Summary
פרוטוקול זה נועד לתאר הנחיות מפורטות להכנת קטעי דגימת זרעים קשים עם תכולת מים נמוכה לניתוח MALDI-IMS, שמירה על הפיזור והשפע המקוריים של האנליסטים ומתן אות ורזולוציה מרחבית באיכות גבוהה.
Abstract
ספקטרומטריית מסה של ספיחת לייזר/יינון-הדמיה בסיוע מטריצה (MALDI-IMS) מיושמת לזיהוי תרכובות בסביבות הטבעיות שלהן. נכון לעכשיו, MALDI-IMS משמש לעתים קרובות בניתוח קליני. ובכל זאת, קיימת פרספקטיבה מצוינת ליישום טוב יותר של טכניקה זו להבנת המידע הפיזיולוגי של תרכובות כימיות ברקמות צמחים. עם זאת, ההכנה עשויה להיות מאתגרת עבור דגימות ספציפיות מחומרים בוטניים, מכיוון ש- MALDI-IMS דורש פרוסות דקות (12-20 מיקרומטר) לרכישת נתונים מתאימה וניתוח מוצלח. במובן זה, בעבר, פיתחנו פרוטוקול הכנת דגימות כדי להשיג מקטעים דקים של זרעים קשים של Euterpe oleracea (דקל açaí), המאפשר את המיפוי המולקולרי שלהם על ידי MALDI-IMS.
כאן, אנו מראים כי הפרוטוקול שפותח מתאים להכנת זרעים אחרים מאותו סוג. בקצרה, הפרוטוקול התבסס על טבילת הזרעים במים נטולי יונים, הטבעה של דגימות עם ג'לטין, וחתך אותם בהקפאה מאוקלמת. לאחר מכן, עבור שקיעת מטריצה, פלטפורמת תנועה xy הוצמדה לתרסיס מחט יינון אלקטרוספריי (ESI) באמצעות 1:1 (v/v) 2,5-dihydroxybenzoic חומצה (DHB) ותמיסת מתנול עם 0.1% חומצה trifluoroacetic ב 30 מ"ג / מ"ל. נתוני זרעי E. precatoria ו- E. edulis עובדו באמצעות תוכנה כדי למפות את דפוסי המטבוליטים שלהם.
אוליגומרים הקסוזים מופו בתוך פרוסות דגימה כדי להוכיח את נאותות הפרוטוקול עבור דגימות אלה, שכן ידוע כי זרעים אלה מכילים כמויות גדולות של מנאן, פולימר של מנוז הקסוס. כתוצאה מכך, זוהו פסגות של אוליגומרים הקסוזיים, המיוצגים על ידי [M + K]+ adducts of (Δ = 162 Da). לפיכך, פרוטוקול הכנת הדגימה, שפותח בעבר בהתאמה אישית עבור זרעי E. oleracea , איפשר גם ניתוח MALDI-IMS של שני זרעי דקל קשים אחרים. בקיצור, השיטה יכולה להוות כלי רב ערך למחקר במורפו-אנטומיה ובפיזיולוגיה של חומרים בוטניים, במיוחד מדגימות עמידות לחיתוך.
Introduction
ספקטרומטריית מסה של ספיחת לייזר/יינון-הדמיה בסיוע מטריצה (MALDI-IMS) היא שיטה רבת עוצמה המאפשרת הקצאה דו-ממדית של ביומולקולות, מספקת חקירה לא ממוקדת של תרכובות מייננות וקובעת את התפלגותן המרחבית, במיוחד בדגימות ביולוגיות 1,2. במשך שני עשורים, טכניקה זו אפשרה זיהוי בו זמנית של שומנים, פפטידים, פחמימות, חלבונים, מטבוליטים אחרים, ומולקולות סינתטיות כגון תרופות טיפוליות 3,4. MALDI-IMS מאפשר ניתוח כימי במשטח דגימת רקמה ללא מיצוי, טיהור, הפרדה, תיוג או צביעה של דגימות ביולוגיות. עם זאת, לניתוח מוצלח, שלב מרכזי בטכניקה זו הוא הכנת הדגימה, במיוחד ברקמות צמחים, אשר מתמחים ומותאמים לאיברים מורכבים נרחבים עקב התאקלמות סביבתית5.
בגלל התכונות הפיזיקוכימיות הטבועות ברקמת הצמח, יש צורך בפרוטוקול מותאם שיתאים לדרישות ניתוח MALDI-IMS וישמור על צורתה המקורית של הרקמה במהלך הכנת חתך 6,7. במקרה של דגימות לא קונבנציונליות, כגון זרעים, פרוטוקולים שנקבעו8 אינם ישימים מכיוון שלרקמות אלה יש קירות תאים קשיחים ותכולת מים נמוכה, מה שיכול בקלות לגרום לפיצול חתכים ולהוביל לדלוקליזציה מורכבת9.
