En optimeret museembryonal stamcellebaseret omvendt polytransfektionsteknik til hurtig udforskning af nukleinsyreforhold

Summary

Denne protokol beskriver en metode til omvendt polytransfektion af embryonale stamceller fra mus under dyrkning med 2i- og LIF-medier. Denne metode giver højere levedygtighed og effektivitet end traditionelle fremadrettede transfektionsprotokoller, samtidig med at den muliggør optimering af plasmidforhold med en gryde.

Abstract

På grund af sin relative enkelhed og brugervenlighed er forbigående transfektion af pattedyrs cellelinjer med nukleinsyrer blevet en grundpille i biomedicinsk forskning. Mens de mest anvendte cellelinjer har robuste protokoller til transfektion i vedhæftende todimensionel kultur, oversætter disse protokoller ofte ikke godt til mindre studerede linjer eller dem med atypiske, vanskelige at transfektere morfologier. Ved hjælp af musepluripotente stamceller dyrket i 2i/LIF-medier, en meget anvendt dyrkningsmodel til regenerativ medicin, skitserer denne metode en optimeret, hurtig omvendt transfektionsprotokol, der er i stand til at opnå højere transfektionseffektivitet. Ved at udnytte denne protokol udføres en tre-plasmid polytransfektion, der udnytter den højere end normale effektivitet i plasmidlevering til at studere et udvidet udvalg af plasmidstøkiometri. Denne omvendte polytransfektionsprotokol giver mulighed for en eksperimentel metode med en gryde, der gør det muligt for brugerne at optimere plasmidforhold i en enkelt brønd snarere end på tværs af flere co-transfektioner. Ved at lette den hurtige udforskning af effekten af DNA-støkiometri på den samlede funktion af leverede genetiske kredsløb minimerer denne protokol tid og omkostninger ved embryonal stamcelletransfektion.

Introduction

Levering af DNA og RNA til pattedyrceller fungerer som en kernesøjle i biomedicinsk forskning¹. En almindelig metode til at indføre eksogene nukleinsyrer (NA) i pattedyrceller er gennem forbigående transfektion ^2,3. Denne teknik er afhængig af at blande NA med kommercielt tilgængelige transfektionsreagenser, der er i stand til at levere dem ind i modtagercellerne. NA leveres typisk via fremadgående transfektion, hvor celler, der klæber til en todimensionel overflade, modtager transfektionskomplekset. Mens fremadtransfektion for de mest almindelige etablerede cellelinjer er robust, og protokoller er velpublicerede, transfekterer flere nichecelletyper med ikke-monolagsmorfologier ikke let, hvilket begrænser mængden af NA, der kan leveres, og antallet af celler, der modtager det.

Pluripotente stamceller (PSC'er) tjener som en attraktiv model til forståelse af udvikling og som et værktøj til regenerativ medicin på grund af deres evne til at dele sig på ubestemt tid og producere enhver kropscelletype. For mus PSC'er (mPSC'er) opretholder rutinemæssige in vitro-dyrkningsbetingelser med 2 hæmmere og LIF (2i/LIF) en kuppellignende kolonimorfologi, hvilket direkte begrænser antallet af celler, der udsættes for en fremadrettet transfektion ^4,5,6. For at løse dette kan en omvendt transfektion udføres: celler tilsættes til en skål, der indeholder medier og transfektionsreagens, snarere end at tilføje transfektionsreagens til klæbende celler⁷. Mens dette øger antallet af celler, der udsættes for reagenset, kræver det også, at cellerne passeres og transfekteres samtidigt.

Ved at bevæge sig ud over simple enkelt-NA-transfektioner sigter forskere ofte mod at levere flere NA-konstruktioner til en population af celler in vitro. Dette opnås typisk gennem en co-transfektion, hvor NA'erne blandes i et givet forhold (1: 1, 9: 1 osv.) og derefter kombineres med det valgte transfektionsreagens⁸. Dette giver en blanding af NA'er og reagens, der bevarer det oprindelige forhold mellem NA'er og hinanden - mens celler i behandlingen kan modtage forskellige mængder af denne blanding, modtager de alle det samme forhold⁹. Selvom dette er fordelagtigt, når det ønskede forhold mellem dele er kendt, kan det være arbejdskrævende at bestemme dette forhold på forhånd, hvor hvert forhold udgør en anden tilstand. Et alternativ er at udføre en "polytransfektion", hvor individuelle NA'er blandes med transfektionsreagenset uafhængigt af hinanden⁹. Ved at kombinere transfektionskomplekser, der indeholder individuelle NA'er (snarere end at kombinere NA'er, før de opretter komplekserne), kan forskere udforske en bred vifte af NA-støkiometrier i et enkelt transfektionseksperiment⁹. Dette er især værdifuldt i tilfælde, hvor produkter fra flere nationale agenturer forventes at interagere med hinanden, f.eks. med inducerbare transskriptionssystemer eller systemer med indbygget feedback i ^1,10,11. For at gøre det effektivt er der imidlertid behov for en høj transfektionseffektivitet. Når antallet af unikke transfekterede NA'er stiger, falder sandsynligheden for, at en given celle modtager alle de ønskede NA'er, eksponentielt ^9,12.

