Microdiálise Intradérmica: Uma Abordagem para Investigação de Novos Mecanismos de Disfunção Microvascular em Humanos
Summary
A microdiálise intradérmica é uma técnica minimamente invasiva utilizada para investigar a função microvascular na saúde e na doença. Tanto os protocolos dose-resposta quanto os de aquecimento local podem ser utilizados para explorar mecanismos de vasodilatação e vasoconstrição na circulação cutânea.
Abstract
A vasculatura cutânea é um tecido acessível que pode ser utilizado para avaliar a função microvascular em humanos. A microdiálise intradérmica é uma técnica minimamente invasiva utilizada para investigar mecanismos da musculatura lisa vascular e função endotelial na circulação cutânea. Essa técnica permite a dissecção farmacológica da fisiopatologia da disfunção endotelial microvascular indexada pela diminuição da vasodilatação mediada pelo óxido nítrico, um indicador de risco para o desenvolvimento de doença cardiovascular. Nessa técnica, uma sonda de microdiálise é colocada na camada dérmica da pele, e uma unidade de aquecimento local com uma sonda de fluxometria Doppler a laser é colocada sobre a sonda para medir o fluxo de hemácias. A temperatura local da pele é pinçada ou estimulada com aplicação direta de calor, e agentes farmacológicos são perfundidos através da sonda para estimular ou inibir vias de sinalização intracelular a fim de induzir vasodilatação ou vasoconstrição ou interrogar mecanismos de interesse (cofatores, antioxidantes, etc.). A condutância vascular cutânea é quantificada, e mecanismos de disfunção endotelial em estados patológicos podem ser delineados.
Introduction
A doença cardiovascular (DCV) é a principal causa de morte nos Estados Unidos1. A hipertensão arterial sistêmica (HA) é um fator de risco independente para acidente vascular cerebral, doença coronariana e insuficiência cardíaca e estima-se que afete mais de ~50% da população dos Estados Unidos2. A HA pode se desenvolver como uma DCV independente (HA primária) ou como resultado de outra condição, como doença renal policística e/ou distúrbios endócrinos (HAS secundárias). A amplitude das etiologias da HA dificulta as investigações sobre os mecanismos subjacentes e danos aos órgãos-alvo observados com a HA. Diversas e novas abordagens de pesquisa sobre a fisiopatologia da lesão de órgão-alvo associada à HA são necessárias.
Um dos sinais patológicos mais precoces da DCV é a disfunção endotelial, caracterizada por vasodilatação mediada pelo óxido nítrico (NO) 3,4,5. A dilatação mediada por fluxo é uma abordagem comum usada para quantificar a disfunção endotelial associada à DCV, mas a disfunção endotelial em leitos microvasculares pode ser independente e precursora da das grandes artérias condutos6,7,8. Além disso, as arteríolas de resistência são mais diretamente atuadas pelo tecido local do que as artérias condutas e têm controle mais imediato sobre a entrega de sangue rico em oxigênio. A função microvascular é preditora de sobrevida livre de eventos cardiovasculares adversos 9,10,11. A microvasculatura cutânea é um leito vascular acessível que pode ser utilizado para examinar respostas fisiológicas e farmacológicas a estímulos vasoconstritores ou vasodilatadores. A microdiálise intradérmica é uma técnica minimamente invasiva, cujo objetivo é investigar os mecanismos da função da musculatura lisa vascular e endotelial na microvasculatura cutânea com dissecção farmacológica direcionada. Esse método contrasta com outras técnicas, como a hiperemia reativa pós-oclusiva, que não permite a dissecção farmacológica, e a iontoforese, que permite a administração farmacológica, mas é menos precisa em seu mecanismo de ação (revisada detalhadamente em outro artigo12).
A lógica por trás do desenvolvimento e uso dessa técnica é extensivamente revisada em outra publicação13. Esta abordagem foi originalmente desenvolvida para uso em pesquisa neurológica em roedores e, em seguida, foi primeiramente aplicada em humanos para investigar os mecanismos subjacentes à vasodilatação ativa de um ponto de vista termorregulatório. No final da década de 1990, esse método foi utilizado para examinar mecanismos neurais e endoteliais em relação ao aquecimento local da pele. Desde então, a técnica tem sido utilizada para investigar uma série de mecanismos de sinalização neurovascular na pele.
