Summary
Burada sunulan yöntem, reaktiflerin anjiyogenez veya vasküler geçirgenlik üzerindeki etkisini in vivo boyamadan değerlendirebilir. Yöntem, neo-damarları veya vasküler sızıntıyı görselleştirmek için kuyruk damarı yoluyla dekstran-FITC enjeksiyonunu kullanır.
Abstract
İn vivo anjiyogenezi araştırmak için çeşitli modeller geliştirilmiştir. Bununla birlikte, bu modellerin çoğu karmaşık ve pahalıdır, özel ekipman gerektirir veya sonraki nicel analizler için gerçekleştirilmesi zordur. Burada, in vivo anjiyogenezi değerlendirmek için modifiye edilmiş bir matris jel tıkaç testi sunuyoruz. Bu protokolde, vasküler hücreler pro-anjiyojenik veya anti-anjiyojenik reaktiflerin varlığında veya yokluğunda matriks jel ile karıştırıldı ve daha sonra deri altından alıcı farelerin arkasına enjekte edildi. 7 gün sonra, dekstran-FITC içeren fosfat tampon salin kuyruk damarı yoluyla enjekte edilir ve 30 dakika boyunca damarlarda dolaştırılır. Matris jel tıkaçları toplanır ve doku gömme jel ile gömülür, daha sonra lekelenmeden floresan tespiti için 12 μm'lik bölümler kesilir. Bu tahlilde, yüksek moleküler ağırlığa (~ 150.000 Da) sahip dekstran-FITC, uzunluklarını tespit etmek için fonksiyonel damarları belirtmek için kullanılabilirken, düşük moleküler ağırlığa (~ 4.400 Da) sahip dekstran-FITC, neo-damarların geçirgenliğini belirtmek için kullanılabilir. Sonuç olarak, bu protokol in vivo anjiyogenezin kantitatif çalışması için güvenilir ve uygun bir yöntem sağlayabilir.
Introduction
Önceden var olan damarlardan neo-damarların oluşum süreci olan anjiyogenez, embriyonik gelişim, yara iyileşmesi, ateroskleroz, tümör gelişimi vb. gibi birçok fizyolojik ve patolojik süreçte kritik bir rol oynar.1,2,3,4,5. Bu dinamik süreç, matrisin bozulması, vasküler hücre proliferasyonu, boru şeklindeki yapılar oluşturmak için göç ve kendi kendine örgütlenme ve neo-damarların stabilizasyonu dahil olmak üzere birkaç adımı içerir6. Anjiyogenezin teşvik edilmesinin miyokard enfarktüsü, inme ve diğer iskemik hastalıklarıntedavisinde kritik olduğu gösterilmiştir 7 anjiyogenezin inhibe edilmesi, kanserlerin8 ve romatizmal hastalıklarıntedavisinde umut verici bir strateji olarak kabul edilmiştir 9. Anjiyogenez, ilaç keşfi için düzenleyici bir ilke olarak kabul edilmiştir10. Bu nedenle, anjiyogenezin derecesini değerlendirmek için güvenilir ve uygun bir yöntemin oluşturulması, anjiyogeneze bağlı hastalıklarda mekanik araştırma veya ilaç keşfi için kritik öneme sahiptir.
Anjiyogenezi değerlendirmek için çeşitli in vitro ve in vivo modeller geliştirilmiştir11. Bunlar arasında, matris jel tüp oluşum deneyi12 gibi iki boyutlu (2-D) modeller, fonksiyonel boru şeklinde yapılar oluşturamaz. Arka bacak iskemi modeli13,14 gibi hayvan modelleri, anjiyogenez sürecini yeniden üretebilir, ancak karmaşıktır ve bir lazer benek kan akışı görüntüleme sistemi gerektirir. Matris jel tıkaç testi gibi vasküler morfogenezin 3D modelleri, in vivo15 anjiyogenez sürecini taklit edebilen basit bir platform sağlar, ancak anjiyogenezin saptanması, değişken ve kötü görselleştirilmiş immünohistokimya veya immünofloresan boyama 16,17,18 gerektirir.
