Summary
يهدف هذا البروتوكول إلى وصف إرشادات مفصلة حول تحضير أقسام عينات البذور الصلبة ذات المحتوى المائي المنخفض لتحليل نظام الرصد الدولي MALDI-IMS ، والحفاظ على التوزيع الأصلي للتحليلات ووفرتها وتوفير إشارة عالية الجودة ودقة مكانية.
Abstract
يتم تطبيق قياس الطيف الكتلي للامتزاز بالليزر / تصوير التأين بمساعدة المصفوفة (MALDI-IMS) لتحديد المركبات في بيئاتها الأصلية. وكثيرا ما يستخدم نظام الرصد الدولي حاليا في التحليل السريري. ومع ذلك ، يوجد منظور ممتاز لتطبيق هذه التقنية بشكل أفضل لفهم المعلومات الفسيولوجية للمركبات الكيميائية في الأنسجة النباتية. ومع ذلك، قد يكون التحضير صعبا بالنسبة لعينات محددة من المواد النباتية، حيث يتطلب نظام الرصد الدولي التابع ل MALDI شرائح رقيقة (12-20 ميكرومتر) للحصول على البيانات المناسبة والتحليل الناجح. وبهذا المعنى، قمنا سابقا بتطوير بروتوكول تحضير العينات للحصول على مقاطع رقيقة من البذور الصلبة Euterpe oleracea (نخيل الأساي)، مما يتيح رسم الخرائط الجزيئية بواسطة MALDI-IMS.
هنا ، نظهر أن البروتوكول المطور مناسب لإعداد بذور أخرى من نفس الجنس. باختصار ، استند البروتوكول إلى غمر البذور في ماء منزوع الأيونات لمدة 24 ساعة ، وتضمين عينات بالجيلاتين ، وتقسيمها في جهاز تبريد متأقلم. بعد ذلك ، لترسب المصفوفة ، تم إقران منصة حركة xy برذاذ إبرة التأين بالرش الكهربائي (ESI) باستخدام حمض 1: 1 (v / v) 2،5-dihydroxybenzoic (DHB) ومحلول ميثانول مع 0.1٪ حمض ثلاثي فلورو أسيتيك عند 30 مجم / مل. تمت معالجة بيانات بذور E. precatoria و E. edulis باستخدام برنامج لرسم خريطة لأنماط الأيض الخاصة بهم.
تم تعيين الأوليغومرات السداسية داخل شرائح العينة لإثبات كفاية البروتوكول لتلك العينات ، حيث من المعروف أن تلك البذور تحتوي على كميات كبيرة من المنان ، وهو بوليمر من المانوز السداسي. نتيجة لذلك ، تم تحديد قمم oligomers hex ، ممثلة ب [M + K] + adducts من (Δ = 162 Da). وهكذا، فإن بروتوكول تحضير العينات، الذي سبق تطويره خصيصا لبذور E. oleracea ، مكن أيضا من تحليل MALDI-IMS لبذرتين أخريين من بذور النخيل الصلب. باختصار ، يمكن أن تشكل الطريقة أداة قيمة للبحث في علم التشريح المورفولوجي وعلم وظائف الأعضاء للمواد النباتية ، خاصة من العينات المقاومة للقطع.
Introduction
يعد قياس الطيف الكتلي للتصوير بالليزر بمساعدة المصفوفة (MALDI-IMS) طريقة قوية تسمح بتعيين جزيء حيوي ثنائي الأبعاد ، وتوفر فحصا غير مستهدف للمركبات المؤينة ، وتحدد توزيعها المكاني ، خاصة في العينات البيولوجية 1,2. على مدى عقدين من الزمن ، مكنت هذه التقنية من الكشف والتعرف في وقت واحد على الدهون والببتيدات والكربوهيدرات والبروتينات والمستقلبات الأخرى والجزيئات الاصطناعية مثل الأدوية العلاجية 3,4. يسهل MALDI-IMS التحليل الكيميائي في سطح عينة الأنسجة دون عوامل استخراج أو تنقية أو فصل أو وضع العلامات أو تلطيخ العينات البيولوجية. ومع ذلك ، من أجل التحليل الناجح ، فإن الخطوة المحورية في هذه التقنية هي تحضير العينة ، خاصة في الأنسجة النباتية ، المتخصصة والمعدلة إلى أعضاء معقدة واسعة الانتشار بسبب التأقلم البيئي5.
بسبب الخصائص الفيزيائية والكيميائية المتأصلة في الأنسجة النباتية ، هناك حاجة إلى بروتوكول مكيف ليناسب متطلبات تحليل MALDI-IMS والحفاظ على الشكل الأصلي للأنسجة أثناء تحضير التقسيم6،7. في حالة العينات غير التقليدية ، مثل البذور ، لا تنطبق البروتوكولات8 المعمول بها لأن هذه الأنسجة لها جدران خلوية صلبة ومحتوى مائي منخفض ، مما قد يتسبب بسهولة في تجزئة القسم ويؤدي إلى عدم تمركز المركب9.