קבוצת המחקר שלנו פרסמה נתונים ניסיוניים על מיפוי מולקולרי ופרוטוקול מותאם לניתוח MALDI-IMS של זרעי açaí (Euterpe oleracea Mart.) 10,11,12, שהוא תוצר לוואי שנוצר בכמויות גבוהות במהלך הייצור של עיסת אסאי להשכרה 13. הרעיון היה לפתח פרוטוקול למיפוי באתרו של מטבוליטים שונים בזרעי אסאי, ובכך להציע שימושים אפשריים לפסולת חקלאית זו, שכיום אינם נחקרים באופן מסחרי. עם זאת, בשל ההתנגדות של זרע açaí, היה צורך להתאים פרוטוקול כדי לקבל חתך דגימה כראוי מניתוח MALDI-IMS.
בהקשר זה, עיסת האסאי החשובה מבחינה כלכלית הניעה את המסחור הגובר של פירות אחרים מעצי דקל מסוג Euterpe בעלי מאפיינים חושיים דומים. שני הפירות המתעוררים של עצי דקל שהופקו בקנה מידה תעשייתי כחלופה לאסאי14,15 הם E. precatoria (המכונה açaí-do-amazonas), הגדל באזור היבש של האמזונס, ו- E. edulis (המכונה juçara), האופייני ליער האטלנטי. עם זאת, צריכת açaí-do-amazonas ו juçara מוביל לאותה הצטברות של זרעים עמידים ובלתי אכילים שאינם ניצלו ולא נחקרו עד כה לגבי הרכבם הכימי המפורט.
לפיכך, אנו מראים כאן כי ניתן להשתמש בפרוטוקול שתוכנן בעבר, עם מעט התאמות, כדי לנתח זרעי E. precatoria ו- E. edulis למיפוי מולקולרי על ידי MALDI-IMS, מה שמוכיח שהוא כלי רב עוצמה שניתן להשתמש בו לניתוח הרכב המשאבים הללו ויכול לסייע בקביעת השימושים הביוטכנולוגיים הפוטנציאליים שלהם. יתר על כן, התיאור המפורט המובא כאן יכול לסייע לאחרים עם קשיים דומים בהכנת חומרים עמידים לניתוח MALDI-IMS.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
זרעי Euterpe precatoria נתרמו באדיבות על ידי המכון הלאומי לפסקיסאס דה אמזוניה (מנאוס, ברזיל), וזרעי Euterpe edulis נתרמו באדיבות על ידי Silo - Arte e Latitude Rural (רסנדה, ברזיל) לאחר תהליך הפירוק התעשייתי. הזרעים נשמרו בקופסאות פלסטיק אטומות בטמפרטורת החדר.
1. ספקטרוסקופיית מסה בסיוע לייזר בסיוע מטריצה/יינון-הדמיה (MALDI-IMS)
- פרוטוקול חתך זרעים
- הניחו לשלושה זרעים מכל מין לשבת במים נטולי יונים, במשך 24 שעות.
- למחרת, הפעל את הקריוסטט (ראה טבלת חומרים) ותן לו להגיע ל -20 מעלות צלזיוס.
- הוציאו את הזרעים הרטובים מהמים. חותכים את הזרעים לשניים באמצעות להב מיקרוטום (ראו טבלת חומרים).
- הכינו תמיסת ג'לטין טרייה וחמה (10%) (ראו טבלת חומרים).
- מניחים מחצית מהזרע על תבנית וממלאים אותו בג'לטין טרי. יש להקפיא ב-80°C למשך שעתיים לפני ההקפאה.
- חבר את הזרע המוטבע לתמיכה בהקפאה באמצעות תרכובת טמפרטורת חיתוך אופטימלית (OCT, ראה טבלת חומרים) והשאר למשך 10 דקות בתוך ההקפאה לצורך התקשות OCT.
- הוסף סרט הדבקה דו-פרצופי מנחושת (ראה טבלת חומרים) לשקופית זכוכית מצופה תחמוצת בדיל אינדיום (שקופית ITO; ראה טבלת חומרים).
- הפק מקטעים בעובי 20 מיקרומטר מכל מין והניחו אותם על סרט הדבקה דו-פרצופי נחושת המודבק לשקופית זכוכית ITO.
הערה: בשלב זה, ניתן לאחסן את הפרוסות שנאספו בשקופיות במקפיא של -80 °C; לחלופין, המשך לתצהיר מטריקס. יש למקם את השקופיות בקופסת שקופיות מחזיק, לשטוף אותן ב-N2 גזי ולאטום אותן בסרט צילום כדי למנוע חמצון דגימה (ראו טבלת חומרים).
- תצהיר מטריצה
- מניחים את המגלשה המכילה פרוסות במייבש ואקום עד שהיא מגיעה לטמפרטורת החדר.
- צור סימני הוראה באמצעות עט תיקון בכל אחת מפינות השקופית. סרוק את השקופית באמצעות סורק טבלאות. הגדר לרזולוציה של 4,800 ppi.
- השתמש באיזון אנליטי כדי לשקול 30 מ"ג של חומצה 2,5-dihydroxybenzoic (DHB; ראה טבלה של חומרים) ולהכין 1 מ"ל של 1: 1 מתנול:0.1% חומצה trifluoroacetic (TFA; טבלת חומרים) פתרון להמסת ה-DHB.