Burada, vasküler hücrelerin matriks jel ile karıştırıldığı ve bir tıkaç oluşturmak için farelerin arkasına deri altına enjekte edildiği modifiye edilmiş bir matris jel tıkacı testi için bir protokol açıklıyoruz. Tıkaçta, vasküler hücrelerin matrisi bozması, çoğalması, göç etmesi ve nihayet iç ortamda kan akışı olan fonksiyonel damarlar oluşturmak için kendi kendini organize etmesi gerekir. Daha sonra, floresan etiketli dekstran, tıkaçtan akmak için kuyruk damarı yoluyla enjekte edilir ve etiket, neo-damarları belirtmek için görselleştirilir. Anjiyogenez içeriği, damarların uzunluğu ile kantitatif olarak değerlendirilebilir. Bu yöntem, 2 boyutlu anjiyogenez modellerinde12 üretilemeyen fonksiyonel damarlar oluşturabilir ve sıradan matris jel tıkaç testinde11 olduğu gibi karmaşık boyama işlemine ihtiyaç duymaz. Ayrıca arka ekstremite iskemisi model13,14,19'da lazer benek kan akışı görüntüleme sistemi gibi pahalı özel aletler gerektirmez. Bu yöntem çok yönlü, düşük maliyetli, ölçülebilir ve gerçekleştirilmesi kolaydır ve ilaçların pro- veya anti-anjiyojenik kapasitesini belirlemek için kullanılabilir veya anjiyogenezde yer alan mekanik araştırmalarda kullanılabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Hayvan denekleri içeren tüm prosedürler, Wenzhou Tıp Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi (IACUC) tarafından onaylanmıştır (XMSQ2021-0057, 19 Temmuz 2021). Tüm reaktifler ve sarf malzemeleri Malzeme Tablosunda listelenmiştir.
1. Kültür ortamının hazırlanması
- 10x M199 kültür ortamı: M199 tozunu 90 mL deiyonize su ile 10x konsantrasyona çözün ve 10 mL fetal sığır serumu (FBS) ekleyin, ardından 0.22 μm'lik bir filtreden geçirin. Ortamı 4 °C'de 2 aya kadar saklayın.
- Tam endotel kültür ortamı: 460 mL endotel hücre ortamına (ECM) 50 mL FBS, 5 mL penisilin / streptomisin ve 5 mL endotel hücre büyüme takviyesi ekleyin. Ortamı 4 °C'de 1 aya kadar saklayın.
2. Vasküler hücre hazırlığı
- Kültür 1 x 105 vasküler hücreler (primer kültürlenmiş endotelyal progenitör hücreler14, endotel hücreleri veya endotel hücre hatları) 37 ° C'de 100 mm doku kültürü kabında 8 mL tam endotel kültürü ortamı ve% 5 CO2 ila% 70 birleşme.
- Kültür ortamını çıkarın ve bağlanmamış hücreleri ve kalıntıları gidermek için kabı 2x 1x fosfat tamponlu salin (PBS) ile durulayın. PBS'yi çıkarın ve 2.21 mM EDTA içeren 3 mL% 0.25 tripsin ekleyin ve 37 ° C'de 1 dakika inkübe edin.
- Tripsini 7 mL tam endotel kültürü ortamı ile nötralize edin ve hücreleri kültür kabından nazikçe durulayın. Işık mikroskobu altında hücre ayrılmasını onaylayın (40x büyütme).
- Hücre süspansiyonunu 15 mL'lik bir tüpte toplayın ve 10 dakika boyunca 400 x g'da santrifüjleyin. Süpernatanı çıkarın ve hücreleri 5 mL tam endotel kültürü ortamı ile yeniden süspanse edin.
- Bir hemositometre kullanarak hücreleri sayın ve 2 x 106 hücre içeren süspansiyonu steril 1.5 mL'lik bir tüpe taşıyın. Her fiş 1,5 x 106 hücre içerir, atık durumunda ek% 25 hücre kullanılır. Her grup en az 3 fiş içerir.
NOT: Denemelerden sonra, 300 μL matris jel içindeki 1.5 x 106 hücrenin anjiyogenezin uygun şekilde gelişmesine yol açtığı ve bu nedenle deney için seçildiği bulundu. - Pelet hücrelerine 5 dakika boyunca 400 x g'da hücre süspansiyonunu santrifüjleyin ve ardından süpernatanı çıkarın.
3. Matris jel hazırlama
- Hücre peleti içeren steril 1,5 mL'lik tüpleri 4 °C'lik bir su banyosunda önceden soğutun. 30G 1 mL insülin şırıngalarını 4 °C buzdolabında önceden soğutun.
