Microdialisi intradermica: un approccio per studiare nuovi meccanismi di disfunzione microvascolare nell'uomo
Summary
La microdialisi intradermica è una tecnica minimamente invasiva utilizzata per studiare la funzione microvascolare in salute e malattia. Sia i protocolli dose-risposta che quelli di riscaldamento locale possono essere utilizzati per questa tecnica per esplorare i meccanismi di vasodilatazione e vasocostrizione nella circolazione cutanea.
Abstract
La vascolarizzazione cutanea è un tessuto accessibile che può essere utilizzato per valutare la funzione microvascolare nell’uomo. La microdialisi intradermica è una tecnica mini-invasiva utilizzata per studiare i meccanismi della muscolatura liscia vascolare e della funzione endoteliale nel circolo cutaneo. Questa tecnica consente la dissezione farmacologica della fisiopatologia della disfunzione endoteliale microvascolare come indicizzata dalla diminuzione della vasodilatazione mediata dall’ossido nitrico, un indicatore del rischio di sviluppo di malattie cardiovascolari. In questa tecnica, una sonda per microdialisi viene posizionata nello strato dermico della pelle e un’unità di riscaldamento locale con una sonda di flusso laser Doppler viene posizionata sopra la sonda per misurare il flusso di globuli rossi. La temperatura cutanea locale viene bloccata o stimolata con l’applicazione diretta di calore e gli agenti farmacologici vengono perfusi attraverso la sonda per stimolare o inibire le vie di segnalazione intracellulari al fine di indurre vasodilatazione o vasocostrizione o per interrogare meccanismi di interesse (cofattori, antiossidanti, ecc.). Viene quantificata la conduttanza vascolare cutanea e possono essere delineati i meccanismi di disfunzione endoteliale negli stati patologici.
Introduction
Le malattie cardiovascolari (CVD) sono la principale causa di morte negli Stati Uniti1. L’ipertensione (HTN) è un fattore di rischio indipendente per ictus, malattia coronarica e insufficienza cardiaca e si stima che colpisca fino a ~ 50% della popolazione degli Stati Uniti2. L’HTN può svilupparsi come CVD indipendente (HTN primaria) o come risultato di un’altra condizione, come la malattia del rene policistico e/o disturbi endocrini (HTN secondario). L’ampiezza delle eziologie dell’HTN complica le indagini sui meccanismi sottostanti e sul danno d’organo terminale osservato con l’HTN. Sono necessari approcci di ricerca diversi e nuovi nella fisiopatologia del danno d’organo terminale associato all’HTN.
Uno dei primi segni patologici di CVD è la disfunzione endoteliale, caratterizzata da una compromissione della vasodilatazione mediata dall’ossido nitrico (NO) 3,4,5. La dilatazione flusso-mediata è un approccio comune utilizzato per quantificare la disfunzione endoteliale associata a CVD, ma la disfunzione endoteliale nei letti microvascolari può essere sia indipendente che precursore di quella delle grandi arterie del condotto 6,7,8. Inoltre, le arteriole di resistenza sono più direttamente influenzate dal tessuto locale rispetto alle arterie del condotto e hanno un controllo più immediato sulla consegna di sangue ricco di ossigeno. La funzione microvascolare è predittiva della sopravvivenza libera da eventi cardiovascolariavversi 9,10,11. La microvascolarizzazione cutanea è un letto vascolare accessibile che può essere utilizzato per esaminare le risposte a stimoli fisiologici e farmacologici vasocostrittori o vasodilatatori. La microdialisi intradermica è una tecnica mini-invasiva, il cui obiettivo è quello di indagare i meccanismi sia della muscolatura liscia vascolare che della funzione endoteliale nella microvascolarizzazione cutanea con dissezione farmacologica mirata. Questo metodo contrasta con altre tecniche, come l’iperemia reattiva post-occlusiva, che non consente la dissezione farmacologica, e la ionoforesi, che consente la veicolazione farmacologica ma è meno precisa nel suo meccanismo d’azione (esaminata in modo approfondito altrove12).
La logica alla base dello sviluppo e dell’uso di questa tecnica è ampiamente esaminata altrove13. Questo approccio è stato originariamente sviluppato per l’uso nella ricerca neurologica nei roditori e poi è stato applicato per la prima volta all’uomo per studiare i meccanismi alla base della vasodilatazione attiva da un punto di vista termoregolatorio. Alla fine degli anni ’90, questo metodo è stato utilizzato per esaminare sia i meccanismi neurali che quelli endoteliali per quanto riguarda il riscaldamento locale della pelle. Da quel momento, la tecnica è stata utilizzata per studiare una serie di meccanismi di segnalazione neurovascolare nella pelle.