- מלאו מזרק זכוכית בנפח 1 מ"ל (ראו טבלת חומרים) בתמיסת DHB והניחו אותו במשאבת מזרק (ראו טבלת חומרים) המוגדרת לקצב זרימה של 0.8 מ"ל/שעה.
- באמצעות צינורות PEEK, חבר את המזרק למחט יינון כימי בלחץ אטמוספרי (APCI) (ראה טבלת חומרים).
- חבר את N2 למחט APCI והגדר אותה לקצב זרימה של 12.5 psi .
- חבר את מחט APCI לפלטפורמת התנועה xy (ראה טבלת חומרים). ודא שקצה מחט APCI נמצא 4 ס"מ מעל המגלשה.
- באמצעות תוכנת השרטוט (ראו טבלת חומרים ואיור משלים 1), הגדירו את פלטפורמת התנועה xy כך שתעקוב אחר התבנית. התבנית מורכבת מקווים אופקיים מקבילים ברווח של 1 מ"מ.
- כדי להשיג תצהיר מטריצה, המתן עד שפלטפורמת התנועה xy תחזור על התבנית 20 פעמים.
זהירות: שיקוע מטריצה חייב להתבצע במכסה אדים כימי.
- רכישת הדמיה
- מקם את השקופית בספקטרומטר המסות (ראה טבלת חומרים).
- השתמש בסימני עט לתיקון כדי להגדיר נקודות הוראה בתוכנה שאליה מתבצעת הפניה (ראה טבלת חומרים).
- הגדר את עוצמת הלייזר (60%), מיקוד לייזר (בינוני), מספר הצילומים (100) והקוטביות בתוכנה (ראה טבלת חומרים). הגדר גורם הפחתת נתונים של 99% ושמור את קובץ ה- FID לכיול נתונים אחורי. שמור את השיטה.
- תיחום השטח לניתוח באמצעות הכלי Add Polygon Measurement Region מתוכנת ספקטרומטר המסות. ערוך את הפרמטרים של אזור המדידה המציינים את השיטה שנשמרה בשלב הקודם ואת רוחב הרסטר ל- 100 מיקרומטר (איור משלים S4A).
- התחל ברכישת הדמיה.
- ניתוח נתונים
- השתמשו בצביר מטריצה ובמזהמים ידועים כדי ליצור רשימת מסות בתוכנה שאליה מתייחסים (ראו טבלת חומרים) בכרטיסיית הכיול (איור משלים S4B).
- פתח את הנתונים לכיול בתוכנה שאליה מתבצעת הפניה (ראה טבלת חומרים). בכרטיסייה כיול , פתחו את רשימת המסות שנוצרה ופתחו תיבת דו-שיח בלחיצה ימנית ובחרו באפשרות Set Lock Masses (איור משלים S4C).
- בחר מצב חלון גאוס עם הרחבת גאוס 0.5 והרחבת קו 3.5. השאר את הכיול המקוון ללא סימון. בחר מצב (יחיד), סף (1,000) וסובלנות מסה (5 עמודים לדקה). כייל נתונים באמצעות תהליך ושמור את כלי הנתונים הדו-ממדי (איור משלים S4C).
- לאחר הכיול, יצא את הנתונים למעבדת SCiLS או לתוכנה תואמת אחרת והגדר את סף הערך הרצוי של m/z (טווח נבחר: 150 עד 2,500).
הערה: בהתאם לגודל הקובץ או למאפייני המחשב, פעולה זו עשויה להימשך זמן מה. - בחר שיטת נורמליזציה בין ספירת יונים כוללת (TIC) או ריבוע ממוצע שורש (RMS).
הערה: עבור ניתוח זה, TIC נבחר. - אם האנליטות שיש למפות ידועות, התווה כל ערך m/z לכל אנליט ושמור את התמונות שנוצרו ואת התוויית הממוצע הספקטרלי.
הערה: בעבודה זו, ערכי m/z מאוליגומרים הקסוזיים נבחרו על ידי התחשבות באדדוקט אשלגן.
- השתמשו בצביר מטריצה ובמזהמים ידועים כדי ליצור רשימת מסות בתוכנה שאליה מתייחסים (ראו טבלת חומרים) בכרטיסיית הכיול (איור משלים S4B).
2. ספקטרוסקופיה מפזרת אנרגיה (EDS)
- פרוטוקול חתך זרעים
- רכשו פרוסת זרעים דקה במכונת מסור חתך (ראו טבלת חומרים).
- חתכו את הזרעים עם הפרמטרים הבאים: מהירות חיתוך 500 סל"ד, טעינת עומס 100 N ולהב פרוסת יהלום 15 HC (ראה טבלת חומרים).
הערה: טפל בהסרה ידנית של סיבים מהזרעים עקב ההיצמדות הנדרשת לאחיזה בוויזות המדויקות המחוברות לגוניומטר. נקו את הלהב לפני השימוש, חתכו חלק מהזרע כדי למנוע הוספת מינרלים לא רצויים במהלך הניתוח. - נקה את הדגימות עם אוויר דחוס כדי להסיר את כל שאריות החלקיקים מהחתך (ראה טבלת חומרים).