- Matriks jeli 4 °C su banyosunda tamamen çözdürün. Karıştırmayın veya girdap yapmayın. 10x M199'u önceden soğutun ve 4 °C'lik bir su banyosunda reaktifi/ilgilenilen ilacı test edin.
- Önceden soğutulmuş matris jeli, %10 FBS içeren 10x M199 ile ve test edilecek reaktifi 8.8:1:0.2 hacim oranında karıştırarak %1 FBS ve reaktif içeren bir matris jeli ve M199 karışımı elde edin.
- Hücreleri 400 μL matris jel karışımı ile yeniden süspanse edin, kabarcık oluşumunu önlemek için hafifçe karıştırın. Fareler enjeksiyon için hazırlanana kadar tüpü buz üzerinde tutun. Pıhtılaşmayı önlemek için matris jel karışımını her zaman buz üzerinde tutun.
NOT: Burada, jel tıkacı oluşturmak için 1.5 x 106 hücre içeren 300 μL matris jel karışımı kullanılmıştır. 2. adımda% 25 ek hücrelere göre% 25 ekstra jel hazırlayın.
4. Fare hazırlığı
- 6-8 haftalık erkek Nu / Nu faresini (18-25 g) hayvan anestezi cihazının haznesinde izofluran (1 L / dak akış hızında% 100 oksijende% 3 izofluran) ile uyuşturun. Başarılı bir anesteziden sonra, düzeltme refleksi ve ayak parmağı sıkıştırma refleksinin yokluğu ile onaylanan fareyi odadan çıkarın, fareyi odadan çıkarın ve fareye bir anestezi maskesi koyun ve izofluran konsantrasyonunu 1 L / dak akış hızında% 100 oksijende% 1.5'e değiştirin.
NOT: Prosedür boyunca bir ısıtma yastığı kullanarak hayvana termal destek sağlayın. - Kuruluğu önlemek için gözlerde veteriner merhemi kullanın. Farelerin uzuvlarını yüzüstü pozisyonda ameliyat panosuna bantlayın.
5. Matris jel karışımı enjeksiyonu
- 300 μL matris jel karışımını 30G iğneli 1 mL'lik bir insülin şırıngasına yükleyin. Kabarcık oluşumundan kaçının. Bu süre zarfında katılaşmayı önlemek için matris jeli (2 dakika içinde) hızla yükleyin. Matriks jel yüklü insülin şırıngasını hemen buzun üzerine yerleştirin.
- %75 alkollü pedler kullanarak farelerin arkasındaki cildi temizleyin. Deri altından 300 μL matris jel karışımını farelerin sırtının bir tarafına enjekte edin.
- Matris jel karışımının sızmasını önlemek için iğneyi enjeksiyon bölgesinden yavaşça çıkarın. Enjeksiyon bölgesinde küçük bir kambur olup olmadığını kontrol edin (Şekil 1).
- Matris jel karışımının pıhtılaşmasını ve tıkaç oluşturmasını sağlamak için fareyi 2 dakika boyunca ısıtma yastığının üzerine yerleştirin.
- 5.2 adımlarını tekrarlayın. 5.4'e kadar. oluşturmak için Farenin arkasının diğer tarafında fiş. Bir işaretleyici kalem kullanarak tümseklerin kenarlarını işaretleyin.
- Sternal yaslığı korumak için yeterli bilinci yeniden kazanana kadar fareyi gözlemleyin. Tamamen iyileşene kadar fareyi ayrı bir kafese koyun. Fareleri SPF sınıfı deney hayvanı laboratuvarında 22 ± 2 °C'de 7 gün boyunca 12 saatlik bir aydınlık/karanlık döngüsüyle barındırın.
6. Kuyruk damarından Dextran-FITC enjeksiyonu
- 7 günlük matris jel enjeksiyonundan sonra, 0.5 mg dekstran-FITC'yi 500 μL çift damıtılmış su (ddH2O) ile yeniden süspanse edin ve ardından 1 μg / μL'lik son konsantrasyonda dekstran-FITC çözeltisini elde etmek için şiddetli bir şekilde girdap yapın.
