Kimeraları Hedefleyen Proteoliz Tarafından İndüklenen Üçlü Kompleks Oluşumunun Değerlendirilmesi için Biyofiziksel Testlerin Geliştirilmesi ve Uygulanması (PROTACS)
Summary
Burada, ubikitin ligazları Von Hippel-Lindau E3 ligaz (VHL) ve Cereblon (CRBN) içeren kimeraları (PROTACS) hedefleyen proteoliz tarafından indüklenen üçlü kompleks oluşumunun biyofiziksel karakterizasyonu için protokolleri açıklıyoruz. Burada gösterilen biyofiziksel yöntemler arasında yüzey plazmon rezonansı (SPR), biyokatman interferometrisi (BLI) ve izotermal titrasyon kalorimetrisi (ITC) bulunur.
Abstract
Bozunma için hedeflenen E3 ligazları ve proteinleri, çok aşamalı bir işlemde heterobifonksiyonel moleküller tarafından kompleksler oluşturmak üzere indüklenebilir. İlgili etkileşimlerin kinetiği ve termodinamiği, ubikitinasyonun verimliliğine ve bunun sonucunda proteinin bozulmasına katkıda bulunur. Yüzey plazmon rezonansı (SPR), biyokatman interferometrisi (BLI) ve izotermal titrasyon kalorimetrisi (ITC) gibi biyofiziksel teknikler, bu etkileşimlerin optimizasyonunda kullanılabilecek değerli bilgiler sağlar. İki model sistemi kullanılarak, üçlü kompleks oluşumunun işbirliğine dayalılığını ve ‘kanca etkisinin’ bağlanma kinetiği üzerindeki etkisini anlamak için bir biyofiziksel tahlil araç kiti oluşturulmuştur. Bir vakada, Brd4BD2 ve VHL arasında üçlü kompleks oluşumunu indükleyen kimera (PROTAC) molekülünü hedefleyen bir proteoliz değerlendirildi. Heterobifonksiyonel molekül olan MZ1, hem Brd4BD2 proteini (SPR K D = 1 nM, ITC K D = 4 nM) hem de VHL kompleksi (SPR K D = 29 nM, ITC K D = 66 nM) için nM afinitelerine sahiptir. Bu sistem için, üçlü kompleks oluşumunun işbirliğine elverişliliğini gösteren yayınlanmış sonuçları yeniden üreten sağlam SPR, BLI ve ITC tahlilleri geliştirilmiştir. Diğer durumda, 46.0 kDa’lık bir protein, PPM1D ve sereblon [CRBN (319-442)] arasında üçlü kompleksleri indükleyen bir molekül incelenmiştir. Heterobifonksiyonel molekül, BRD-5110, PPM1D için bir SPRKD = 1 nM’ye sahiptir, ancak kesilmiş CRBN (319-442) kompleksine (SPR KD = ~ 3 μM) karşı çok daha zayıf bağlanmaya sahiptir. Bu durumda, SPR’de CRBN için bağlanma doygun değildi ve bu da bir “kanca etkisi” ile sonuçlandı. SPR, BLI ve ITC için verim ve reaktif gereksinimleri değerlendirildi ve bunların PROTAC projelerine uygulanması için genel öneriler sağlandı.
Introduction
Hücredeki proteinlerin poliubikitinasyonu, Ubiquitin Ligas ailesi 1,2’deki enzimleri içeren sıkı bir şekilde düzenlenmiş bir süreçtir. Yoldaki terminal enzimler, ubikuitin moleküllerini protein bağlayıcı ortaklarınakovalent olarak bağlayan E3 ubikuitin ligazlarıdır 3. Bu protein bağlayıcı ortakların poliubikitinasyonu, onları proteazom4 tarafından proteolitik bozunma için hedefler. Bu sistem, hastalık5’te yer alan proteinlerin bozulmasını indüklemek için terapötik olarak kullanılan protein homeostazı sürecinin bir parçasıdır. Von Hippel-Lindau E3 ligaz (VHL) veya sereblon (CRBN) gibi E3 ubikitin ligazları arasındaki etkileşimi indükleyen küçük moleküller, tipik olarak, bozunma için hedeflenen proteine bağlanan bir savaş başlığına esnek bir bağlayıcı ile bağlanan bir E3 ligaz bağlayıcı savaş başlığından oluşur. Bu heterobifonksiyonel moleküller genellikle kimeraları veya PROTACS6’yı hedefleyen proteoliz olarak adlandırılır.