- קבע קטע זרע בסרט מוליך דו-צדדי פחמן (ראה טבלת חומרים) בתמיכה.
- תנאי ניתוח
- חבר את התמיכה עם קטע זרע בתוך תא הוואקום של מיקרוסקופ אלקטרונים סורק (SEM) יחד עם EDS (ראה טבלת חומרים).
- להשיג מיקרוגרפים אלקטרונים במיקרוסקופ מודל עם תאוצה של 20 kV וגודל ספוט של 4.0, באמצעות אותות אלקטרונים משניים (ראה טבלת חומרים), אלקטרונים מפוזרים לאחור (גלאי מצב מוצק קבוע על חתיכת הקוטב), ותערובות של שני סוגי אותות אלה (MIX), בניית תמונות צבעוניות מלאכותיות.
- לרכישת ספקטרום EDS, השתמש בספקטרומטר (ראה טבלת חומרים) יחד עם ה- SEM הנ"ל. תצורת התנאי של רכישת התמונה מ- EDS זהה ל- SEM.
- קבעו מעלות הטיה, גובה ואזימוט ב- 0.0, 35.0 ו- 0.0, בהתאמה.
- איסוף נתונים
- הגדר שלושה אזורים שונים עם הגדלה של 91x של מקטע הזרעים כדי להשיג נתונים.
- זהה את הפסגות בספקטרום עם סיום הרכישה או במהלך הרכישה. השתמש בלחצן השלב Confirm Elements כדי לזהות את הפסגות באופן ידני.
- הגדר את זמן הרכישה ל- 60 שניות עבור כל אזור שנבחר. הגדר את זמן התהליך לחמש; הפרמטרים זמינים לזמן תהליך של אחד עד שש.
הערה: סימני האלמנטים קבועים ומצטברים, בעוד שהרעשים אקראיים ומזיקים. ככל שזמן העיבוד ארוך יותר, כך הרעש נמוך יותר. - הגדרות ברירת המחדל להצגת תוצאות כמותיות משמעותיות הן מעל שתי סיגמות (סטיית תקן). הגדר שתי סיגמות לאפס כדי להפחית תוצאות לא רצויות.
- לנרמל כל עוצמה של האלמנטים; זהו פרמטר סטנדרטי בתוכנה (ראה טבלת חומרים).
- כדי לנתח את הנתונים, יצא אותם בקובץ DOC.
- ניתוח נתונים
- להבטיח מדידה מדויקת של עוצמות שיא לניתוח יסודות כמותי.
- פסגות חופפות דורשות דה-קונבולוציה להפרדת פסגות טובה יותר; החסר רקע רועש בעת הצורך.
- כאשר אין חפיפה, להגדיל את הרווח כדי להגביר את האותות ולשפר את איכות הספקטרום.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
הפרוטוקול שתוכנן איפשר ניתוח MALDI-IMS של זרעי E. precatoria ו- E. edulis. כתוצאה מכך, אנו יכולים לאשר את המשקל המולקולרי של פחמימות ואת מידת הפילמור (DP) כהבהרה מבנית חלקית. המידע המולקולרי שסופק על-ידי ניתוח MALDI-IMS (איור 1 ואיור 2) הציג פסגות המייצגות [M+K]+ adducts של אוליגומרים הקסוזיים (Δ = 162 Da) מבלי להוסיף מלח למטריצה. בשתי רקמות הזרעים זוהו דימרים הקסוס (m/z 381), טרימרים (m/z 543), טטרמרים (m/z 705), פנטמרים (m/z 867), הקסמרים (m/z 1029) ואוליגומרים של עד 14 יחידות (m/z 2325). תרשימי הקופסה של שתי הדגימות (איור 3) מצביעים על עוצמת השיא של כל אוליגומר הקסוס שנמצא באנדוספרם הזרעים, מה שמדגים את ההתפלגות שלהם ואת התפוצצות מעט גבוהה יותר של אוליגומרים בעלי DP גבוה.
בעבר, סיפקנו נתוני EDS על זרעי E. oleracea , אשר הצביעו על כך שצינורות אשלגן שזוהו בניתוח MALDI-IMS נבעו מהמאפיין הפנימי של הדגימה של תכולת אשלגן גבוהה10. מחקר זה ניתח גם זרעים של E. precatoria ו-E. edulis כדי לזהות את המרכיבים העיקריים במקטעי המדגם (איור משלים S2 ואיור משלים S3). ההרכב האטומי שנצפה על פני הרקמה התפזר בצורה הומוגנית, והראה בעיקר יסודות לא מינרליים, כגון פחמן וחמצן, ותכולת מינרלים נמוכה יותר. בשתי הדגימות, אשלגן היה היסוד המינרלי העיקרי שנמצא בניתוח EDS (איור משלים S2 ואיור משלים S3).