NOT: Anjiyogenez testi için ~ 150 kDa moleküler ağırlığa sahip dekstran-FITC kullanın ve vasküler geçirgenlik testi için ~ 4 kDa moleküler ağırlığa sahip dekstran-FITC kullanın. - 29G şırıngalara 50 μL dekstran-FITC solüsyonu yükleyin.
- Fareyi kuyruk damarı enjeksiyon aletine sabitleyin. Kuyruğu %75 alkollü pamuk topuyla temizleyin ve kuyruk damarından nazikçe 50 μL dekstran-FITC enjekte edin.
- Kanamayı durdurmak için enjeksiyon bölgesini pamuklu çubukla 1 dakika sıkıştırın ve ardından fareleri 30 dakika boyunca kafese geri koyun.
- 6.3 adımlarını tekrarlayın. ve 6.4. tüm fareler dekstran-FITC enjeksiyonu alana kadar.
7. Matris jel tapa toplama
- İntraperitoneal olarak PBS'de% 1 pentobarbital sodyum (200 mg / kg vücut ağırlığı) enjekte edin ve fareleri IACUC onaylı bir prosedürle ötenazi yapın.
- Cerrahi makas kullanarak cildi tıkacın işaretli kenarı boyunca kesin ve matris jel tapasının üzerindeki cildi çıkarın.
- Tapayı toplayın ve fazla kanı yıkamak için 1x PBS'li küçük bir beherde durulayın (Şekil 2A). Tıkaç rengi, kan bolluğunun derecesini ve neo-damarların içeriğini kabaca tanımlayabilir (Şekil 3A).
8. Gömme matris jel tapası ve bölüm hazırlığı
- Doku gömme kasetinin düğmesini yaklaşık 0.5 mL doku gömme jeli ile kapatın, ardından matris jel tapasını hemen Şekil 2B'de gösterildiği gibi istenen yönde doku gömme jelinin üzerine yerleştirin. Ardından, fişi ek doku gömme jeli ile gömün.
- Kasetleri katılaşması için -80 °C'lik bir dondurucuya 12 saat koyun.
- Kalın kesit hazırlığı için, katılaşmış tapa bloğunu çıkarın ve talimata göre dondurucu mikrotomu kullanarak 12 μm kalınlığındaki kesitleri kesin ve mikroskop lamlarına monte edin.
- Her fiş bloğundan 5-10 bölüm dilimleyin.
9. Anjiyogenezin miktar tayini (Şekil 3)
- 10x büyütme altında 488 nm dalga boyunda ters çevrilmiş floresan mikroskobu ile kesitin 5 bağımsız alanından floresan görüntüler elde edin.
- Görüntü dosyasını Image J yazılımı (https://imagej.en.softonic.com/) ile açın ve Angiogenesis Analyze (Anjiyogenez Analizi ) düğmesine tıklayın. Ardından, HUVEC Faz Kontrastını Analiz Et düğmesine tıklayın ve bilgi toplamak için İstatistik Sonuçları Tablosuna geçin. Her bölüm için elde edilen 5 floresan görüntünün tümünü ölçün.
- Bu gruplar arasındaki anjiyogenez farkını istatistiksel olarak değerlendirmek için farklı gruplardan neo-damarların toplam uzunluğunu analiz edin.
NOT: Toplam ana segment uzunluğu, neo-gemilerin toplam uzunluğunu gösterir. Neo-damarların uzunluğunu artıran reaktif pro-anjiyojenik olarak adlandırılırken, neo-damarların uzunluğunu azaltan reaktif anti-anjiyojeniktir.
10. Vasküler geçirgenliğin ölçülmesi (Şekil 4)
- 20x büyütme altında 488 nm dalga boyunda ters çevrilmiş floresan mikroskobu ile kesitin 5 bağımsız alanından floresan görüntüler elde edin.
- Görüntü dosyasını Image J yazılımıyla açın. Serbest El Seçimi düğmesine tıklayın ve sızıntı alanını daire içine alın, ardından Analiz menüsüne tıklayın ve sızıntı alanının alan bilgilerini almak için Ölç seçeneğini seçin. Vasküler geçirgenliği belirtmek için sızıntı alanı ve görüntü alanı oranını kullanın.
