, 105823 (2022).
- CFIA (Canadian Food Inspection Agency). Directive D-02-04: The Blueberry Certification Program and domestic phytosanitary requirements to prevent the spread of blueberry maggot (Rhagoletis mendax) within Canada. 2 Revision 10. CFIA (Canadian Food Inspection Agency). , Ottawa, Canada. (2020).
- Kendra, P. E., et al. Gas chromatography for detection of citrus infestation by fruit fly larvae (Diptera: Tephritidae). Postharvest Biology and Technology. 59 (2), 143-149 (2011).
- SAS Institute Inc. SAS 9.4 Guide to Software Updates and Product Changes. SAS Institute Inc. , (2013).