نشرت مجموعتنا البحثية بيانات تجريبية حول رسم الخرائط الجزيئية وبروتوكولا معدلا لتحليل MALDI-IMS لبذور الأساي (Euterpe oleracea Mart.)10،11،12 ، وهو منتج ثانوي تم إنشاؤه بكميات كبيرة أثناء إنتاج لب الأساي القابل للتأجير13. كانت الفكرة هي تطوير بروتوكول لرسم الخرائط في الموقع لمختلف المستقلبات في بذور الأساي ، مما يساعد على اقتراح الاستخدامات الممكنة لهذه النفايات الزراعية التي لا يتم استكشافها تجاريا حاليا. ومع ذلك، ونظرا لمقاومة بذور الأساي، كان من الضروري وضع بروتوكول للحصول على تقسيم مناسب للعينات من تحليل نظام الرصد الدولي التابع لوزارة التنمية المحلية.
في هذا السياق ، حفز لب الأساي المهم اقتصاديا على زيادة تسويق الفواكه الأخرى من أشجار النخيل من جنس Euterpe ذات الخصائص الحسية المماثلة. ثمار شجرتي النخيل الناشئتين اللتين تم إنتاجهما على نطاق صناعي كبديل ل açaí14,15 هما E. precatoria (المعروفة باسم açaí-do-amazonas) ، التي تنمو في الأراضي الجافة في الأمازون ، و E. edulis (المعروفة باسم juçara) ، وهي نموذجية من غابة المحيط الأطلسي. ومع ذلك ، فإن استهلاك açaí-do-amazonas و juçara يؤدي إلى نفس التراكم للبذور المقاومة وغير الصالحة للأكل التي لم يتم الاستفادة منها ولم تتم دراستها حتى الآن فيما يتعلق بتركيبها الكيميائي المفصل.
وهكذا، فإننا نوضح هنا أن البروتوكول الذي سبق وضعه يمكن استخدامه، مع القليل من التعديلات، لتحليل بذور E. precatoria و E. edulis لرسم الخرائط الجزيئية بواسطة MALDI-IMS، مما يثبت أنه أداة قوية يمكن استخدامها لتحليل تكوين هذه الموارد ويمكن أن تساعد في تحديد استخداماتها المحتملة في مجال التكنولوجيا الحيوية. وعلاوة على ذلك، فإن الوصف التفصيلي المقدم هنا يمكن أن يساعد الآخرين الذين يواجهون صعوبات مماثلة في إعداد مواد مقاومة لتحليل نظام الرصد الدولي التابع لوزارة التنمية في المالديف.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
تم التبرع ببذور Euterpe precatoria من قبل المعهد الوطني ل Pesquisas da Amazônia (ماناوس ، البرازيل) ، وتم التبرع ببذور Euterpe edulis من قبل Silo - Arte e Latitude Rural (Resende ، البرازيل) بعد عملية إزالة اللب الصناعي. تم حفظ البذور في صناديق بلاستيكية محكمة الغلق في درجة حرارة الغرفة.
1. التحليل الطيفي الكتلي للتصوير بالليزر بمساعدة المصفوفة (MALDI-IMS)
- بروتوكول تقسيم البذور
- اترك ثلاث بذور من كل نوع تجلس في ماء منزوع الأيونات لمدة 24 ساعة.
- في اليوم التالي ، قم بتشغيل cryostat (انظر جدول المواد) واتركه يصل إلى -20 درجة مئوية.
- أخرج البذور الرطبة من الماء. قطع البذور إلى نصفين باستخدام شفرة ميكروتوم (انظر جدول المواد).
- تحضير محلول جيلاتين طازج ودافئ (10٪) (انظر جدول المواد).
- ضع نصف البذرة على قالب واملأها بالجيلاتين الطازج. تجمد عند -80 درجة مئوية لمدة 2 ساعة قبل تناوله إلى جهاز التبريد.
- قم بتوصيل البذور المضمنة بدعامة cryostat باستخدام مركب درجة حرارة القطع الأمثل (OCT ، انظر جدول المواد) واتركها لمدة 10 دقائق داخل cryostat لتصلب OCT.
- أضف شريطا لاصقا نحاسيا مزدوج الوجه (انظر جدول المواد) إلى شريحة زجاجية مطلية بأكسيد القصدير الإنديوم (شريحة ITO ؛ انظر جدول المواد).
- أنتج مقاطع بسمك 20 ميكرومتر من كل نوع وضعها على شريط لاصق نحاسي مزدوج الوجه ملتصق بشريحة زجاج ITO.
ملاحظة: في هذه المرحلة ، يمكن تخزين الشرائح التي تم جمعها على الشرائح في فريزر -80 درجة مئوية ؛ بدلا من ذلك ، انتقل إلى ترسب المصفوفة. يجب وضع الشرائح في صندوق شرائح حامل ، وغسلها بالغازيةN 2 ، وإغلاقها بغشاء لمنع أكسدة العينة (انظر جدول المواد).
- ترسب المصفوفة
- ضع الشريحة التي تحتوي على شرائح في مجفف مفرغ من الهواء حتى تصل إلى درجة حرارة الغرفة.
- قم بعمل علامات تدريس باستخدام قلم تصحيح في كل زاوية شريحة. امسح الشريحة ضوئيا باستخدام ماسح ضوئي للطاولة. اضبط على دقة 4800 نقطة في البوصة.