Følgende rapport beskriver en omvendt transfektionsprotokol for mPSC'er ved hjælp af et kationisk lipidbaseret transfektionsreagens, hvor celler udsættes for reagens-NA-blandingen i maksimalt 5 minutter for at maksimere levedygtigheden og minimere tiden uden for typiske kulturforhold. Sammenligning af denne protokol med standard fremadgående transfektion af disse celler viser en højere transfektionseffektivitet og en stigning i det samlede antal overlevende transfekterede celler. Ved at kombinere denne omvendte transfektion med en tre-plasmid polytransfektion, der involverer enkle fluorescerende reportere, demonstreres et udvidet potentiale til at screene NA-forhold med høj transfektionseffektivitet.

Protocol

1. Fremstilling af reagenser til mPSC-kultur

1. Forbered N2 supplement.
   1. Under ikke-sterile forhold fremstilles følgende stamopløsninger (trin 1.1.1.1) i en kemisk sikkerhedsrøghætte. Tilsæt det faste pulver af hvert kemikalie til et forvejet 50 ml konisk rør. Hvert glas vejes efter tilsætning af pulveret, og der tilsættes en passende mængde solvens for at opnå nedenstående koncentrationer. For en batch af medier skal du forberede det mindste beløb, der er angivet.
      BEMÆRK: Følgende reagenser er farlige og skal håndteres i overensstemmelse med lokale kemiske sikkerhedsretningslinjer. Sørg for korrekt PPE ved håndtering, og arbejd kun med de faste pulverformer af disse kemikalier i en kemisk damphætte for at forhindre indånding.
      1. Minimum 0,05 ml natriumselenit i vand ved 0,518 mg/ml, 0,5 ml putrescine i vand ved 160 mg/ml, 0,165 ml progesteron i 100% ethanol ved 0,6 mg/ml (se materialetabel).
      2. Opbevar opløsninger ved -20 °C i op til 2 år.
   2. I et biosikkerhedsskab (BSC) tilsættes følgende til 58.035 ml DMEM-F12.
      1. 0,05 ml af en 0,518 mg / ml natriumselenitopløsning, 0,5 ml af en 160 mg / ml putrescine opløsning, 0,165 ml af en 0,6 mg / ml progesteron opløsning.
      2. Filtersteriliser ovennævnte blanding med et 0,22 μm filter.
   3. Stadig i BSC fremstilles en 100 mg/ml opløsning af apotransferrin.
      1. Tilsæt 5 ml DMEM-F12 til 500 mg apotransferrin (se materialetabel). Langsomt resuspend og vask beholderen, undgå bobler.
      2. Efter resuspendering og fjernelse så meget som muligt med 5 ml, tilsættes det til selenit / putrescine / progesteronopløsningen. Tag mere af den tidligere opløsning og vask apotransferrinflasken, og få så meget af det ud som muligt.
   4. Der tilsættes 5 ml 7,5% BSA-fraktion V (se materialetabel) til opløsningen.
   5. Bland og alikvote 6.875 ml pr. Rør. Opbevar alikvoter ved -80 °C i op til 1 år.
   6. Når ovenstående N2-delprøver anvendes til fremstilling af N2B27-medier, optøes den ønskede delprøve, og der tilsættes 3,125 ml af en 4 mg/ml insulinopløsning (se materialetabellen) til 6,875 N2 for 10 ml 100x N2.
2. Forbered N2B27 basale medier.
   1. Optø N2 og B27 kosttilskud i et 4 °C køleskab i et par timer eller natten over.
   2. I en BSC blandes 484,5 ml DMEM-F12 og 484,5 ml neurobasale medier (se materialetabel) i en steril 1 L flaske.
   3. Tilsæt 10 ml B27 og 10 ml N2 supplement til mediet.
   4. Tilsæt 1 ml 55 mM beta-mercaptoethanol (se materialetabellen). Tilsæt 10 ml 100x glutamax. Bland kraftigt ved at hvirvle flasken.
   5. Den ønskede mængde pr. alikvote (typisk 100 ml) annulleres og opbevares ved -80 °C i op til 1 år. Opbevares i brug efter optøning ved 4 °C i op til 3 uger.
3. Forbered NBiL-medier.
   1. En 100 ml alikvote N2B27 basalmedier optøs fra -80 °C i 4 °C køleskabet.
   2. I en BSC tilsættes LIF (se materialetabel) til en slutkoncentration på 10 μg/l.
   3. Der lægges CHIR99021 (3 μM endelig) og PD0325901 (1 μM endelig) (se Materialetabel). Bland godt med en 50 ml serologisk pipette. Opbevares ved 4 °C i op til 2 uger.
4. Forbered 0,2% gelatineopløsning.
   1. 500 ml dobbeltdestilleret H₂O overføres til en 1 L glasflaske.
   2. Mål 1 g gelatine (se materialetabel) og tilsæt det til vandet. Bland ved at ryste flasken, indtil den er mest opløst.
   3. Autoklave gelatinen og vandblandingen ved 15 psi, 121 °C i 35 min. Når det er afkølet, steriliseres filteret med et 0,22 μm filter i en BSC. Opbevares ved 4 °C.
5. Klargør vaskemedier.
   1. I en BSC blandes 160 μL 7,5% BSA pr. 10 ml DMEM-F12.
   2. Skaler ovenstående og forbered i store mængder for nem fremtidig brug (f.eks. 8 ml 7,5% BSA til 500 ml DMEM-F12). Opbevares ved 4 °C.