איור 1: התפלגות אוליגומרים הקסוס בזרעי Euterpe precatoria על-ידי MALDI-IMS במצב חיובי. (A) ספקטרום המסה המתקבל. (B) תמונה היסטולוגית והמסגרת המשמשת לניתוח MALDI-IMS. (ג-ו) ייצוגי תמונה של אות m/z מסוים המתאר את עוצמתו ברקמה עבור כל [M+K]+ adduct from hexose dimer (C), trimer (D), עד 14 יחידות (E-O) באנדוספרם של הזרעים. סרגל קנה מידה = 4 מ"מ (B). קיצור: MALDI-IMS = ספקטרומטריית מסה של ספיחת לייזר בסיוע מטריצה/יינון-הדמיית מסה. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2: התפלגות אוליגומרים הקסוס בזרעי Euterpe edulis על-ידי MALDI-IMS במצב חיובי. (A) ספקטרום המסה המתקבל. (B) תמונה היסטולוגית והמסגרת המשמשת לניתוח MALDI-IMS. (ג-ו) ייצוגי תמונה של אות m/z מסוים המתאר את עוצמתו ברקמה עבור כל [M+K]+ adduct from hexose dimer (C), trimer (D), עד 14 יחידות (E-O) באנדוספרם של הזרעים. סרגל קנה מידה = 5 מ"מ (B). קיצור: MALDI-IMS = ספקטרומטריית מסה של ספיחת לייזר בסיוע מטריצה/יינון-הדמיית מסה. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 3: הדמיות של עלילת תיבה. (A) E. precatoria ו-(B) E. edulis, המציינים את שיא העוצמה וההתפלגות של כל אוליגומר הקסוס שנמצא ברקמת הזרע. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור משלים S1: תבנית ציפוי מטריצה. מטריצת DHB רוססה על הפלטפורמה באמצעות תוכנת שרטוט לחלוקה שווה על שקופית בגודל 75 מ"מ x 25 מ"מ של קווים מקבילים אופקיים במרווחים של 1 מ"מ. אנא לחץ כאן להורדת קובץ זה.
איור משלים S2: ניתוח הרכב יסודי של זרעי E. precatoria על ידי ספקטרומטריית קרני רנטגן מפזרת אנרגיה. (A) E. חתך פני השטח של דגימת זרעים precatoria . (B) אלמנטים עיקריים מכומתים למחצה. המרכיבים העיקריים מתאימים לכ-47.0% פחמן (C), 52.7% חמצן (O) ו-0.2% אשלגן (K). אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.
איור משלים S3: ניתוח הרכב יסודי של זרעי E. edulis על ידי ספקטרומטריית קרני רנטגן מפזרת אנרגיה. (A) E. edulis חתך משטח לדוגמה. (B) אלמנטים עיקריים מכומתים למחצה. המרכיבים העיקריים תואמים כ 47.7% פחמן (C), 53.8% חמצן (O), 0.3% אשלגן (K), וכמה עקבות של כלור (Cl). אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.
תרשים משלים S4: תיחום השטח בתמונה וניתוח נתונים. (A) תיחום השטח לניתוח ועריכת הפרמטרים ורוחב הרסטר ל-100 מיקרומטר. (B) זיהוי אשכול מטריצה ויצירת רשימת מסות. (C) כיול נתונים ושמירת כלי הנתונים הדו-ממדי. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
צמחים מורכבים מרקמות מיוחדות עבור פונקציות ביוכימיות ספציפיות. לכן, פרוטוקול הכנת הדגימות עבור MALDI-IMS חייב להיות מתוכנן על פי רקמות צמחים שונות בעלות תכונות פיסיקוכימיות ספציפיות, שכן הדגימות חייבות לשמור על פיזור האנליזה והשפע המקוריים שלהן לקבלת אות באיכות גבוהה ורזולוציה מרחבית8.
לפני ניתוח MALDI-IMS, השיקול העיקרי הוא איסוף ואחסון דגימות כראוי. עם זאת, בצמחים, הכנת הדגימה משתנה לעתים קרובות בהתאם לרקמה המנותחת. לדוגמה, קשירת דופן התא ותכולת המים ברקמות הצמח עשויות להציב אתגרים במהלך החתך כדי לשמור על ייצוג מדויק של המורפולוגיה במדגם7.
ניתן לחלק את ניתוח MALDI-IMS לזרימת עבודה המורכבת מהכנת רקמות וחתך, ציפוי מטריצה וניתוח נתונים. עם זאת, האיכות והאותנטיות של תוצאות ההדמיה מושפעות ישירות משיטת הכנת הדגימה, שהיא שלב מכריע. שיטת הכנת הדגימה ששימשה במחקר זה התבססה על פרוטוקול שפורסם בעבר עבור E. oleracea זרע בוגר10. כדי לאמת את פרוטוקול החתך עבור דגימות אחרות, הערכנו את השלבים לחיתוך דגימות באמצעות זרעי E. precatoria ו - E. edulis כדי לרכוש מקטעים דקים (20 מיקרומטר) ולאפשר ניתוח MALDI-IMS ברזולוציה נכונה. רוב המידע מתואר בפירוט בסעיף הפרוטוקול; עם זאת, נדגיש כי הסרה ידנית של שכבת סיבים חיצוניים היא צעד חשוב לריכוך הזרע, המאפשר חיתוך להבים.
