De ontwikkeling en toepassing van biofysische assays voor het evalueren van ternaire complexvorming geïnduceerd door proteolyse gericht op chimeren (PROTACS)

Summary

Hier beschrijven we protocollen voor de biofysische karakterisering van ternaire complexvorming geïnduceerd door proteolyse gericht op chimeren (PROTACS) waarbij de ubiquitine-ligases Von Hippel-Lindau E3-ligase (VHL) en Cereblon (CRBN) betrokken zijn. Biofysische methoden die hierin worden geïllustreerd, zijn onder meer oppervlakteplasmonresonantie (SPR), biolaaginterferometrie (BLI) en isotherme titratiecalorimetrie (ITC).

Abstract

E3-ligases en eiwitten die voor afbraak zijn bestemd, kunnen door heterobifunctionele moleculen in een meerstapsproces worden geïnduceerd om complexen te vormen. De kinetiek en thermodynamica van de betrokken interacties dragen bij aan de efficiëntie van ubiquitinatie en de daaruit voortvloeiende afbraak van het eiwit. Biofysische technieken zoals oppervlakteplasmonresonantie (SPR), biolaaginterferometrie (BLI) en isotherme titratiecalorimetrie (ITC) leveren waardevolle informatie op die kan worden gebruikt bij de optimalisatie van die interacties. Met behulp van twee modelsystemen werd een biofysische testtoolkit opgesteld voor het begrijpen van de coöperatie van ternaire complexvorming en de impact van het ‘haakeffect’ op de bindingkinetiek. In één geval werd een proteolyse-gericht op chimaera-molecuul (PROTAC) geëvalueerd dat de vorming van ternaire complexen tussen Brd4^BD2 en VHL induceerde. Het heterobifunctionele molecuul, MZ1, heeft nM-affiniteiten voor zowel het Brd4^BD2-eiwit (SPR K D = 1 nM, ITC K D = 4 nM) als het VHL-complex (SPR K D = 29 nM, ITC K _D = 66 nM). Voor dit systeem werden robuuste SPR-, BLI- en ITC-assays ontwikkeld die gepubliceerde resultaten reproduceerden die de coöperatie van ternaire complexvorming aantoonden. In het andere geval werd een molecuul bestudeerd dat ternaire complexen induceerde tussen een 46,0 kDa-eiwit, PPM1D en cereblon [CRBN (319-442)]. Het heterobifunctionele molecuul, BRD-5110, heeft een SPR K D = 1 nM voor PPM1D maar een veel zwakkere binding tegen het afgeknotte CRBN (319-442) complex (SPR K_D = ~ 3 μM). In dat geval was de binding voor CRBN in SPR niet verzadigbaar, wat resulteerde in een “haak-effect”. De doorvoer- en reagensvereisten voor SPR, BLI en ITC werden geëvalueerd en er werden algemene aanbevelingen gedaan voor de toepassing ervan op PROTAC-projecten.

Introduction

De polyubiquitinatie van eiwitten in de cel is een strak gereguleerd proces waarbij enzymen uit de Ubiquitine Ligase-familie betrokken^zijn1,2. De terminale enzymen in de route zijn de E3-ubiquitine-ligasen die covalent ubiquitinemoleculen hechten aan hun eiwitbindende partners³. De polyubiquitinatie van die eiwitbindende partners richt zich op proteolytische afbraak door het proteasoom⁴. Dit systeem maakt deel uit van het eiwithomeostaseproces dat therapeutisch is gebruikt om de afbraak van eiwitten die betrokken zijn bij ziekte te induceren⁵. Kleine moleculen die de interactie tussen E3-ubiquitineligasen induceren, zoals Von Hippel-Lindau E3-ligase (VHL) of cereblon (CRBN), zijn meestal samengesteld uit een E3-ligase-bindende kernkop die door een flexibele linker is verbonden met een kernkop die bindt aan het eiwit dat het doelwit is van afbraak. Deze heterobifunctionele moleculen worden gewoonlijk aangeduid als proteolyse gericht op chimeren of PROTACS⁶.

De ontwikkeling van PROTACS omvat het evalueren van het vermogen van moleculen om de afbraak van eiwitten in cellen te induceren. Er zijn veel cellulaire testsystemen ontwikkeld die de geïnduceerde interactie tussen het doeleiwit en E3-ligasecomponenten, zoals VHL of CRBN, bewaken bij behandeling van de cellen met een PROTAC-molecuul. Een van die cellulaire tests, het nanoluc-Halotag-systeem⁷, omvat een E3-ligase dat is gefuseerd met de Halotag-acceptor en een doeleiwit dat is gelabeld met een nanoluc-donor. Ternaire complexvorming brengt de nanoluc-donor en de Halotag-acceptor in de buurt waardoor de overdracht van energie van de donor naar de acceptor mogelijk wordt, wat resulteert in de emissie van licht. Variaties van dit systeem kunnen worden gebruikt om de cellulaire permeabiliteit van PROTACS-moleculen⁸ of veranderingen in het relatieve niveau van ubiquitinatie van doeleiwitten⁹ te beoordelen. Hoewel deze cellulaire systemen essentieel zijn voor het stimuleren van de optimalisatie van PROTACS, is de vorming van complexen tussen E3-ligasen en eiwitten die gericht zijn op afbraak een proces in meerdere stappen^10,11. De kinetiek en thermodynamica van de betrokken binaire en ternaire interacties dragen bij aan efficiëntie, ubiquitinatie en de daaruit voortvloeiende afbraak van het eiwit^12,13,14.