PROTACS’ın geliştirilmesi, moleküllerin hücrelerdeki proteinlerin bozulmasını indükleme yeteneğinin değerlendirilmesini içerir. Hücrelerin bir PROTAC molekülü ile muamelesi üzerine hedef protein ile VHL veya CRBN gibi E3 ligaz bileşenleri arasındaki indüklenmiş etkileşimi izleyen birçok hücresel tahlil sistemi geliştirilmiştir. Böyle bir hücresel tahlil olan nanoluc-Halotag sistemi7, Halotag alıcısına kaynaşmış bir E3 ligaz ve bir nanoluc donörü ile etiketlenmiş bir hedef protein içerir. Üçlü kompleks oluşumu, nanoluc donörü ve Halotag alıcısını yakınlaştırır ve donörden alıcıya enerji transferine izin vererek ışığın yayılmasına neden olur. Bu sistemin varyasyonları, PROTACS moleküllerinin8 hücresel geçirgenliğini veya hedef protein ubikitinasyonunun9 nispi seviyesindeki değişiklikleri değerlendirmek için kullanılabilir. Bu hücresel sistemler PROTACS’ın optimizasyonunu sağlamak için gerekli olsa da, E3 ligazları ve bozunması hedeflenen proteinler arasında komplekslerin oluşumu çok aşamalı bir süreçtir10,11. İlgili ikili ve üçlü etkileşimlerin kinetiği ve termodinamiği, verimliliğin her yerde bulunmasına ve bunun sonucunda proteininparçalanmasına katkıda bulunur 12,13,14.
Burada, yüzey plazmon rezonansı (SPR), biyotabaka interferometrisi (BLI) ve izotermal titrasyon kalorimetrisi (ITC) kullanılarak PROTACS tarafından indüklenen üçlü kompleks oluşumunun biyofiziksel karakterizasyonu için uyarlanabilen protokoller açıklanmaktadır. Literatür raporlarından türetilen Brd4BD2 ve VHL arasında üçlü kompleks oluşumunu indükleyen MZ1 PROTAC molekülü için SPR ve ITC protokolleri13,15 ve burada açıklanan, rapor edilen prosedürlerin bazı modifikasyonları ile rapor edilen sonuçları özetleyebilmiştir. MZI, Brd4BD2 ve VHL arasındaki üçlü kompleks oluşumunu değerlendirmek için kullanılan bir BLI testinin açıklaması bu rapora dahil edilmiştir. BLI’dan alınan afinite ölçümleri, SPR ve ITC’de gözlemlenenlerle tutarlıydı. Ekspresyonu p53’e bağımlı bir şekilde indüklenen bir Ser/Thr protein fosfatazolan PPM1D ile CRBN arasında PROTAC kaynaklı üçlü kompleks oluşumunu değerlendirmek için bir SPR testinin geliştirildiği daha önce yayınlanmış bir protokol de açıklanmaktadır. Bu durumda, PROTAC molekülü PPM1D için nanomolar bir afiniteye sahiptir, ancak CRBN için sadece bir mikromolar afiniteye sahiptir. Bu durumda, PROTAC molekülünün CRBN’ye bağlanması doygun değildir, bu da yaygın olarak gözlenen “kanca etkisi” ile sonuçlanır. Kanca etkisi, her ikisi de bir köprüleme molekülüne bağlandığında heterotrimerik bir kompleks oluşturabilen iki türün bulunduğu üç vücut sisteminin bir özelliğidir (Şekil 1)17. Kanca etkisi, köprüleme türleri diğer iki türe göre aşırı konsantrasyonda olduğunda gözlenir. Ortaya çıkan durum, ikili etkileşimlerin üçlü etkileşimleri geride bıraktığı bir durumdur. Kanca etkisinin gözlemlendiği sistemler, bu raporda tartışılan belirli deneysel tasarım hususlarını gerektirir. PROTAC kaynaklı üçlü kompleks oluşumunun değerlendirilmesi için biyofiziksel testlerin kullanımını değerlendirmek için genel kavramlar ve reaktif gereksinimleri sağlanmıştır.
Protocol
Representative Results
Discussion
PROTAC molekülleri ve bunların protein bağlayıcı ortakları arasındaki ikili ve üçlü etkileşimlerin biyofiziksel karakterizasyonu, yaygın olarak kullanılan hücresel sistemlere göre benzersiz ve tamamlayıcı bilgiler sağlayabilir. Bir PROTAC molekülünün her bir savaş başlığı ile protein bağlayıcı ortakları arasındaki afiniteyi anlamak, bu etkileşimlerin optimizasyonuna yönelik tıbbi kimya çabalarını yönlendirmeye yardımcı olabilir. Üçlü PROTAC komplekslerinin daha önce yayınlanm?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışma, MIT ve Harvard Broad Enstitüsü’ndeki Terapötik Geliştirme Merkezi’nden bir İnovasyon ve Teknoloji Geliştirme ödülü ile desteklenmiştir. Yazarlar, bu çalışmaya verdikleri destek için üst düzey liderlik ekibi üyelerine ve inceleme komitesine teşekkür etmek istemektedir.