- Bu gruplar arasındaki vasküler geçirgenlik farkını istatistiksel olarak değerlendirmek için farklı gruplardan sızıntı alanı ve görüntü alanı oranını analiz edin.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Şekil 1 , matris jeli, vasküler hücreler, kültür ortamı ve reaktif karışımının nasıl hazırlanacağını gösteren akış şemasıdır. Karışım daha sonra deri altından Nu / Nu farelerinin arkasına enjekte edildi ve sonunda jel tıkacı oluşturmak için pıhtılaşmasını hızlandırmak için bir ısıtma yastığı kullanılarak ısıtıldı.
Şekil 2A , floresan etiketli dekstran içeren kapları gösteren akış şemasıdır. Floresan etiketli dekstran, kuyruk damarı ve daire yoluyla 30 dakika boyunca enjekte edildi, böylece jel tıkacındaki fonksiyonel kaba girebildi. Daha sonra, jel tıkaçları toplandı, doku gömme jel kullanılarak gömüldü (matris jelin gömüldüğünde oryantasyonu Şekil 2B'de gösterilmiştir). Tıkaçlardan 12 μm kalınlığında bir kesit dilimlendi (her iki taraftan 5 dilim) ve anjiyogenez ve/veya vasküler geçirgenliğin kantitatif analizi için floresan resimler çekildi.
Şekil 3 , anti-anjiyojenik reaktif palmitat ve pro-anjiyojenik reaktif fibroblast büyüme faktörü 1'in (FGF1) jel tıkacındaki anjiyogenez üzerindeki etkisidir. Şekil 3A , araç, palmitat veya FGF1 ile jel tapaların görünümüdür. Kan, jel tıkacındaki fonksiyonel neo-damara girebilir, bu da tıkacı değişen derecelerde kırmızı yapar. Şekil 3B , fonksiyonel damarların yüksek moleküler ağırlıklı dekstran-FITC ile görselleştirildiği matris jel tıkaçlarının floresan görüntüsüdür. Şekil 3C , farklı gruptaki damar uzunluğunun nicel sonucudur. Palmitat, neo-damarların uzunluğunu önemli ölçüde azaltabilirken, FGF1 tedavisi açıkça uzunluğu artırabilir.
Şekil 4 , vasküler endotelyal büyüme faktörü (VEGF) tedavisi olan veya olmayan jel tıkaçlardaki vasküler geçirgenliği karşılaştırmaktadır. Şekil 4A , sızıntı alanının düşük moleküler ağırlıklı dekstran-FITC ile görselleştirildiği ve oklarla gösterildiği matris jel tıkaçlarının floresan görüntüsüdür. Şekil 4B , sızıntı alanının nicel sonucudur. VEGF tedavi grubunda artan kaçak alanı, VEGF'nin vasküler geçirgenliği artırabildiğini ortaya koydu.
Şekil 1. Farelerde jel tıkacı oluşumunu gösteren akış şeması. Tek tabakalı kültürde kültürlenen vasküler hücreler ayrıştırılır, peletlenir, endotel hücre ortamı (ECM) ile yeniden süspanse edilir ve sayılır (I-IV). Matris jel karışımında (8.8 hacim matris jel, %10 FBS ve 0.2 hacim reaktif ile desteklenmiş 1 hacim 10x M199 içeren) peletleme ve yeniden süspansiyondan sonra, 300 μL jel karışımı deri altından farelerin arkasına enjekte edildi (V-VII) tıkaçlar oluşturmak için. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2. Dekstran-FITC enjeksiyonunu ve anjiyogenezin miktar tayinini gösteren akış şeması. (A) Dekstran-FITC kuyruk veni (I) yoluyla enjekte edildi. 30 dakika sonra jel tıkaç alındı, gömüldü ve donma mikrotomu (II, III) kullanılarak kesitler kesildi. Daha sonra floresan mikroskop (IV) kullanılarak floresan görüntüler alındı ve anjiyogenez Image J yazılımı (V) kullanılarak kantitatif olarak analiz edildi. (B) Doku gömme kasetine gömüldüğünde matris jel tıkaç oryantasyon diyagramı. Kısaltmalar: OCT = optimum kesme sıcaklığı bileşiği. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3. Modifiye matris jel tıkaç testi kullanılarak anjiyogenezin değerlendirilmesi. (A) Temsili matris jel tapalarının görünümü. (B) Dextran-FITC ile gösterilen matris jel tıkaçlarındaki fonksiyonel kapların floresan resmi. (C) Tek yönlü ANOVA kullanılarak matris jel tıkaçlarındaki fonksiyonel kapların uzunluğunun kantitatif analizi. *P<0.05 araca karşı; P<0.001 araca karşı. Ölçek çubuğu 100 μm'dir. Kısaltmalar: FGF1 = Fibroblast büyüme faktörü 1. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 4. Modifiye matris jel tıkaç testi kullanılarak vasküler geçirgenliğin değerlendirilmesi. (A) Jel tıkacındaki damarların temsili floresan görüntüsü, oklar sızıntı bölgesini gösterir. (B) Student t-testi kullanılarak vasküler geçirgenliği değerlendirmek için kaçak alanının kantitatif analizi. sayfa <0.001. Ölçek çubuğu 100 μm'dir. Kısaltmalar: VEGF = vasküler endotelyal büyüme faktörü. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Anjiyogenezin kantitatif değerlendirmesi için in vivo boyamadan güvenilir ve kullanışlı bir yöntem sunuyoruz. Bu protokolde, vasküler hücreler pro-anjiyojenik veya anti-anjiyojenik reaktifler varlığında matriks jel ile karıştırıldı ve daha sonra jel tıkacı oluşturmak için Nu/Nu farelerin arkasına deri altına enjekte edildi (Şekil 1). 7 günlük jel tıkacı oluşumundan sonra, dekstran-FITC intravenöz olarak enjekte edildi ve 30 dakika boyunca sirküle edildi. Jel tıkacı toplandı ve doku gömme jel ile gömüldü ve fotoğraf için 12 μm'lik kesitler dilimlendi (Şekil 2). Dextran-FITC, boyama olmadan fonksiyonel damarları gösterebilir ve neo-damarların uzunluğu, reaktiflerin pro-anjiyojenik veya anti-anjiyojenik fonksiyonunu kantitatif olarak değerlendirmek için kullanılabilir. Bu protokolde sunulan örnekte, palmitat tedavisi neo-damarların uzunluğunu azaltırken, FGF1 neo-damarların uzunluğunu arttırdı (Şekil 3), bu da palmitatın anti-anjiyojenik olduğunu, FGF1'in ise pro-anjiyojenik olduğunu gösterdi. Bunun yanı sıra, bu protokol vasküler geçirgenliğin değerlendirilmesinde de kullanılabilir (Şekil 4).
Alıcı farelerin seçimi, matris jelin taşınması ve enjekte edilmesi, jel tıkacının toplanması ve damarların uzunluğunun tespit edilmesi konusunda dikkatli olunmalıdır. 6-8 haftalık immün yetmezliği olan fareler önerilir, ancak C57BL / 6 fareler de uygulanabilir. Fişteki değişkenlik göz önüne alındığında, her grupta 3-5 fiş önerilir. Vasküler hücrelerin sayısı farklı gruplar arasında eşit olmalıdır. Matris jel, talimatlara göre dikkatli bir şekilde kullanılmalı ve katılaşmışsa veya partikül madde veya çok sayıda kabarcık içeriyorsa kullanılmamalıdır. Matris jel hazırlama adımında, matris jelin nihai konsantrasyonu %80'den az olmamalıdır ve kabarcıklar oluşabileceğinden girdaba izin verilmez. Jel tapanın şeklinin sonuçların tekrarlanabilirliğini etkileyebileceğine dikkat edilmelidir, bu nedenle matris jel tapasının katılaşmasını hızlandırmak için ısıtma yastığı kullanılmıştır. 37 °C'lik bir hayvan kuluçka makinesi de kullanılabilir. Bunun yanı sıra, jel tıkaç gömme ve kesit hazırlama sırasında, tapalar ve bölümler parlak ışığa karşı korunmalı ve fotoğraflar mümkün olan en kısa sürede floresan mikroskobu altında çekilmelidir.