Hierin worden protocollen beschreven die kunnen worden aangepast voor de biofysische karakterisering van ternaire complexvorming geïnduceerd door PROTACS met behulp van oppervlakteplasmonresonantie (SPR), biolaaginterferometrie (BLI) en isotherme titratiecalorimetrie (ITC). SPR- en ITC-protocollen voor het MZ1 PROTAC-molecuul dat ternaire complexvorming tussen Brd4^BD2 en VHL induceert, afgeleid van literatuurrapporten^13,15 en hier beschreven, waren in staat om de gerapporteerde resultaten samen te vatten met enige wijziging van de gerapporteerde procedures^, die zullen worden besproken. Een beschrijving van een BLI-test die wordt gebruikt om de vorming van ternaire complexen tussen MZI, Brd4,^BD2 en VHL te evalueren, is opgenomen in dit rapport. Affiniteitsmetingen van BLI waren consistent met die waargenomen in SPR en ITC. Een eerder gepubliceerd protocol waarin een SPR-test werd ontwikkeld voor het beoordelen van de PROTAC-geïnduceerde ternaire complexvorming tussen PPM1D, een Ser/Thr-eiwitfosfatase waarvan de expressie op een p53-afhankelijke manier wordt geïnduceerd¹⁶, en CRBN wordt ook beschreven. In dit geval heeft het PROTAC-molecuul een nanomolaire affiniteit voor PPM1D, maar alleen een micromolaire affiniteit voor CRBN. In dit geval is de binding van het PROTAC-molecuul aan CRBN niet verzadigbaar, wat resulteert in het algemeen waargenomen “haakeffect”. Het haakeffect is een eigenschap van drie lichaamssystemen waarin er twee soorten zijn die een heterotrimer complex kunnen vormen wanneer beide gebonden zijn aan een overbruggend molecuul (Figuur 1)¹⁷. Het haakeffect wordt waargenomen wanneer de overbruggingssoort in overconcentratie is ten opzichte van de twee andere soorten. De resulterende toestand is er een waarin de binaire interacties de ternaire interacties overtreffen. De systemen waarbij het haakeffect wordt waargenomen, vereisen specifieke experimentele ontwerpoverwegingen die in dit rapport worden besproken. Er worden algemene concepten en reagensvereisten gegeven voor het evalueren van het gebruik van biofysische assays voor de evaluatie van PROTAC-geïnduceerde ternaire complexvorming.

Protocol

Alle eiwitten werden tot overexpressie gebracht in E.coli met een goede opbrengst en zuiverheid (>80%) volgens de literatuurprotocollen18. Biotinylering werd uitgevoerd met behulp van een BirA-gekatalyseerde reactie18. Alle kleine moleculen werden bereid op 1 mM stockoplossingen in 100% DMSO. De hierin beschreven procedures vereisen geen gespecialiseerde laboratoriumveiligheidsapparatuur of voorzorgsmaatregelen. Er moeten standaard persoonlijke beschermingsmiddelen…

Representative Results

Karakterisering van VHL: MZ1 binair complex en VHL: MZ1: Brd4BD2 ternair complex is te vinden in Figuur 2 (ITC), Figuur 3 (BLI) en Figuur 4 (SPR) met behulp van een zeer vergelijkbare buffer. De KD geëxtraheerd uit orthogonale assays is consistent. De coöperatie kan worden berekend door K D (binair) / KD (ternair), wat zeer positief is (15 van ITC of 26 van SPR). <p class="jove_conte…

Discussion

Biofysische karakterisering van de binaire en ternaire interacties tussen PROTAC-moleculen en hun eiwitbindende partners kan unieke en complementaire inzichten opleveren met betrekking tot veelgebruikte cellulaire systemen. Inzicht in de affiniteit tussen elke kernkop van een PROTAC-molecuul en zijn eiwitbindende partners kan helpen bij het begeleiden van medicinale chemische inspanningen in de richting van de optimalisatie van die interacties. Eerder gepubliceerde kristalstructuren van ternaire PROTAC-complexen hebben a…

Materials

96-plate	Greiner	655076	flat-bottom, black plates used In BLI experiments
96-well plate	Nunc	73520-120	Plate use for ITC sample preparation
96-well plate	Greiner	650101	Plate used to prepare samples for SPR experiments
Auto iTC200 micro-calorimeter	Malvern Panalytical		Instrument used to perform ITC experiments. Product discontinued.
Biacore S200	Cytiva	29136649	Instrument used to perform SPR experiments
MZ1	ProbeChem	PC-60099	PROTAC that binds to VHL and Brd4BD2
NTA sensor chip	Cytiva	BR100532	SPR chip used to perform SPR experiments involving PPM1D
Octet Red-384	Sartorius		Instrument used to perform BLI experiments. Product discontinued.
Plate cover	Malvern	PQA0001	Cover for Nunc 96-well plate (73520-120)
Plate cover	Cytiva	28975816	Plate cover for Greiner plate (650101)
Series S SA sensor chip	Cytiva	BR100531	SPR chip used to perform SPR experiments involving MZ1:VHL:BRD4
Streptavidin (SA) Dip and Read Biosensors	Sartorius	18-509	Coated sensors used in BLI experiments