Materials
| 96-plate | Greiner | 655076 | flat-bottom, black plates used In BLI experiments |
| 96-well plate | Nunc | 73520-120 | Plate use for ITC sample preparation |
| 96-well plate | Greiner | 650101 | Plate used to prepare samples for SPR experiments |
| Auto iTC200 micro-calorimeter | Malvern Panalytical | Instrument used to perform ITC experiments. Product discontinued. | |
| Biacore S200 | Cytiva | 29136649 | Instrument used to perform SPR experiments |
| MZ1 | ProbeChem | PC-60099 | PROTAC that binds to VHL and Brd4BD2 |
| NTA sensor chip | Cytiva | BR100532 | SPR chip used to perform SPR experiments involving PPM1D |
| Octet Red-384 | Sartorius | Instrument used to perform BLI experiments. Product discontinued. | |
| Plate cover | Malvern | PQA0001 | Cover for Nunc 96-well plate (73520-120) |
| Plate cover | Cytiva | 28975816 | Plate cover for Greiner plate (650101) |
| Series S SA sensor chip | Cytiva | BR100531 | SPR chip used to perform SPR experiments involving MZ1:VHL:BRD4 |
| Streptavidin (SA) Dip and Read Biosensors | Sartorius | 18-509 | Coated sensors used in BLI experiments |
References
- Balaji, V., Hoppe, T. Regulation of E3 ubiquitin ligases by homotypic and heterotypic assembly. F1000Research. 9, (2020).
- Song, L., Luo, Z. -. Q. Post-translational regulation of ubiquitin signaling. Journal of Cell Biology. 218 (6), 1776-1786 (2019).
- Yang, Q., Zhao, J., Chen, D., Wang, Y. E3 ubiquitin ligases: styles, structures and functions. Molecular Biomedicine. 2 (1), 23 (2021).
- Grice, G. L., Nathan, J. A. The recognition of ubiquitinated proteins by the proteasome. Cellular and Molecular Life Sciences: CMLS. 73 (18), 3497-3506 (2016).
- Chirnomas, D., Hornberger, K. R., Crews, C. M. Protein degraders enter the clinic – a new approach to cancer therapy. Nature Reviews Clinical Oncology. 20 (4), 265-278 (2023).
- Toure, M., Crews, C. M. Small-molecule PROTACS: New approaches to protein degradation. Angewandte Chemie (International ed. In English). 55 (6), 1966-1973 (2016).
- Ottis, P., Toure, M., Cromm, P. M., Ko, E., Gustafson, J. L., Crews, C. M. Assessing different E3 ligases for small molecule induced protein ubiquitination and degradation. ACS Chemical Biology. 12 (10), 2570-2578 (2017).
- Riching, K. M., et al. Quantitative live-cell kinetic degradation and mechanistic profiling of PROTAC mode of action. ACS Chemical Biology. 13 (9), 2758-2770 (2018).
- Nabet, B., et al. The dTAG system for immediate and target-specific protein degradation. Nature Chemical Biology. 14 (5), 431-441 (2018).
- Paiva, S. -. L., Crews, C. M. Targeted protein degradation: elements of PROTAC design. Current Opinion in Chemical Biology. 50, 111-119 (2019).
- Hershko, A., Ciechanover, A. The ubiquitin system. Annual Review of Biochemistry. 67, 425-479 (1998).
- Chan, K. -. H., Zengerle, M., Testa, A., Ciulli, A. Impact of target warhead and linkage vector on inducing protein degradation: Comparison of bromodomain and extra-terminal (BET) degraders derived from triazolodiazepine (JQ1) and tetrahydroquinoline (I-BET726) BET inhibitor scaffolds. Journal of Medicinal Chemistry. 61 (2), 504-513 (2018).
- Roy, M. J., et al. SPR-measured dissociation kinetics of PROTAC ternary complexes influence target degradation rate. ACS Chemical Biology. 14 (3), 361-368 (2019).
- Pierce, N. W., Kleiger, G., Shan, S., Deshaies, R. J. Detection of sequential polyubiquitylation on a millisecond timescale. Nature. 462 (7273), 615-619 (2009).
- Gadd, M. S., et al. Structural basis of PROTAC cooperative recognition for selective protein degradation. Nature Chemical Biology. 13 (5), 514-521 (2017).
- Nahta, R., Castellino, R. C. Phosphatase magnesium-dependent 1 δ (PPM1D), serine/threonine protein phosphatase and novel pharmacological target in cancer. Biochemical Pharmacology. 184, 114362 (2021).
- Douglass, E. F., Miller, C. J., Sparer, G., Shapiro, H., Spiegel, D. A. A comprehensive mathematical model for three-body binding equilibria. Journal of the American Chemical Society. 135 (16), 6092-6099 (2013).
- Zorba, A., et al. Delineating the role of cooperativity in the design of potent PROTACs for BTK. Proceedings of the National Academy of Sciences. 115 (31), E7285-E7292 (2018).
- Fairhead, M., Howarth, M. Site-specific biotinylation of purified proteins using BirA. Methods in Molecular Biology. 1266, 171-184 (2015).
- Nowak, R. P., et al. Plasticity in binding confers selectivity in ligand-induced protein degradation. Nature Chemical Biology. 14 (7), 706-714 (2018).