Çeşitli in vivo anjiyogenez testleri arasında, matris jel tıkaç testi, çok yönlü, daha az maliyetli ve gerçekleştirilmesi kolay olduğu için en yaygın kullanılan yöntemlerden biridir11. Bununla birlikte, sıradan matris jel tıkaç tahlilinde boyama işlemi hataya açıktır. Fiş kırılgandır ve yüksek su içeriğine sahiptir. Boyama işlemine dahil edilen dehidrasyon ve fiksasyon adımları, jel tıkacını bozabilir ve damarların uzunluğunun değerlendirilmesini daha da etkileyebilir. Bunun yanı sıra, tıkaçtaki dağınık vasküler hücreler boyanabilir ve sıradan matris jel tıkaç tahlilinde fonksiyonel damarlar olarak tanınabilir. Bu modifiye matris jel tıkaç testinin en önemli avantajlarından biri, fonksiyonel damarların lekelenmeden görselleştirilebilmesidir. Damarları belirtmek için FITC etiketli dekstran kullanıldı ve sadece kan akışına sahip fonksiyonel damarlar gösterilebilir, bu da bu testin rahatlığına ve güvenilirliğine katkıda bulunur.
Neo-damarların uzunluğunun yanı sıra, geçirgenlik neo-damarların işlevini de etkiler20. Düşük moleküler ağırlıklı (~4.400 Da) floresan etiketli dekstran, damarlardaki boşluktan geçebilir ve neo-damarların geçirgenliğini belirtmek için kullanılabilir. Gerekirse, araştırmacılar hem düşük moleküler ağırlıklı floresan etiketli dekstran hem de yüksek moleküler ağırlıklı21 kullanarak aynı jel tıkacında hem anjiyogenezi hem de vasküler geçirgenliği değerlendirebilirler.
Anjiyogenez, diyabet 13,14,19 vb. gibi in vivo ortamdan22 etkilenebilir. Bu in vivo ortamın bu in vitro modellerde yeniden üretilmesi zordur. Bununla birlikte, bu değiştirilmiş protokolde, in vivo ortam, uygun alıcı fareler seçilerek kolayca çoğaltılabilir. Bunun yanı sıra, farklı vasküler hücreler arasındaki etkileşim de anjiyogenez sürecini etkiler. Endotel hücreleri, düz kas hücreleri ve perisitler dahil olmak üzere farklı vasküler hücreler, farklı vasküler hücrelerin anjiyogenezdeki katkısını araştırmak için bu protokolde tıkaçta neo-damarlar oluşturmak için eklenebilir.
Ancak, bu yöntem için bazı sınırlamalar da vardır. Neo-damarların oluşumu jel tıkacının şeklinden etkilenebilir. Dahası, jel tıkacında oluşan neo-damarlar eşit değildir. Jel tapasının kenarında, merkezdekinden daha işlevsel damarlar vardır (Şekil 2A). Bu nedenle, sonuçlar icracının yeterliliğinden etkilenebilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar herhangi bir çıkar çatışması beyan etmezler.
Acknowledgments
Bu çalışma, Zhejiang Eyaleti Doğa Bilimleri Vakfı (LY22H020005) ve Çin Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı (81873466) tarafından finanse edilmiştir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Adhesion Microscope Slides | CITOTEST | 188105 | |
| Anesthesia System | RWD | R640-S1 | |
| Cell Counter | Invitrogen | AMQAX1000 | |
| Cell Culture Dish | Corning | 430167 | |
| Cryoslicer | Thermo Fisher | CryoStar NX50 | |
| Dextrans-FITC-150kDa | WEIHUA BIO | WH007N07 | |
| Dextrans-FITC-4kDa | WEIHUA BIO | WH007N0705 | |
| Embedding Cassettes | CITOTEST | 80203-0007 | |
| Endothelial Cell Medium | ScienCell | 35809 | |
| Endothelial Growth Supplements | ScienCell | 1025 | |
| Fetal Bovine Serum | Gibco | 10100147C | |
| Fibroblast Growth Factor 1 | AtaGenix | 9043p-082318-A01 | FGF1 |
| Fluorescence Microscope | Nikon | ECLIPSE Ni | |
| Heating Pad | Boruida | 30-50-30 | |
| Insulin Syringe | BD | 300841 | |
| Isoflurane | RWD | R510-22-10 | |
| Laboratory Balance | Sartorius | BSA124S-CW | |
| Matrigel | Corning | 356234 | Matrix gel |
| Medium 199 powder | Gibco | 31100-035 | |
| Microtubes | Axygen | MCT-150-C | |
| Optimal Cutting Temperature (OCT) Compound | SUKURA | 4583 | Tissue embedding gel |
| Palmitate Acid | KunChuang | KC001 | |
| Penicillin-Streptomycin Liquid | Solarbio | P1400 | |
| Phosphate Buffer Saline | Solarbio | P1022 | |
| Surgical Instruments | RWD | RWD | |
| Tail Vein Injection Instrument | KEW BASIS | KW-XXY | |
| Trypsin-EDTA Solution | Solarbio | T1320 | |
| Ultra-Low Temperature Freezer | eppendorf | U410 | |
| Vascular Endothelial Growth Factor | CHAMOT | CM058-5HP | VEGF |
References
- Bikfalvi, A. History and conceptual developments in vascular biology and angiogenesis research: a personal view. Angiogenesis. 20 (4), 463-478 (2017).