2. Fremstilling af reagenser til mPSC polytransfektion

BEMÆRK: Følgende værdier er angivet for en enkelt brønd i en 24-brøndplade. Værdier kan skaleres i overensstemmelse hermed. Sekvenserne af alle DNA/plasmider er beskrevet i supplerende fil 1.

1. Beregn mængden af DNA-opløsning, der er nødvendig pr. Behandling.
   1. Forbered 500 ng DNA pr. brønd/tilstand.
      1. Hvis et enkelt plasmid transfekteres med en DNA-opløsning på 100 ng/μL, fremstilles et rør med 5 μL DNA.
      2. Hvis der transfekteres to plasmider ved hver 100 ng/μL, fremstilles to glas med 2,5 μL i hver, et for hvert plasmid.
2. I en BSC skal du udføre følgende: For hver 500 ng transfektionsbehandling (se materialetabel) alikvote 25 μL OptiMEM i et 1,5 ml rør.
   1. Skaler dette i overensstemmelse hermed - for eksemplet ovenfor skal du forberede to rør, hver med 250 ng DNA (2,5 μL) og 12,5 μL OptiMEM.
3. Tilsæt den nødvendige mængde DNA til denne behandling til OptiMEM i røret.
4. For hvert rør med 500 ng DNA og OptiMEM oprettes et matchende rør med yderligere 25 μL OptiMEM og 1 μL kationisk lipidbaseret transfektionsreagens.
   1. Igen skal disse værdier skaleres i overensstemmelse hermed. I ovenstående eksempel fremstilles to reagensglas, hver med 12,5 μL OptiMEM og 0,5 μL transfektionsreagens.
      BEMÆRK: Når du skalerer værdier, skal du bruge massen af tilsat DNA, ikke det volumen, der kræves til den mængde DNA. Reaktioner med transfektionsreagens og DNA kan skaleres (f.eks. hvis 5 brønde skal transfekteres med det samme DNA). Hold forholdet mellem reagenser det samme, men skaler i overensstemmelse hermed (f.eks. 1000 ng DNA: 50 μL OptiMEM: 2 μL transfektionsreagens: 50 μL OptiMEM).

3. Forberedelse af mPSC'er til transfektion

BEMÆRK: Til omvendt transfektion skal du forberede kulturbeholderen og passere mPSC'erne direkte, før transfektionsreagenserne tilsættes. Til fremadtransfektion, passage og plade cellerne 12-18 timer før transfektion for at lade cellerne klæbe til pladen.