- استخدم ميزان تحليلي لوزن 30 مجم من حمض 2،5-ثنائي هيدروكسي بنزويك (DHB ؛ انظر جدول المواد) وتحضير 1 مل من 1: 1 ميثانول: 0.1٪ حمض ثلاثي فلورو أسيتيك (TFA ؛ جدول المواد) حل لحل DHB.
- املأ حقنة زجاجية سعة 1 مل (انظر جدول المواد) بمحلول DHB وضعها في مضخة حقنة (انظر جدول المواد) مضبوطة على معدل تدفق 0.8 مل / ساعة.
- باستخدام أنبوب PEEK ، قم بتوصيل المحقنة بإبرة التأين الكيميائي للضغط الجوي (APCI) (انظر جدول المواد).
- قم بتوصيل N2 بإبرة APCI واضبطها على معدل تدفق 12.5 رطل لكل بوصة مربعة .
- قم بتوصيل إبرة APCI بمنصة الحركة xy (انظر جدول المواد). تأكد من أن طرف إبرة APCI أعلى من الشريحة بمقدار 4 سم .
- باستخدام برنامج الرسم (انظر جدول المواد والشكل التكميلي 1) ، اضبط منصة الحركة xy لتتبع القالب. يتكون القالب من خطوط متوازية أفقية متباعدة بمقدار 1 مم.
- لتحقيق ترسيب المصفوفة ، انتظر حتى تكرر منصة الحركة xy القالب 20 مرة.
تنبيه: يجب أن يتم ترسيب المصفوفة في غطاء دخان كيميائي.
- اقتناء التصوير
- ضع الشريحة في مطياف الكتلة (انظر جدول المواد).
- استخدم علامات قلم التصحيح لتعيين نقاط التدريس على البرنامج المشار إليه (انظر جدول المواد).
- اضبط طاقة الليزر (60٪) وتركيز الليزر (متوسط) وعدد اللقطات (100) والقطبية في البرنامج (انظر جدول المواد). قم بتعيين عامل تقليل البيانات بنسبة 99٪ واحفظ ملف FID لمعايرة البيانات الخلفية. احفظ الطريقة.
- حدد المنطقة المراد تحليلها باستخدام أداة إضافة منطقة قياس المضلع من برنامج مطياف الكتلة. قم بتحرير معلمات منطقة القياس التي تشير إلى الطريقة المحفوظة في الخطوة السابقة وعرض البيانات النقطية إلى 100 ميكرومتر (الشكل التكميلي S4A).
- ابدأ في الحصول على التصوير.
- تحليل البيانات
- استخدم مجموعة المصفوفة والملوثات المعروفة لإنشاء قائمة كتلة في البرنامج المشار إليه (انظر جدول المواد) في علامة تبويب المعايرة (الشكل التكميلي S4B).
- افتح البيانات المراد معايرتها في البرنامج المشار إليه (انظر جدول المواد). في علامة تبويب المعايرة ، افتح قائمة الكتلة التي تم إنشاؤها وافتح مربع حوار بالنقر بزر الماوس الأيمن واختر خيار تعيين كتل القفل (الشكل التكميلي S4C).
- حدد وضع النافذة الغاوسية مع توسيع 0.5 غاوسي وتوسيع 3.5 خط. اترك المعايرة عبر الإنترنت بدون تحديد. حدد الوضع (فردي) والعتبة (1000) والتفاوت الكتلي (5 جزء في المليون). معايرة البيانات مع العملية وحفظ أداة البيانات ثنائية الأبعاد (الشكل التكميلي S4C).
- بعد المعايرة، قم بتصدير البيانات إلى مختبر SCiLS أو أي برنامج متوافق آخر وقم بتعيين عتبة قيمة m/z المطلوبة (النطاق المختار: 150 إلى 2500).
ملاحظة: بناء على حجم الملف أو خصائص الكمبيوتر، قد يستغرق ذلك بعض الوقت. - اختر طريقة تسوية بين إجمالي عدد الأيونات (TIC) أو جذر متوسط التربيعي (RMS).
ملاحظة: لهذا التحليل ، تم اختيار TIC. - إذا كانت التحليلات المراد تعيينها معروفة ، فقم برسم كل قيمة m / z لكل مادة محولة واحفظ الصور التي تم إنشاؤها ومخطط المتوسط الطيفي.
ملاحظة: في هذا العمل ، تم اختيار قيم m / z من oligomers hexose من خلال النظر في مقرب البوتاسيوم.
- استخدم مجموعة المصفوفة والملوثات المعروفة لإنشاء قائمة كتلة في البرنامج المشار إليه (انظر جدول المواد) في علامة تبويب المعايرة (الشكل التكميلي S4B).
2. التحليل الطيفي المشتت للطاقة (EDS)
- بروتوكول تقسيم البذور
- احصل على شريحة بذور رقيقة في آلة منشار التقسيم (انظر جدول المواد).
- قطع البذور بالمعلمات التالية: سرعة قطع 500 دورة في الدقيقة ، وشحنة تحميل 100 نيوتن ، وشفرة رقاقة ماسية 15 HC (انظر جدول المواد).
ملاحظة: تعامل مع الإزالة اليدوية للألياف من البذور بسبب الالتصاق اللازم بالتثبيت في الأقنعة الدقيقة المرفقة بمقياس اللجنون. نظف الشفرة قبل الاستخدام ، وقطع جزء من البذور لمنع إضافة المعادن غير المرغوب فيها أثناء التحليل. - امسح العينات بالهواء المضغوط لإزالة جميع بقايا الجسيمات من القطع (انظر جدول المواد).