זרימות עבודה היסטולוגיות סטנדרטיות בדרך כלל אינן מומלצות עבור MALDI-IMS, מכיוון שהליכי קיבוע עלולים להוביל להשפעות דיכוי יונים. Cryosectioning היא השיטה הנפוצה ביותר להכנת דגימה. עם זאת, התכווצות הדגימה או התפוררות עלולה להתרחש, מתן פריקת מטבוליטים ומעכב את הפרשנות הביולוגית 5,8. אפשרות נוספת לרקמות רכות כמו עלים ופרחים היא שיטת ההטבעה. עם זאת, במחקר זה, בגלל אופי הרקמה הקשה ותכולת המים הנמוכה בדגימות, הטכניקה ששימשה לפני החתך הייתה להטמיע את הדגימה עם חומר ספציפי כדי לספק קטעי רקמה מדויקים ואיכותיים.
ראוי לציין כי עובי הרקמה עלול להוביל לעוצמת אות מופחתת. בסך הכל, MALDI-IMS דורש עובי פרוסה של <20 מיקרומטר כדי לספק רזולוציה נאותה. עם זאת, רקמות צמחים קשות וגדולות בדרך כלל נשברות במהלך חתך של דגימה דקה. כדי לפתור בעיה זו, הפרוטוקול השתמש בסרט הדבקה מוליך עשוי נחושת16, מה שמקטין את עיוות החלקים ומקל על החיבור לשקופית. יתר על כן, קשה להשיג חתך דק של הזרע כולו מבלי להשרות אותו במים נטולי יונים. עם זאת, הטבעה של הדגימה למשך פרק זמן זה עלולה לגרום לפריקת מטבוליטים; לכן, במחקר שפורסם בעבר עם E. oleracea זרע11, השווינו חלקים קטנים (רטובים ויבשים) עם ובלי שלב ההשריה, שממנו התוצאות הצביעו על שום נקע עבור procyanidins נמצא tegument זרעים.
שקיעת מטריצה היא שלב קריטי נוסף להומוגניות מטריצה על פני השטח של חתך הרקמה, ומבטיחה יינון אנליטי. עבור תצהיר מטריצת MALDI, הערכנו, בבדיקות ראשוניות, מטריצות שונות, כגון 9-aminoacridine (9AA), α-cyano-4-hydroxycinnamic acid (HCCA), 1,5-diaminonapthalene (DAN) ו-2,5-dihydroxybenzoic acid (DHB). DHB נבחרה כמטריצה מכיוון שהיא סיפקה רזולוציה טובה יותר על אותות הפחמימות (נתונים לא מוצגים) וגם בשל אופי "הניתוח האוניברסלי" שלה1; עם זאת, השיטה המקורית השתמשה בגישת סובלימציה10,17, ואילו הפעם השתמשנו בריסוס רובוטי אוטומטי כדי לשלוט בתנאי ציפוי המטריצה ולספק יישום אחיד יותר וגבישי מטריצה קטנים יותר לתמונה ברזולוציה גבוהה יותר ולהימנע מהשפעות דיכוי יונים.
E. precatoria ו- E. edulis מציגים זרעים בצורת גלובוס עם אנדוספרם הומוגני גדול המכוסה על ידי טגמנט חיצוני דק, אשר שונה רק מזרעי E. oleracea בגלל האנדוספרם המהורהר האופייני שלו 10,18,19. האופי הלא קונבנציונלי שנמצאו עבור דגימות צמחים אלה סיפק קשיי עיבוד דומים עבור פרוטוקולי החתך והתצהיר המטריצות המותאמים. עם זאת, תוצאות אלה מצביעות על כך שהכנת הדגימה הייתה מספקת וסיפקה תמונות אמינות ויעילות, שקבעו את הלוקליזציה המרחבית של מטבוליטים בזרעי E. precatoria ו- E. edulis. ניתוחי MALDI-IMS אפשרו לראשונה בספרות ניצול פוטנציאלי של חומרי גלם אלה בהתבסס על נתוני המיפוי המולקולרי שלהם.
נתוני EDS הצביעו על נוכחות של אשלגן נמוך מ -1% ברקמות הזרע המנותחות של E. edulis ו- E. precatoria. עם זאת, הריכוז היה גבוה מספיק כדי לספק פסגות [M+K]+ במהלך ניתוח MALDI-IMS. מחקרים שפורסמו בעבר זיהו אשלגן כמינרל העיקרי שנמצא בשני הזרעים20,21, מה שמצביע על נוכחות טבעית של אשלגן בזרעים מסוג Euterpe ומסביר את האדוקטים בנתוני MALDI-IMS של מינים אלה.