1. Forbered en 0,2% gelatinebelagt cellekulturbeholder.
   1. Planlæg antallet af brønde, der er nødvendige til transfektionen (en brønd med en 24-brøndplade pr. Behandling / gruppe).
   2. Tilsæt 200 μL af 0,2% gelatineopløsningen til hver af de ønskede brønde i 24-brøndpladen.
   3. Ryst forsigtigt pladen for at sprede opløsningen jævnt og sikre, at den dækker hele bunden af brønden.
   4. Lad hullerne belægge i mindst 15 minutter ved stuetemperatur.
   5. Brug en vakuumaspirator til forsigtigt at fjerne eventuel resterende gelatine fra brøndene (vip pladen for at sikre fjernelse af al væske uden at skrabe gelatinelaget af).
   6. Der tilsættes 0,5 ml NBiL-medier (trin 1.3) til hvert hul, og pladen efterlades i en vævskulturinkubator for at forvarme.
2. Passage mPSC'er.
   1. Der hældes 30 ml vaskemedie (trin 1.5) i et 50 ml konisk rør.
   2. Opsug de gamle medier fra vævskulturskålen fra mESC'er.
      BEMÆRK: Flere aspirationsteknikker er tilladt. Uanset hvilken teknik der vælges, skal du sørge for, at cellerne ikke forbliver tørre i længere perioder (maks. ca. 30 s).
   3. Tilsæt den nødvendige mængde kommercielt tilgængeligt celledetatchmentmedium (1,5 ml til en 10 cm skål, skaler i overensstemmelse hermed, se materialetabel).
   4. Vent i 3-5 minutter, før du pipetterer op og ned 15-20 gange med en P1000-pipette for at opnå en enkeltcellesuspension. Se celler under et mikroskop for at sikre en enkeltcellesuspension.
   5. Overfør cellerne i detatchmentmediet til 50 ml røret indeholdende vaskemedier.
   6. Der centrifugeres ved 300 x g i 5 minutter ved stuetemperatur. Opsug vaskemediet, og sørg for, at der ikke er nogen resterende væske tilbage i røret.
   7. Resuspender pellet i en lille mængde vaskemedier (~ 300 μL). Tæl cellesuspensionen ved hjælp af et hæmocytometer for at opnå celletætheden.

4. Omvendt transfektion af mPSC'er

1. Forbered polytransfektionsreagenser i henhold til trin 2.
2. Forbered cellekulturbeholderen og passage mPSC'er i henhold til trin 3.
3. Alikvote 200 μL NBiL medier til 1,5 ml reagensglas, et for hver behandling.
4. Der tilsættes 26 μL af OptiMEM:transfektionsreagensblandingen til DNA:OptiMEM-blandingen. Reagenserne blandes hurtigt og kraftigt ved pipettering ca. 10 gange. Lad blandingen inkubere ved stuetemperatur i 5 min.
5. Baseret på celletæthed overføres det krævede volumen af celler fra 300 μL cellesuspensionen til 200 μL NBiL-rørene for at opnå 25.000 celler pr. Rør.
6. Efter 5 minutters inkubation af lipofectamin 2000 (L2K, transfektionsreagens) og DNA-blandingen, tilsættes den til 1,5 ml røret med celler og blandes godt ved pipettering. Lad cellerne inkubere med reagenset i 5 minutter ved stuetemperatur.
7. Der centrifugeres ved 300 x g i 5 minutter ved stuetemperatur. Væsken pipetteres ud, så der efterlades ca. 50 μL.
8. Cellepillen resuspenderes med 100 μL NBiL-medier. Overfør cellerne til pladen og læg pladen i inkubatoren. Skift mediet 24 timer senere med friske NBiL-medier.

5. Fremadrettet transfektion af mPSC'er

1. 12-18 timer før transfektion skal cellekulturbeholderen og passagen af mPSC'er klargøres i henhold til trin 3.
2. Baseret på celletæthed overføres det krævede volumen af celler fra 300 μL celleblandingen til frø 25.000 celler pr. Brønd. Placer pladen i inkubatoren.
3. 1 time før transfektion aspireres mediet fra alle huller og erstattes med 0,5 ml NBiL-medier. Placer pladen i inkubatoren.
4. På tidspunktet for transfektion fremstilles mPSC polytransfektionsreagenser i henhold til trin 2.
5. Der tilsættes 26 μL af OptiMEM:transfektionsreagensblandingen til DNA:OptiMEM-blandingen. Reagenserne blandes hurtigt og kraftigt ved pipettering ca. 10 gange. Lad den kombinerede blanding inkubere ved stuetemperatur i 5 minutter.
6. Tilsæt den kombinerede blanding til brøndene dråbevis. Placer pladen i inkubatoren. Skift mediet 24 timer senere.