- Carmeliet, P., Jain, R. Principles and mechanisms of vessel normalization for cancer and other angiogenic diseases. Nature reviews Drug discovery. 10 (6), 417-427 (2011).
- De Palma, M., Biziato, D., Petrova, T.
- Griffioen, A., Molema, G. Angiogenesis: potentials for pharmacologic intervention in the treatment of cancer, cardiovascular diseases, and chronic inflammation. Pharmacological reviews. 52 (2), 237-268 (2000).
- Viallard, C., Larrivée, B. Tumor angiogenesis and vascular normalization: alternative therapeutic targets. Angiogenesis. 20 (4), 409-426 (2017).
- Craig, M., Sumanas, S. ETS transcription factors in embryonic vascular development. Angiogenesis. 19 (3), 275-285 (2016).
- Losordo, D., Dimmeler, S. Therapeutic angiogenesis and vasculogenesis for ischemic disease. Part I: angiogenic cytokines. Circulation. 109 (21), 2487-2491 (2004).
- Folkman, J. Anti-angiogenesis-new concept for therapy of solid tumors. Annals of Surgery. 175 (3), 409-416 (1972).
- Folkman, J. Angiogenesis in cancer, vascular, rheumatoid and other disease. Nature Medicine. 1 (1), 27-31 (1995).
- Folkman, J. Opinion - Angiogenesis: an organizing principle for drug discovery. Nature Reviews Drug Discovery. 6 (4), 273-286 (2007).
- Nowak-Sliwinska, P., et al. Consensus guidelines for the use and interpretation of angiogenesis assays. Angiogenesis. 21 (3), 425-532 (2018).
- Fan, X., et al. Interleukin-1β augments the angiogenesis of endothelial progenitor cells in an NF-κB/CXCR7-dependent manner. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 24 (10), 5605-5614 (2020).
- Dai, X., et al. Nrf2 transcriptional upregulation of IDH2 to tune mitochondrial dynamics and rescue angiogenic function of diabetic EPCs. Redox Biology. 56, 102449 (2022).
- Yan, X., et al. Liraglutide Improves the Angiogenic Capability of EPC and Promotes Ischemic Angiogenesis in Mice under Diabetic Conditions through an Nrf2-Dependent Mechanism. Cells. 11 (23), 3821 (2022).
- Koh, W., Stratman, A., Sacharidou, A., Davis, G. In vitro three dimensional collagen matrix models of endothelial lumen formation during vasculogenesis and angiogenesis. Methods in enzymology. 443, 83-101 (2008).
- Nowak-Sliwinska, P., et al. Consensus guidelines for the use and interpretation of angiogenesis assays. Angiogenesis. 21 (3), 425-532 (2018).
- Malinda, K. In vivo matrigel migration and angiogenesis assay. Methods in molecular biology (Clifton, NJ). , 287-294 (2009).
- Rezzola, S., et al. In vitro and ex vivo retina angiogenesis assays. Angiogenesis. 17 (3), 429-442 (2014).
- Dai, Q., et al. FGF21 promotes ischaemic angiogenesis and endothelial progenitor cells function under diabetic conditions in an AMPK/NAD+-dependent manner. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 25 (6), 3091-3102 (2021).
- Gavard, J., Gutkind, J. S. VEGF controls endothelial-cell permeability by promoting the beta-arrestin-dependent endocytosis of VE-cadherin. Nature cell biology. 8 (11), 1223-1234 (2006).
- Birdsey, G. M., et al. The endothelial transcription factor ERG promotes vascular stability and growth through Wnt/β-catenin signaling. Developmental Cell. 32 (1), 82-96 (2015).
- Yan, X., et al. A Novel CXCR4 antagonist enhances angiogenesis via modifying the ischaemic tissue environment. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 21 (10), 2298-2307 (2017).