במחקר זה, הערכנו גם את הוכחת ההיתכנות שהפרוטוקול שפותח עבור זרעי E. oleracea יושם עבור זרעי E. precatoria ו- E. edulis. פוליסכריד הרזרבה שנמצא באנדוספרם של זרעי האסאי (E. oleracea) הוא בעיקר מנאן22, שארגונו גבישי מאוד, מה שמשפר את קשיות האנדוספרם כדי להשיג חלקים דקים של זרעים בוגרים10,19. מחקרים קודמים כימתו את הפחמימות באנדוספרם של שני הזרעים בשיטות גרבימטריות, ומצאו תכולה מעל 90% מהמשקל היבש של הזרעים 20,21. יתר על כן, מחקר היסטוכימי ב E. edulis הציע נוכחות של mannan באנדוספרם באמצעות birefringence גבישי מאוד חזק תחת אור מקוטב18. עם זאת, אין נתונים על ההרכב הכימי של פחמימות הרזרבה באנדוספרם של שני הזרעים. בגלל קרבתם הפילוגנטית לזרע E. oleracea, אוליגומרים הקסוס שזוהו על ידי MALDI-IMS צפויים להיות גם אוליגוסכרידים מנאן. עם זאת, יש צורך במחקרים עתידיים שיעריכו את ההרכב הכימי של פוליסכרידים עתודות אלה כדי לאשר את מבני המן והאוליגוסכריד בזרעי E. precatoria ו- E. edulis.
פרוטוקול זה יכול להיות מיושם ככלי שימושי במחקרים של זרעים אלה, אשר חורגים מהמטרה המתוארת שלנו כאן. לדוגמה, טכניקה זו יכולה להועיל לניתוח תהליכים ביוכימיים במהלך התפתחות זרעים ונביטה. לבסוף, התיאור המפורט המובא כאן יכול להיות נקודת התחלה מועילה לפיתוח פרוטוקולים מותאמים לניתוח על ידי MALDI-IMS של חומרים עמידים אחרים מצמחים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
המחברים מצהירים כי אין ניגודי עניינים.
Acknowledgments
עבודה זו מומנה על ידי מכון סראפילהיירה (Serra-1708-15009), וקרן קרלוס צ'אגס פיליו לתמיכה במחקר במדינת ריו דה ז'ניירו (FAPERJ-JCNE-SEI-260003/004754/2021). מכון סראפילהיירה והמועצה הלאומית לפיתוח מדעי וטכנולוגי (CNPq) העניקו מלגות לד"ר פליפה לופס ברום וד"ר גבריאל ר. מרטינס (Institutional Capacity Building Program/INT/MCTI). התיאום לשיפור כוח האדם להשכלה גבוהה (CAPES) מוכר על הענקת מלגת מאסטר למר דייווי מ. מ. כ. דה סילבה. Centro de Espectrometria de Massas de Biomoléculas (CEMBIO-UFRJ) מוכר בזכות השירותים הניתנים עם ניתוחי MALDI-IMS, ומר אלן מנזס דו נסימנטו והמרכז לננוטכנולוגיה וקטליס (CENANO-INT), הממומנים על ידי MCTI/SISNANO/INT-CENANO-CNPQ grant Nº 442604/2019, מודים על ניתוח ההרכב היסודי.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 mL Gastight Syringe Model 1001 TLL, PTFE Luer Lock | Hamilton Company | 81320 | |
| 2,5-Dihydroxybenzoic acid | Sigma Aldrich Co, MO, USA | 149357 | |
| APCI needle | Bruker Daltonik, Bremen, Germany | 602193 | |
| AxiDraw V3 xy motion platform | Evil Mad Scientist, CA, USA | 2510 | |
| Carbon double-sided conductive tape | |||
| Compass Data Analysis software | creation of mass list | ||
| Compressed air | |||
| copper double-faced adhesive tape | 3M, USA | 1182-3/4"X18YD | |
| Cryostat CM 1860 UV | Leica Biosystems, Nussloch, Germany | ||
| Diamond Wafering Blade 15 HC | |||
| Everhart-Thornley detector | |||
| FlexImaging | Bruker Daltonik, Bremen, Germany | image acquisition | |
| FTMS Processing | Bruker Daltonik, Bremen, Germany | data calibration | |
| Gelatin from bovine skin | Sigma Aldrich Co, MO, USA | G9391 | |
| High Profile Microtome Blades Leica 818 | Leica Biosystems, Nussloch, Germany | 0358 38926 | |
| indium tin oxide coated glass slide | Bruker Daltonik, Bremen, Germany | 8237001 | |
| Inkscape | Inkscape Project c/o Software Freedom Conservancy, NY, USA | ||
| IsoMet 1000 precision cutter | Buehler, Illinois, USA | ||
| Methanol | J.T.Baker | 9093-03 | |
| Mili-Q water | 18.2 MΩ.cm | ||
| Oil vacuum pump | |||
| Optimal Cutting Temperature Compound | Fisher HealthCare, Texas, USA | 4585 | |
| Parafilm "M" Sealing Film | Amcor | HS234526B | |
| Quanta 450 FEG | FEI Co, Hillsboro, OR, USA | ||
| SCiLS Lab (Multi-vendor support) MS Software | Bruker Daltonik, Bremen, Germany | ||
| Software INCA Suite 4.14 V | Oxford Instruments, Ableton, UK | ||
| Solarix 7T | Bruker Daltonik, Bremen, Germany | ||
| Syringe pump | kdScientific, MA, USA | 78-9100K | |
| Trifluoroacetic acid | Sigma Aldrich Co, MO, USA | 302031 | |
| X-Max spectrometer | Oxford Instruments, Ableton, UK |
References
- Buchberger, A. R., DeLaney, K., Johnson, J., Li, L. Mass spectrometry imaging: a review of emerging advancements and future insights. Analytical Chemistry. 90 (1), 240-265 (2018).