6. Flowcytometri

1. Opsug mediet fra den transfekterede 24-brøndplade 48 timer efter transfektion.
2. Der tilsættes 200 μL trypsin til hvert hul, hvirvles rundt og inkuberes i 30 s ved 37 °C. Bank på siderne af pladen, og tilsæt 200 μL iskold FACS-buffer (2% FBS i PBS).
3. Åbn og mærk en V-bund 96-brønds plade, startende fra A1. Bland indholdet af hvert hul på den transfekterede plade for at løsne celler og lav enkeltcelleopløsninger med en P200-pipette. Overfør 200 μL fra hvert hul til det relevante hul på 96-brøndpladen.
4. Der tilsættes 15 ml FACS-buffer til et 50 ml reagensreservoir. Pladen centrifugeres ved 300 x g i 5 minutter ved stuetemperatur. Supernatanten kasseres ved at vende 96-brøndpladen på hovedet i vasken med en hurtig og jævn bevægelse.
5. Brug en multikanalpipette til at resuspendere pellets på 96-brøndpladen i 150 μL FACS-buffer fra reagensbeholderen. Gentag trin 6.4-6.5 to gange. Anbring 96-brøndpladen i en isfyldt kasse, der er beskyttet mod lys.
6. Kør prøverne gennem et flowcytometer for at opnå populationsfordelingen af de fluorescerende reportere.
   1. Sørg for, at cytometeret er passende med hensyn til laser- og filterkombinationer til det eksperiment, der skal udføres (f.eks. Brug ikke en infrarød reporter, hvis det ikke er muligt at excitere eller detektere i det fjerne røde spektrum).
   2. Inkluder yderligere prøver til standardiseringsperler for at muliggøre MEFL-konvertering af data under analyse. Sørg for, at der indsamles nok celler pr. prøve til passende statistisk analyse⁹.
7. Konverter fluorescerende enheder fra de rå cytometerfiler og analyser dataene ved hjælp af en af flere metoder, såsom Python- eller MATLAB-baserede rørledninger eller kommercielt tilgængelig software ^9,13.

Representative Results

Både fremadgående og omvendte transfektioner er afhængige af interaktionen mellem cellemembranen og indgående transfektionsreagens-DNA-komplekser, hvilket muliggør levering af NA til modtagercellerne. Hvor disse teknikker adskiller sig, er cellens tilstand ved levering - mens DNA typisk leveres til klæbende cellemonolag i traditionel fremadtransfektion, er omvendt transfektion i stedet afhængig af at få reagens-DNA-komplekset til at møde cellerne, mens de er i en enkeltcellesuspension. Denne forskel kan være særlig afgørende i situationer, hvor celler ikke vokser som et ensartet, fladt monolag og i stedet vedtager en mere kuplet eller kolonilignende morfologi, som med mPSC'er. Yderligere variationer på traditionel transfektion kan vedtages, såsom at udføre en polytransfektion i stedet for en co-transfektion. Denne ændring ændrer de relative fordelinger af hver DNA-art i en given behandling, så forskere hurtigt kan udforske forholdet mellem fænotype og doseringen af deres plasmider. Ved udførelse af disse eksperimenter er det også afgørende at udføre standardisering og kvalitetskontrol af selve cytometeret. Fluorescerende enheder for flere af nedenstående eksperimenter er blevet normaliseret til en fluorescerende perlestandard for at muliggøre nøjagtig sammenligning på tværs af forsøgsdage (supplerende figur 1) i henhold til etablerede protokoller¹³. Cellerne blev lukket manuelt som vist (supplerende figur 2).

I betragtning af kolonimorfologien af mPSC'er ville traditionelle fremadtransfektionsmetoder være begrænset af antallet af celler, der udsættes direkte for de omgivende medier. Sammenlignet med omvendte transfektioner havde fremadgående transfektioner en signifikant lavere andel af celler, der var positive for markøren (>3 gange mindre, p < 0,05, figur 1A) på trods af at der i gennemsnit blev leveret en ikke-signifikant lavere mængde DNA til populationen af celler (~ 1,3 gange, figur 1B).