- ثبت قسم البذور في شريط موصل للكربون على الوجهين (انظر جدول المواد) في الدعم.
- شروط التحليل
- قم بتوصيل الدعم بقسم البذور داخل غرفة التفريغ في المجهر الإلكتروني الماسح (SEM) إلى جانب EDS (انظر جدول المواد).
- الحصول على صور مجهرية إلكترونية على مجهر نموذجي بتسارع 20 كيلو فولت وحجم بقعة 4.0 ، باستخدام إشارات الإلكترون الثانوية (انظر جدول المواد) ، والإلكترونات المرتدة (كاشف الحالة الصلبة المثبت على القطعة القطبية) ، ومخاليط من هذين النوعين من الإشارات (MIX) ، وبناء صور ملونة بشكل مصطنع.
- للحصول على أطياف EDS ، استخدم مطياف (انظر جدول المواد) إلى جانب SEM المذكور أعلاه. تكوين الشرط للحصول على الصورة من EDS هو نفس SEM.
- اضبط درجات الإمالة والارتفاع والسمت على 0.0 و 35.0 و 0.0 على التوالي.
- الحصول على البيانات
- قم بتعيين ثلاث مناطق مختلفة مع تكبير 91x لقسم البذور للحصول على البيانات.
- تحديد القمم في الطيف عند إنهاء الاستحواذ أو أثناء الاستحواذ. استخدم زر خطوة تأكيد العناصر لتعريف القمم يدويا.
- اضبط وقت الاستحواذ على 60 ثانية لكل منطقة محددة. اضبط وقت العملية على خمسة ؛ المعلمات متاحة لوقت عملية من واحد إلى ستة.
ملاحظة: علامات العناصر ثابتة وتتراكم ، في حين أن الضوضاء عشوائية وضارة. كلما زاد وقت المعالجة ، انخفضت الضوضاء. - الإعدادات الافتراضية لعرض نتائج كمية مهمة أعلى من سيجما (الانحراف المعياري). اضبط سيجما على الصفر لتقليل النتائج غير المرغوب فيها.
- تطبيع كل شدة العناصر ؛ هذه معلمة موحدة في البرنامج (انظر جدول المواد).
- لتحليل البيانات ، قم بتصديرها في ملف DOC.
- تحليل البيانات
- ضمان القياس الدقيق لشدة الذروة للتحليل الكمي للعناصر.
- تتطلب القمم المتداخلة فك الالتفاف من أجل فصل أفضل للذروة ؛ اطرح خلفية صاخبة عند الحاجة.
- عندما لا يكون هناك تداخل ، قم بزيادة الكسب لتضخيم الإشارات وتحسين جودة الطيف.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
وقد مكن البروتوكول المبتكر نظام الرصد الدولي من تحليل نظام الرصد الدولي التابع ل MALDI-IMS لبذور E. precatoria و E. edulis. نتيجة لذلك ، يمكننا تأكيد الوزن الجزيئي للكربوهيدرات ودرجة البلمرة (DP) كتوضيح هيكلي جزئي. أظهرت المعلومات الجزيئية المقدمة من تحليل MALDI-IMS (الشكل 1 والشكل 2) قمم تمثل [M + K] + مواد مضافة من الأوليغومرات السداسية (Δ = 162 Da) دون إضافة الملح إلى المصفوفة. تم تحديد ثنائيات سداسية (م / ض 381) ، وتشذيب (م / ض 543) ، ورباعيات (م / ض 705) ، وخماسي (م / ض 867) ، وسداسي (م / ض 1029) ، وما يصل إلى 14 وحدة أوليغومرات (م / ض 2325) في كلا أنسجة البذور. تشير المخططات الصندوقية لكلتا العينتين (الشكل 3) إلى ذروة كثافة كل أوليغومر سداسي موجود في السويداء البذري ، مما يدل على توزيعاتها ومحتوى أعلى قليلا من الأوليغومرات عالية DP.
في السابق ، قدمنا بيانات EDS عن بذور E. oleracea ، والتي أشارت إلى أن مضافات البوتاسيوم المكتشفة في تحليل MALDI-IMS كانت بسبب الخاصية الجوهرية للعينة المتمثلة في ارتفاع محتوى البوتاسيوم10. قامت هذه الدراسة أيضا بتحليل بذور E. precatoria و E. edulis لتحديد العناصر الرئيسية في أقسام العينة (الشكل التكميلي S2 والشكل التكميلي S3). كان التركيب الذري الذي لوحظ على سطح الأنسجة موزعا بشكل متجانس ، حيث أظهر بشكل أساسي العناصر غير المعدنية ، مثل الكربون والأكسجين ، ومحتوى معدني أقل. في كلتا العينتين ، كان البوتاسيوم هو العنصر المعدني الرئيسي الذي وجده تحليل EDS (الشكل التكميلي S2 والشكل التكميلي S3).