Usando essa técnica, nosso grupo e outros têm questionado os mecanismos de disfunção endotelial na microvasculatura de várias populações clínicas, incluindo, mas não se limitando a, dislipidemia, envelhecimento primário, diabetes, doença renal crônica, síndrome dos ovários policísticos, pré-eclâmpsia, transtorno depressivo maior 14,15,16,17,18,19 e hipertensão arterial 20,21,22,23,24. Por exemplo, um estudo anterior verificou que mulheres normotensas com história de pré-eclâmpsia, que apresentam risco aumentado para DCV, apresentaram redução da vasodilatação mediada pelo NO na circulação cutânea em comparação com mulheres com história de gravidez normotensa20. Em outro estudo, adultos com diagnóstico de hipertensão primária demonstraram aumento da sensibilidade à angiotensina II na microvasculatura em comparação com controles saudáveis21, e a farmacoterapia anti-hipertensiva crônica doadora de sulfidrila em pacientes com hipertensão primária demonstrou diminuir a pressão arterial e melhorar a vasodilatação mediada por sulfeto de hidrogênio e NO22. Wong e cols.23 encontraram vasodilatação prejudicada mediada por sensorios e NO em adultos pré-hipertensos, coincidindo com nosso achado de progressão da disfunção endotelial com o aumento dos estágios de HA, conforme categorizado pelas diretrizes de 2017 da American Heart Association e do American College of Cardiology24.
A técnica de microdiálise intradérmica permite investigações mecanicistas rigorosamente controladas da função microvascular em estados de saúde e doença. Portanto, este trabalho tem como objetivo descrever a técnica de microdiálise intradérmica aplicada por nosso grupo e outros. Detalhamos os procedimentos de estimulação farmacológica do endotélio com acetilcolina (ACh) para examinar a relação dose-resposta e a estimulação fisiológica da produção endógena de NO com um protocolo de estímulo de aquecimento local de 39 °C ou 42 °C. Apresentamos resultados representativos para cada abordagem e discutimos as implicações clínicas dos achados decorrentes dessa técnica.
Protocol
Representative Results
Discussion
A técnica de microdiálise intradérmica é uma ferramenta versátil na pesquisa vascular humana. Os pesquisadores podem alterar o protocolo para diversificar ainda mais suas aplicações. Por exemplo, descrevemos um protocolo dose-resposta de ACh, mas outras investigações sobre os mecanismos de vasoconstrição ou tônus vasomotor, em vez de vasodilatação isolada, têm utilizado abordagens dose-resposta de noradrenalina ou nitroprussiato de sódio 26,27,28,29,30,31.<sup class="xre…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nenhum.
Materials
| 1 mL syringes | BD Syringes | 302100 | |
| Acetlycholine | United States Pharmacopeia | 1424511 | Pilot data collected in our lab indicate drying acetylcholine increases variability of CVC response; do not dry, store in desiccator |
| Alcohol swabs | Mckesson | 191089 | |
| Baby Bee Syringe Drive | Bioanalytical Systems, Incorporated | MD-1001 | In this study the optional 3-syringe bracket (catalg number MD-1002) was utilized |
| CMA 30 Linear Microdialysis Probes | Harvard Apparatus | CMA8010460 | |
| Connex Spot Monitor | WelchAllyn | 74CT-B | automated blood pressure monitor |
| Hive Syringe Pump Controller | Bioanalytical Systems, Incorporated | MD-1020 | Controls up to 4 Baby Bee Syringe Drives |
| LabChart 8 | AD Instruments | **PowerLab hardware and LabChart software must be compatible versions | |
| Lactated Ringer's Solution | Avantor (VWR) | 76313-478 | |
| Laser Doppler Blood FlowMeter | Moor Instruments | MoorVMS-LDF | |
| Laser Doppler probe calibration kit | Moor Instruments | CAL | |
| Laser Doppler VP12 probe | Moor Instruments | VP12 | |
| Linear Microdialysis Probes | Bioanalytical Systems, Inc. | MD-2000 | |
| NG-nitro-l-arginine methyl ester | Sigma Aldrich | 483125-M | L-NAME |
| Povidone-iodine / betadine | Dynarex | 1202 | |
| PowerLab C Data Acquisition Device | AD Instruments | PLC01 | ** |
| PowerLab C Instrument Interface | AD Instruments | PLCI1 | ** |
| Probe adhesive discs | Moor Instruments | attach local heating unit to skin | |
| Skin Heater Controller | Moor Instruments | moorVMS-HEAT 1.3 | |
| Small heating probe | Moor Instruments | VHP2 | |
| Sterile drapes | Halyard | 89731 | |
| Sterile gauze | Dukal Corporation | 2085 | |
| Sterile surgical gloves | Esteem Cardinal Health | 8856N | catalogue number followed by the initials of the glove size, then the letter "B" (e.g., 8856NMB for medium) |
| Surgical scissors | Cole-Parmer | UX-06287-26 |
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