Interessant nok påvirkede inkubationstiden signifikant andelen af celler, der var positive for indberetteren, men ikke det gennemsnitlige reporterudtryk i de positive celler (figur 2A, B). Inkubation af celler i så længe som 20 minutter blev set at øge procentdelen af celler, der var positive for indberetteren, med længere end 40 minutter faldende denne procentdel. Kritisk, mens udførelse af omvendt transfektion ved at tilføje reagenset direkte i brønden med gennempassede celler gav de højeste %-positive og gennemsnitlige ekspressionsniveauer, resulterede det også i et lavere antal overlevende celler ved det valgte endepunkt. Mens en stigning i transfektionseffektiviteten kan ses, når der inkuberes ud over de foreslåede 5 minutter for denne protokol, tilrådes forsigtighed, da langvarig forstyrrelse kan have konsekvenser for stamcelletilstand og differentieringsevne⁶. For at klarlægge virkningen af poly- og co-reverse og forward transfektioner på den samlede vækst af celler efter transfektion, udførte vi celletællinger 48 timer efter transfektion (figur 3). For både poly- og co-transfektion reducerede udførelse af en fremadgående transfektion signifikant antallet af celler, der var til stede ved det valgte endepunkt, sammenlignet med omvendte transfektioner. Der blev ikke observeret nogen signifikant forskel ved sammenligning mellem poly- og co-transfektion inden for omvendte eller fremadgående transfektioner.

Ved sammenligning af fremadgående og omvendt polytransfektion er der en observerbart højere transfektionseffektivitet i tilfælde af omvendte transfektioner (figur 4A). Med tre fluorescerende reportere, der leveres til celler, er antallet af triple-positive celler som følge af fremadrettede transfektioner signifikant lavere end dem, der ses i de omvendte behandlinger. Resultatet af forskellen i transfektionseffektivitet kan også ses i de resulterende fordelinger for de polytransfekterede populationer (figur 4B). Mens det samlede interval af forhold, der udforskes af begge, er omtrent det samme, mangler det samlede antal celler på tværs af fordelingen i tilfælde af den fremadrettede polytransfektion. Når man sammenligner disse betingelser med co-transfektionerne, kan der ses en forskel i leverede DNA-forhold: mens co-transfektion typisk resulterer i en levering på ca. 1: 1: 1, leverer polytransfektionen reporterne over et flere logfoldsområde.

Når man observerer den samlede fordeling af DNA-forhold for en omvendt polytransfektion, kan fordelen ved den øgede effektivitet værdsættes (figur 4B). Mens både fremadgående og omvendt transfektion giver en god repræsentation af forhold, der er tæt på det faktiske blandede forhold mellem DNA (1: 1: 1), har den omvendte tilstand et udvidet dynamisk område af forhold, der er godt repræsenteret.

Figur 1: Sammenligning af transfektionseffektivitet mellem fremadgående og omvendt transfektion i embryonale stamceller fra mus. Omvendte transfekterede celler blev behandlet med GFP vektortransfektionsreagenskomplekser i 5 minutter før en enkelt vask og plettering. Effektiviteten blev kvantificeret via flowcytometri 48 timer efter transfektion. 25.000 celler blev behandlet med 1 μL kationisk lipidbaseret transfektionsreagens og 500 ng DNA til alle tilstande. (A) Sammenligning af procent-positiv for celler transfekteret via omvendt eller fremadgående transfektion. GFP-positive celler blev bestemt ved gating mod ikke-transfekterede celler ud over at identificere ikke-transfekterede celler i hver behandling i den blandede population. (B) Sammenligning af den gennemsnitlige fluorescensintensitet af populationer af celler, der transfekteres positive for GFP via fremadgående eller omvendt transfektion. Fejlbjælker repræsenterer middelværdi og 1 standardafvigelse. Data svarer til 3 uafhængige replikater, hver fra et andet passagenummer. Signifikante forskelle i henhold til to-sidet t-test er angivet (*p < 0,05). Klik her for at se en større version af denne figur.