الشكل 1: توزيع أوليغومر سداسي في بذور Euterpe precatoria بواسطة MALDI-IMS في الوضع الإيجابي. (أ) الطيف الكتلي الذي تم الحصول عليه. (ب) الصورة النسيجية والإطار المستخدم في تحليل نظام الرصد الدولي التابع ل MALDI. (C-O) تمثيلات الصور لإشارة m / z محددة تصف شدتها في الأنسجة لكل [M + K] + تقريب من السداسي الثنائي (C) ، أداة التشذيب (D) ، حتى 14 وحدة (E-O) في السويداء للبذور. شريط المقياس = 4 مم (B). الاختصار: MALDI-IMS = قياس الطيف الكتلي للامتزاز بالليزر / التصوير بالتأين بمساعدة المصفوفة. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: توزيع أوليغومر سداسي في بذور Euterpe edulis بواسطة MALDI-IMS في الوضع الإيجابي. (أ) الطيف الكتلي الذي تم الحصول عليه. (ب) الصورة النسيجية والإطار المستخدم في تحليل نظام الرصد الدولي التابع ل MALDI. (C-O) تمثيلات الصور لإشارة m / z محددة تصف شدتها في الأنسجة لكل [M + K] + تقريب من السداسي الثنائي (C) ، أداة التشذيب (D) ، حتى 14 وحدة (E-O) في السويداء للبذور. شريط المقياس = 5 مم (B). الاختصار: MALDI-IMS = قياس الطيف الكتلي للامتزاز بالليزر / التصوير بالتأين بمساعدة المصفوفة. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3: تصورات مخطط الصندوق. (أ) (E. precatoria) و(ب) E. edulis، مما يشير إلى ذروة كثافة وتوزيعات كل أوليغومر سداسي الشكل موجود في نسيج البذور. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل التكميلي S1: قالب طلاء المصفوفة. تم رش مصفوفة DHB على المنصة باستخدام برنامج الرسم للتوزيع المتساوي على شريحة 75 مم × 25 مم من الخطوط المتوازية الأفقية المتباعدة بمقدار 1 مم. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الملف.
الشكل التكميلي S2: تحليل التركيب الأولي لبذور E. precatoria بواسطة مطياف الأشعة السينية المشتت للطاقة. (أ) قسم سطح عينة بذور E. precatoria. (ب) العناصر الرئيسية شبه الكمية. تتوافق المكونات الرئيسية مع حوالي 47.0٪ كربون (C) و 52.7٪ أكسجين (O) و 0.2٪ بوتاسيوم (K). الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الملف.
الشكل التكميلي S3: تحليل التركيب الأولي لبذور E. edulis بواسطة مطياف الأشعة السينية المشتت للطاقة. (أ) مقطع سطح عينة E. edulis. (ب) العناصر الرئيسية شبه الكمية. تتوافق المكونات الرئيسية مع حوالي 47.7٪ كربون (C) ، و 53.8٪ أكسجين (O) ، و 0.3٪ بوتاسيوم (K) ، وبعض آثار الكلور (Cl). الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الملف.
الشكل التكميلي S4: تحديد المنطقة في صورة وتحليل البيانات. (أ) تحديد المنطقة المراد تحليلها وتحرير المعلمات وعرض البيانات النقطية إلى 100 ميكرومتر. (ب) تحديد مجموعة مصفوفة وإنشاء قائمة كتلة. (ج) معايرة البيانات وحفظ أداة البيانات 2D. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الملف.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
تتكون النباتات من أنسجة متخصصة لوظائف كيميائية حيوية محددة. ولذلك، يجب تصميم بروتوكول تحضير العينات لنظام الرصد الدولي التابع ل MALDI-IMS وفقا لمختلف الأنسجة النباتية ذات الخواص الفيزيائية والكيميائية المحددة، حيث يجب أن تحافظ العينات على توزيعها الأصلي للتحليل ووفرتها للحصول على إشارة عالية الجودة واستبانة مكانية8.
وقبل تحليل نظام الرصد الدولي التابع لوزارة التنمية والمياه، كان الاعتبار الأساسي هو جمع العينات وتخزينها على النحو السليم. ومع ذلك ، في النباتات ، غالبا ما يختلف تحضير العينة اعتمادا على الأنسجة التي تم تحليلها. على سبيل المثال ، قد يشكل تقشير جدار الخلية ومحتوى الماء في أنسجة النبات تحديات أثناء التقسيم للحفاظ على تمثيل دقيق للتشكل في العينة7.
يمكن تقسيم تحليل MALDI-IMS إلى سير عمل يتكون من تحضير الأنسجة وتقسيمها وطلاء المصفوفة وتحليل البيانات. ومع ذلك ، تتأثر جودة وأصالة نتائج التصوير بشكل مباشر بطريقة تحضير العينة ، وهي خطوة حاسمة. استندت طريقة تحضير العينة المستخدمة في هذه الدراسة إلى بروتوكول نشر سابقا للبذور الناضجة E. oleracea 10. للتحقق من صحة بروتوكول التقسيم للعينات الأخرى ، قمنا بتقييم خطوات تقسيم العينات باستخدام بذور E. precatoria و E. edulis للحصول على مقاطع رقيقة (20 ميكرومتر) وتمكين تحليل MALDI-IMS بدقة مناسبة. يتم وصف معظم المعلومات بالتفصيل في قسم البروتوكول ؛ ومع ذلك ، فإننا نؤكد أن الإزالة اليدوية لطبقة الألياف الخارجية هي خطوة مهمة لتليين البذور ، مما يسمح بتقسيم الشفرة.