Utilizzando questa tecnica, il nostro gruppo e altri hanno interrogato i meccanismi della disfunzione endoteliale nella microvascolarizzazione di diverse popolazioni cliniche, tra cui, ma non solo, dislipidemia, invecchiamento primario, diabete, malattia renale cronica, sindrome dell’ovaio policistico, preeclampsia, disturbo depressivo maggiore 14,15,16,17,18,19 e ipertensione 20,21,22,23,24. Ad esempio, uno studio precedente ha rilevato che le donne normotese con una storia di preeclampsia, che sono a maggior rischio di CVD, avevano una riduzione della vasodilatazione NO-mediata nella circolazione cutanea rispetto alle donne con una storia di gravidanza normotesa20. In un altro studio, gli adulti con diagnosi di HTN primaria hanno dimostrato una maggiore sensibilità all’angiotensina II nella microvascolarizzazione rispetto ai controlli sani21 e la farmacoterapia antipertensiva cronica donatrice di sulfidrile nei pazienti HTN primari ha dimostrato di ridurre la pressione sanguigna e migliorare sia la vasodilatazione mediata da idrogeno solfuro che quella mediata da NO22. Wong et al.23 hanno riscontrato una compromissione della vasodilatazione mediata sensorialmente e NO-mediata negli adulti preipertesi, in coincidenza con la nostra scoperta di una progressione della disfunzione endoteliale con l’aumento degli stadi HTN, come classificato dalle linee guida 2017 dell’American Heart Association e dell’American College of Cardiology24.
La tecnica di microdialisi intradermica consente indagini meccanicistiche strettamente controllate sulla funzione microvascolare in condizioni di salute e malattia. Pertanto, questo articolo si propone di descrivere la tecnica di microdialisi intradermica applicata dal nostro gruppo e da altri. Descriviamo in dettaglio le procedure sia per la stimolazione farmacologica dell’endotelio con acetilcolina (ACh) per esaminare la relazione dose-risposta che per la stimolazione fisiologica della produzione endogena di NO con un protocollo di stimolo di riscaldamento locale a 39 °C o 42 °C. Presentiamo i risultati rappresentativi per ogni approccio e discutiamo le implicazioni cliniche dei risultati che sono emersi da questa tecnica.
Protocol
Representative Results
Discussion
La tecnica di microdialisi intradermica è uno strumento versatile nella ricerca vascolare umana. Gli investigatori possono modificare il protocollo per diversificarne ulteriormente le applicazioni. Ad esempio, descriviamo un protocollo dose-risposta ACh, ma altre indagini sui meccanismi di vasocostrizione o tono vasomotorio, piuttosto che sulla sola vasodilatazione, hanno utilizzato approcci dose-risposta alla noradrenalina o al nitroprussiato di sodio 26,27,28,29,30,31.<sup class="xre…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nessuno.
Materials
| 1 mL syringes | BD Syringes | 302100 | |
| Acetlycholine | United States Pharmacopeia | 1424511 | Pilot data collected in our lab indicate drying acetylcholine increases variability of CVC response; do not dry, store in desiccator |
| Alcohol swabs | Mckesson | 191089 | |
| Baby Bee Syringe Drive | Bioanalytical Systems, Incorporated | MD-1001 | In this study the optional 3-syringe bracket (catalg number MD-1002) was utilized |
| CMA 30 Linear Microdialysis Probes | Harvard Apparatus | CMA8010460 | |
| Connex Spot Monitor | WelchAllyn | 74CT-B | automated blood pressure monitor |
| Hive Syringe Pump Controller | Bioanalytical Systems, Incorporated | MD-1020 | Controls up to 4 Baby Bee Syringe Drives |
| LabChart 8 | AD Instruments | **PowerLab hardware and LabChart software must be compatible versions | |
| Lactated Ringer's Solution | Avantor (VWR) | 76313-478 | |
| Laser Doppler Blood FlowMeter | Moor Instruments | MoorVMS-LDF | |
| Laser Doppler probe calibration kit | Moor Instruments | CAL | |
| Laser Doppler VP12 probe | Moor Instruments | VP12 | |
| Linear Microdialysis Probes | Bioanalytical Systems, Inc. | MD-2000 | |
| NG-nitro-l-arginine methyl ester | Sigma Aldrich | 483125-M | L-NAME |
| Povidone-iodine / betadine | Dynarex | 1202 | |
| PowerLab C Data Acquisition Device | AD Instruments | PLC01 | ** |
| PowerLab C Instrument Interface | AD Instruments | PLCI1 | ** |
| Probe adhesive discs | Moor Instruments | attach local heating unit to skin | |
| Skin Heater Controller | Moor Instruments | moorVMS-HEAT 1.3 | |
| Small heating probe | Moor Instruments | VHP2 | |
| Sterile drapes | Halyard | 89731 | |
| Sterile gauze | Dukal Corporation | 2085 | |
| Sterile surgical gloves | Esteem Cardinal Health | 8856N | catalogue number followed by the initials of the glove size, then the letter "B" (e.g., 8856NMB for medium) |
| Surgical scissors | Cole-Parmer | UX-06287-26 |
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