Figur 2: Titrering af inkubationstid for omvendte transfektioner af en GFP-vektor til embryonale stamceller fra mus. Celler blev blandet med 1 μL kationisk lipidbaseret transfektionsreagens og 500 ng DNA i forskellige tidsrum, før de blev vasket og belagt. Overnatningsbehandlingerne bestod af celler, der blev belagt direkte i brønde indeholdende transfektionsreagens-DNA-komplekser, med en medieerstatning til behandlingen 18 timer senere. GFP-ekspression blev kvantificeret via flowcytometri. (A) Sammenligning af den gennemsnitlige fluorescensintensitet af celler, der er transfekteret positive for en GFP-vektor. (B) Sammenligning af procentdelen af celler i hver behandling, der udtrykte GFP-reporteren efter forskellige inkubationsvarigheder med GFP-vektorkationiske lipidbaserede transfektionsreagenskomplekser. GFP-positive celler blev bestemt ved gating mod ikke-transfekterede celler ud over at identificere ikke-transfekterede celler i hver behandling i den blandede population. Fejlbjælker repræsenterer middelværdi og 1 standardafvigelse. Data svarer til 3 uafhængige replikater, hver fra et andet passagenummer. Signifikante forskelle i henhold til to-sidet t-test er angivet (*p < 0,05). Klik her for at se en større version af denne figur.

Figur 3: Sammenligning af tæthed mellem co- og poly-reverse og forward transfektioner. Celler blev transfekteret med 500 ng vektor-DNA og 1 μL kationisk lipidbaseret transfektionsreagens og derefter høstet til hæmocytometer levende celletal 48 timer senere. Celletal blev normaliseret til ikke-transfekterede kontroller. Fejlbjælker repræsenterer middelværdi og 1 standardafvigelse. Data svarer til 3 uafhængige replikater, hver fra et andet passagenummer. Signifikante forskelle i henhold til to-sidet t-test er angivet (*p < 0,05). Klik her for at se en større version af denne figur.

Figur 4: Tre reportertransfektion af embryonale stamceller fra mus, der sammenligner poly- og co-transfektionsteknikker fremad og omvendt. Celler blev behandlet i 5 minutter ved stuetemperatur med 1 μL kationisk lipidbaseret transfektionsreagens og 500 ng DNA (167 ng hver af GFP-, RFP- og BFP-ekspressionsvektorer). 48 timer senere blev celler analyseret via flowcytometri. (A) Andel af alle analyserede celler, der var positive for alle tre indberettere. Reporter-positive celler blev bestemt ved at gating mod ikke-transfekterede celler ud over at identificere ikke-transfekterede celler i hver behandling i den blandede population. Fejlbjælker repræsenterer middelværdi og 1 standardafvigelse. Data svarer til 3 uafhængige replikater, hver fra et andet passagenummer. Signifikante forskelle i henhold til to-sidet t-test er angivet (*p < 0,05). (B) Fordeling af reporterudtryk inden for den tredobbelte positive befolkning. BFP- og RFP-signaler blev normaliseret til GFP-signaler for hver given celle, der blev analyseret, og derefter plottet pr. Tilstand for at visualisere forholdet mellem DNA-vektor pr. Celle. Plotdistritubtion blev farvet som et pseudofarvet plot, afhængigt af tætheden af celler i et givet rum. Klik her for at se en større version af denne figur.

Supplerende figur 1: Kalibreringskurve. Standardkalibreringskurve anvendt til normalisering af vilkårlige fluorescerende enheder i GFP-kanalen (B525_FITC_A) til molekyler med ækvivalent fluorescein (MEFL). Standardkurver og normalisering blev genereret og udført ved hjælp af en flowcytometridataanalysator. Klik her for at downloade denne fil.

Supplerende figur 2: Eksempel på gating-strategi til bestemmelse af procent-positiv for en enkelt markør. Celleplots er først gated for celler via (FSC-A vs. SSC-A), og derefter lukkes celler for dubletter (FSC-W vs. FSC-H). Procent positive porte genereres ved at bruge en ikke-transfekteret befolkning og gating, således at 1% af denne befolkning er inden for porten. Klik her for at downloade denne fil.

Supplerende fil 1: Sekvenser af DNA / plasmider anvendt i denne undersøgelse. Klik her for at downloade denne fil.