وعادة ما لا يشجع على سير العمل النسيجي القياسي بالنسبة لنظام الرصد الدولي المدرج في نظام الرصد المالي، لأن إجراءات التثبيت قد تؤدي إلى تأثيرات كبت الأيونات. التشريح بالتبريد هو الطريقة الأكثر استخداما لإعداد العينة. ومع ذلك ، قد يحدث انكماش أو انهيار العينة ، مما يوفر خلع الأيض ويعيق التفسير البيولوجي 5,8. الاحتمال الآخر للأنسجة الرخوة مثل الأوراق والزهور هو طريقة الطباعة. ومع ذلك ، بالنسبة لهذه الدراسة ، نظرا لطبيعة الأنسجة الصلبة وانخفاض محتوى الماء في العينات ، كانت التقنية المستخدمة قبل التقسيم هي تضمين العينة بمواد محددة لتوفير أقسام أنسجة دقيقة وعالية الجودة.
من الجدير بالذكر أن سمك الأنسجة يمكن أن يؤدي إلى انخفاض شدة الإشارة. بشكل عام ، يتطلب MALDI-IMS سمك شريحة <20 ميكرومتر لتوفير دقة كافية. ومع ذلك ، فإن الأنسجة النباتية الصلبة والكبيرة تتكسر بشكل عام أثناء تقسيم عينة رقيقة. لحل هذه المشكلة ، استخدم البروتوكول شريطا لاصقا موصلا مصنوعا من النحاس16 ، مما قلل من تشويه الأقسام وسهل التعلق بالشريحة. علاوة على ذلك ، من الصعب الحصول على جزء رفيع من البذرة بأكملها دون نقعها في ماء منزوع الأيونات طوال الليل. ومع ذلك ، فإن تضمين العينة لهذا القدر من الوقت يمكن أن يسبب خلع الأيض. لذلك ، في دراسة نشرت سابقا مع E. oleracea seed11 ، قارنا الأقسام الصغيرة (الرطبة والجافة) مع وبدون خطوة النقع ، والتي أشارت النتائج منها إلى عدم وجود خلع للبروسيانيدين الموجود في tegument البذور.
يعد ترسيب المصفوفة خطوة حاسمة أخرى لتجانس المصفوفة على سطح قسم الأنسجة ، مما يضمن تأين التحليل. بالنسبة لترسب مصفوفة MALDI ، قمنا بتقييم ، في الاختبارات الأولية ، مصفوفات مختلفة ، مثل 9-aminoacridine (9AA) ، α-cyano-4-hydroxycinnamic acid (HCCA) ، 1،5-diaminonapthalene (DAN) ، و 2،5-حمض ثنائي هيدروكسي بنزويك (DHB). تم اختيار DHB كمصفوفة لأنها توفر استبانة أفضل لإشارات الكربوهيدرات (البيانات غير معروضة) وأيضا بسبب طبيعة "التحليل العالمي"1 ؛ ومع ذلك ، استخدمت الطريقة الأصلية نهج التسامي10,17 ، بينما استخدمنا هذه المرة الرش الآلي الآلي للتحكم في ظروف طلاء المصفوفة وتوفير تطبيق أكثر اتساقا وبلورات مصفوفة أصغر للحصول على صورة عالية الدقة ولتجنب تأثيرات قمع الأيونات.
تعرض E. precatoria و E. edulis بذورا كروية الشكل مع السويداء متجانسة ضخمة مغطاة بطبقة خارجية رقيقة ، والتي تختلف فقط عن بذور E. oleracea بسبب السويداء المجترر المميز10،18،19. وفرت الطبيعة غير التقليدية الموجودة لهذه العينات النباتية صعوبات معالجة مماثلة لبروتوكولات التقسيم وترسب المصفوفة المكيفة. ومع ذلك ، تشير هذه النتائج إلى أن تحضير العينة كان كافيا وقدم صورا موثوقة وفعالة ، والتي حددت التوطين المكاني للمستقلبات في بذور E. precatoria و E. edulis . مكنت تحليلات MALDI-IMS من الاستغلال المحتمل لهذه المواد الخام لأول مرة في الأدبيات بناء على بيانات رسم الخرائط الجزيئية.
أشارت بيانات EDS إلى وجود البوتاسيوم أقل من 1٪ في أنسجة البذور التي تم تحليلها من E. edulis و E. precatoria. ومع ذلك، كان التركيز مرتفعا بما يكفي لتوفير قمم [M+K]+ أثناء تحليل نظام الرصد الدولي التابع ل MALDI-IMS. حددت الدراسات المنشورة سابقا البوتاسيوم باعتباره المعدن الرئيسي الموجود في كلتا البذرتين 20,21 ، مما يشير إلى وجود طبيعي للبوتاسيوم في بذور جنس Euterpe وشرح الإضافات في بيانات MALDI-IMS لهذه الأنواع.