- Heeren, R. M. A. MALDITechniques in Mass Spectrometry Imaging. Encyclopedia of Spectroscopy and Spectrometry. , Elsevier Ltd. (2017).
- Shariatgorji, M., Svenningsson, P., Andrén, P. E. Mass spectrometry imaging, an emerging technology in neuropsychopharmacology. Neuropsychopharmacology. 39 (1), 34-49 (2014).
- Zaima, N., Hayasaka, T., Goto-Inoue, N., Setou, M. Matrix-assisted laser desorption/ionization imaging mass spectrometry. International Journal of Molecular Sciences. 11 (12), 5040-5055 (2010).
- Qin, L., et al. Recent advances in matrix-assisted laser desorption/ionisation mass spectrometry imaging (MALDI-MSI) for in Situ analysis of endogenous molecules in plants. Phytochemical Analysis. 29 (4), 351-364 (2018).
- Bhandari, D. R., et al. High resolution mass spectrometry imaging of plant tissues: Towards a plant metabolite atlas. Analyst. 140 (22), 7696-7709 (2015).
- Boughton, B. A., Thinagaran, D., Sarabia, D., Bacic, A., Roessner, U. Mass spectrometry imaging for plant biology: a review. Phytochemistry Reviews. 15 (3), 445-488 (2016).
- Dong, Y., et al. Sample preparation for mass spectrometry imaging of plant tissues: a review. Frontiers in Plant Science. 7, 60 (2016).
- Zhang, Y. X., Zhang, Y., Shi, Y. P. A reliable and effective sample preparation protocol of MALDI-TOF-MSI for lipids imaging analysis in hard and dry cereals. Food Chemistry. 398, 133911 (2023).
- Brum, F. L., Martins, G. R., Mohana-Borges, R., da Silva, A. S. The acquisition of thin sections of açaí (Euterpe oleracea Mart.) seed with elevated potassium content for molecular mapping by mass spectrometry imaging. Rapid Communications in Mass Spectrometry. , e9474 (2023).
- Martins, G. R., et al. Chemical characterization, antioxidant and antimicrobial activities of açaí seed (Euterpe oleracea Mart.) extracts containing A- and B-type procyanidins. LWT. 132, 109830 (2020).
- Martins, G. R., et al. Phenolic profile and antioxidant properties in extracts of developing açaí (Euterpe oleracea Mart.) seeds. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 70 (51), 16218-16228 (2022).
- Jorge, F. T. A., Silva, A. S. A., Brigagão, G. V. Açaí waste valorization via mannose and polyphenols production: techno-economic and environmental assessment. Biomass Conversion and Biorefinery. , (2022).
- Carvalho, L. M. J., Esmerino, A. A., Carvalho, J. L. V. Jussaí (Euterpe edulis): a review. Food Science and Technology. 42, (2022).
- Yamaguchi, K. K. dL., Pereira, L. F. R., Lamarão, C. V., Lima, E. S., Veiga-Junior, V. F. d Amazon acai: chemistry and biological activities: A Review. Food Chemistry. 179, 137-151 (2015).
- Wu, R., et al. Copper adhesive tape attached to the reverse side of a non-conductive glass slide to achieve protein MALDI-imaging in FFPE-tissue sections. Chemical Communications. 57 (82), 10707-10710 (2021).
- Dufresne, M., Patterson, N. H., Norris, J. L., Caprioli, R. M. Combining salt doping and matrix sublimation for high spatial resolution MALDI imaging mass spectrometry of neutral lipids. Analytical Chemistry. 91 (20), 12928-12934 (2019).
- Aguiar, M. O., de Mendonça, M. S. Morfo-anatomia da semente de Euterpe precatoria Mart (Palmae). Revista Brasileira de Sementes. 25, 37-42 (2003).
- Panza, V., Láinez, V., Maldonado, S. Seed structure and histochemistry in the palm Euterpe edulis. Botanical Journal of the Linnean Society. 145 (4), 445-453 (2004).
- Alves, V. M., et al. Provenient residues from industrial processing of açaí berries (Euterpe precatoria Mart): nutritional and antinutritional contents, phenolic profile, and pigments. Food Science and Technology. 42, (2022).
- Inada, K. O. P., et al. Screening of the chemical composition and occurring antioxidants in jabuticaba (Myrciaria jaboticaba) and jussara (Euterpe edulis) fruits and their fractions. Journal of FunctionalFoods. 17, 422-433 (2015).
- Monteiro, A. F., Miguez, I. S., Silva, J. P. R. B., Silva, A. S. High concentration and yield production of mannose from açaí (Euterpe oleracea Mart.) seeds via mannanase-catalyzed hydrolysis. Scientific Reports. 9 (1), 10939 (2019).