Discussion

En vigtig årsag til den udbredte vedtagelse af transfektionsprotokoller er deres reproducerbarhed og tilgængelighed; Disse protokoller kræver dog optimering på tværs af eksperimentelle sammenhænge. Ikke nævnt ovenfor er den standardtest, der kræves, når man forsøger at transfektere en ny cellelinje for første gang. For det første er valget af transfektionsreagens nøglen, da kommercielt tilgængelige reagenser ikke er one-size-fits-all og vil variere i effektiviteten af NA-leveringslevedygtighed på tværs af celletyper. Derudover kræver testning at finde den ideelle mængde NA og transfektionsreagens samt deres optimale forhold. Ofte er det tilstrækkeligt at følge transfektionsreagensleverandørens anbefalede optimeringstrin for at nå frem til den ideelle mængde af både NA og transfektionsreagens.

Når en given transfektion har svigtet, bør den første overvejelse være egnetheden af de anvendte reagenser: overvej, om NA er valideret og sekventeret, om cellerne er i en optimalt levedygtig tilstand før transfektionen, om transfektionsreagenset er blevet lottestet eller sammenlignet med andre mere cellespecifikke reagenser. Ofte er en kritisk kontrol inkluderingen af en vektor, der udtrykker GFP under kontrol af en testet og valideret promotor, da promotorer ofte vides at være cellespecifikke med forskellige styrker i forskellige cellelinjer¹⁴. Uden for brugertekniske fejl, når en given transfektionsprotokol og NA er blevet optimeret, kan store afvigelser i eksperimentelle resultater ofte spores til problemer med et givet reagens.

Mens brugen af polytransfektion muliggør flere typer enkeltpotteeksperimenter, der ikke er mulige med traditionelle co-transfektioner, er det ikke altid det klare bedste valg. I tilfælde, hvor forholdet mellem flere NA skal titreres, eller hvor tilstedeværelsen af en NA vil påvirke de andre på en dosisafhængig måde, gør polytransfektion det muligt at gennemføre hurtige design-build-test-cyklusser med NA'er ^8,9. På den anden side er polytransfektioner ikke velegnede til applikationer, hvor enkeltcelleanalyse, såsom flowcytometri, ikke udføres. I disse tilfælde kan en co-transfektionsmetode for at producere en homogen population være mere ønskelig. For celler, der er svære at transfektere uanset optimering, giver polytransfektioner muligvis ikke et passende antal celler på tværs af hele distributionen til downstream-analyse uden at opskalere eksperimentet kraftigt.

Endelig tolererer nogle cellelinjer ikke transfektion, uanset reagens eller optimering. Desværre offentliggøres rapporter om sådanne linjer typisk ikke, hvilket begrænser oplysninger om transfektabiliteten af en enkelt linje. I sådanne tilfælde kan andre NA-leveringsmetoder være påkrævet, såsom elektroporation eller virusmedieret levering. Når det er muligt, åbner udvidede transfektionsprotokoller såsom omvendte polytransfektionsteknikker som beskrevet ovenfor imidlertid et nyt regime for forskere, der bygger på tidstestede reagenser og protokoller.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Accutase	MilliporeSigma	SCR005
Apotransferrin	MilliporeSigma	T1147-500MG
B27 supplement	ThermoFisher Scientific	17504044
Beta-mercaptoethanol	ThermoFisher Scientific	21985023
BSA fraction V (7.5%)	Gibco	15260-037
CHIR99021	MilliporeSigma	SML1046-25MG
DMEM-F12	MilliporeSigma	D6421-24X500ML
Flow cytometry standardization beads	Spherotech	URCP-38-2K
Gelatin	MilliporeSigma	G1890
GlutaMAX supplement	ThermoFisher Scientific	35050061
Insulin	Gibco	12585-0014
Lipofectamine 2000	Invitrogen	11668-019	Transfection reagent
Neurobasal media	ThermoFisher Scientific	21103049
OptiMEM	Invitrogen	31985-070
PD0325901	MilliporeSigma	PZ0162-25MG
Progesterone	MilliporeSigma	P8783	Chemical hazard - consult local safety guidelines, ensure proper PPE is worn, and work with the solid powder form only in a chemical fume hood
Putrescine	MilliporeSigma	P6780	Chemical hazard - consult local safety guidelines, ensure proper PPE is worn, and work with the solid powder form only in a chemical fume hood
Recombinant mLIF	BioTechne	8878-LF-500/CF
Sodium selenite	MilliporeSigma	S5261-25G	Chemical hazard - consult local safety guidelines, ensure proper PPE is worn, and work with the solid powder form only in a chemical fume hood
Trypsin-EDTA	ThermoFisher Scientific	25200056