في هذه الدراسة ، قمنا أيضا بتقييم إثبات المفهوم بأن البروتوكول الذي تم وضعه لبذور E. oleracea تم تنفيذه لبذور E. precatoria و E. edulis. السكاريد الاحتياطي الموجود في السويداء لبذور الأساي (E. oleracea) هو بشكل رئيسي المنان22 ، الذي يكون تنظيمه شديد التبلور ، مما يعزز صلابة السويداء للحصول على أقسام رقيقة من البذور الناضجة10,19. حددت الدراسات السابقة الكربوهيدرات في السويداء لكلتا البذرتين بطرق الجاذبية ، حيث وجدت محتوى أعلى من 90٪ من الوزن الجاف للبذور20,21. علاوة على ذلك ، اقترحت دراسة الكيمياء النسيجية في E. edulis وجود المنان في السويداء من خلال انكساره البلوري والقوي للغاية تحت الضوءالمستقطب 18. ومع ذلك ، لا توجد بيانات عن التركيب الكيميائي للكربوهيدرات الاحتياطية في السويداء لكل من البذور. ونظرا لقربها من بذور E. oleracea، فإن الأوليغومرات السداسية التي حددتها MALDI-IMS هي السكريات قليلة السكاريد المنان. ومع ذلك ، هناك حاجة إلى دراسات مستقبلية تقيم التركيب الكيميائي لهذه السكريات الاحتياطية لتأكيد هياكل المنان والمنان قليل السكاريد في بذور E. precatoria و E. edulis.
يمكن تطبيق هذا البروتوكول كأداة مفيدة في دراسات تلك البذور ، والتي تتجاوز هدفنا الموصوف هنا. على سبيل المثال ، يمكن أن تفيد هذه التقنية في تحليل العمليات الكيميائية الحيوية أثناء تطوير البذور وإنباتها. وأخيرا، يمكن أن يكون الوصف التفصيلي المقدم هنا نقطة انطلاق مفيدة لوضع بروتوكولات مكيفة لتحليل نظام الرصد الدولي التابع ل MALDI للمواد المقاومة الأخرى من النباتات.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
يعلن أصحاب البلاغ عدم وجود تضارب في المصالح.
Acknowledgments
تم تمويل هذا العمل من قبل معهد Serrapilheira (Serra-1708-15009) ، ومؤسسة Carlos Chagas Filho لدعم البحوث في ولاية ريو دي جانيرو (FAPERJ-JCNE-SEI-260003 / 004754 / 2021). قدم معهد Serrapilheira والمجلس الوطني للتنمية العلمية والتكنولوجية (CNPq) منحا دراسية للدكتور فيليبي لوبيز بروم والدكتور غابرييل ر. مارتينز (برنامج بناء القدرات المؤسسية / INT / MCTI). تم الاعتراف بالتنسيق من أجل تحسين موظفي التعليم العالي (CAPES) لمنح منحة ماجستير للسيد دافي إم إم سي دا سيلفا. تم الاعتراف بمركز الطيف في ماساس دي بيولوجيكولاس (CEMBIO-UFRJ) للخدمات المقدمة مع تحليلات MALDI-IMS ، والسيد آلان مينيزيس دو ناسيمنتو ومركز Caracterização em Nanotecnologia para Materiais e Catálise (CENANO-INT) ، بتمويل من MCTI / SISNANO / INT-CENANO-CNPQ منحة Nº 442604/2019 ، نشكرهم على تحليل التكوين الأولي.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 mL Gastight Syringe Model 1001 TLL, PTFE Luer Lock | Hamilton Company | 81320 | |
| 2,5-Dihydroxybenzoic acid | Sigma Aldrich Co, MO, USA | 149357 | |
| APCI needle | Bruker Daltonik, Bremen, Germany | 602193 | |
| AxiDraw V3 xy motion platform | Evil Mad Scientist, CA, USA | 2510 | |
| Carbon double-sided conductive tape | |||
| Compass Data Analysis software | creation of mass list | ||
| Compressed air | |||
| copper double-faced adhesive tape | 3M, USA | 1182-3/4"X18YD | |
| Cryostat CM 1860 UV | Leica Biosystems, Nussloch, Germany | ||
| Diamond Wafering Blade 15 HC | |||
| Everhart-Thornley detector | |||
| FlexImaging | Bruker Daltonik, Bremen, Germany | image acquisition | |
| FTMS Processing | Bruker Daltonik, Bremen, Germany | data calibration | |
| Gelatin from bovine skin | Sigma Aldrich Co, MO, USA | G9391 | |
| High Profile Microtome Blades Leica 818 | Leica Biosystems, Nussloch, Germany | 0358 38926 | |
| indium tin oxide coated glass slide | Bruker Daltonik, Bremen, Germany | 8237001 | |
| Inkscape | Inkscape Project c/o Software Freedom Conservancy, NY, USA | ||
| IsoMet 1000 precision cutter | Buehler, Illinois, USA | ||
| Methanol | J.T.Baker | 9093-03 | |
| Mili-Q water | 18.2 MΩ.cm | ||
| Oil vacuum pump | |||
| Optimal Cutting Temperature Compound | Fisher HealthCare, Texas, USA | 4585 | |
| Parafilm "M" Sealing Film | Amcor | HS234526B | |
| Quanta 450 FEG | FEI Co, Hillsboro, OR, USA | ||
| SCiLS Lab (Multi-vendor support) MS Software | Bruker Daltonik, Bremen, Germany | ||
| Software INCA Suite 4.14 V | Oxford Instruments, Ableton, UK | ||
| Solarix 7T | Bruker Daltonik, Bremen, Germany | ||
| Syringe pump | kdScientific, MA, USA | 78-9100K | |
| Trifluoroacetic acid | Sigma Aldrich Co, MO, USA | 302031 | |
| X-Max spectrometer | Oxford Instruments, Ableton, UK |
References
- Buchberger, A. R., DeLaney, K., Johnson, J., Li, L. Mass spectrometry imaging: a review of emerging advancements and future insights. Analytical Chemistry. 90 (1), 240-265 (2018).
- Heeren, R. M. A. MALDITechniques in Mass Spectrometry Imaging. Encyclopedia of Spectroscopy and Spectrometry. , Elsevier Ltd. (2017).
- Shariatgorji, M., Svenningsson, P., Andrén, P. E. Mass spectrometry imaging, an emerging technology in neuropsychopharmacology. Neuropsychopharmacology. 39 (1), 34-49 (2014).
- Zaima, N., Hayasaka, T., Goto-Inoue, N., Setou, M. Matrix-assisted laser desorption/ionization imaging mass spectrometry. International Journal of Molecular Sciences. 11 (12), 5040-5055 (2010).
- Qin, L., et al. Recent advances in matrix-assisted laser desorption/ionisation mass spectrometry imaging (MALDI-MSI) for in Situ analysis of endogenous molecules in plants. Phytochemical Analysis. 29 (4), 351-364 (2018).
- Bhandari, D. R., et al. High resolution mass spectrometry imaging of plant tissues: Towards a plant metabolite atlas. Analyst. 140 (22), 7696-7709 (2015).
- Boughton, B. A., Thinagaran, D., Sarabia, D., Bacic, A., Roessner, U. Mass spectrometry imaging for plant biology: a review. Phytochemistry Reviews. 15 (3), 445-488 (2016).
- Dong, Y., et al. Sample preparation for mass spectrometry imaging of plant tissues: a review. Frontiers in Plant Science. 7, 60 (2016).
- Zhang, Y. X., Zhang, Y., Shi, Y. P. A reliable and effective sample preparation protocol of MALDI-TOF-MSI for lipids imaging analysis in hard and dry cereals. Food Chemistry. 398, 133911 (2023).
- Brum, F. L., Martins, G. R., Mohana-Borges, R., da Silva, A. S. The acquisition of thin sections of açaí (Euterpe oleracea Mart.) seed with elevated potassium content for molecular mapping by mass spectrometry imaging. Rapid Communications in Mass Spectrometry. , e9474 (2023).
- Martins, G. R., et al. Chemical characterization, antioxidant and antimicrobial activities of açaí seed (Euterpe oleracea Mart.) extracts containing A- and B-type procyanidins. LWT. 132, 109830 (2020).
- Martins, G. R., et al. Phenolic profile and antioxidant properties in extracts of developing açaí (Euterpe oleracea Mart.) seeds. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 70 (51), 16218-16228 (2022).
- Jorge, F. T. A., Silva, A. S. A., Brigagão, G. V. Açaí waste valorization via mannose and polyphenols production: techno-economic and environmental assessment. Biomass Conversion and Biorefinery. , (2022).
- Carvalho, L. M. J., Esmerino, A. A., Carvalho, J. L. V. Jussaí (Euterpe edulis): a review. Food Science and Technology. 42, (2022).
- Yamaguchi, K. K. dL., Pereira, L. F. R., Lamarão, C. V., Lima, E. S., Veiga-Junior, V. F. d Amazon acai: chemistry and biological activities: A Review. Food Chemistry. 179, 137-151 (2015).
- Wu, R., et al. Copper adhesive tape attached to the reverse side of a non-conductive glass slide to achieve protein MALDI-imaging in FFPE-tissue sections. Chemical Communications. 57 (82), 10707-10710 (2021).
- Dufresne, M., Patterson, N. H., Norris, J. L., Caprioli, R. M. Combining salt doping and matrix sublimation for high spatial resolution MALDI imaging mass spectrometry of neutral lipids. Analytical Chemistry. 91 (20), 12928-12934 (2019).
- Aguiar, M. O., de Mendonça, M. S. Morfo-anatomia da semente de Euterpe precatoria Mart (Palmae). Revista Brasileira de Sementes. 25, 37-42 (2003).
- Panza, V., Láinez, V., Maldonado, S. Seed structure and histochemistry in the palm Euterpe edulis. Botanical Journal of the Linnean Society. 145 (4), 445-453 (2004).
- Alves, V. M., et al. Provenient residues from industrial processing of açaí berries (Euterpe precatoria Mart): nutritional and antinutritional contents, phenolic profile, and pigments. Food Science and Technology. 42, (2022).
- Inada, K. O. P., et al. Screening of the chemical composition and occurring antioxidants in jabuticaba (Myrciaria jaboticaba) and jussara (Euterpe edulis) fruits and their fractions. Journal of FunctionalFoods. 17, 422-433 (2015).
- Monteiro, A. F., Miguez, I. S., Silva, J. P. R. B., Silva, A. S. High concentration and yield production of mannose from açaí (Euterpe oleracea Mart.) seeds via mannanase-catalyzed hydrolysis. Scientific Reports. 9 (1), 10939 (2019).
