Waiting
Traitement de la connexion…

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

Modellering av multipel skleros hos de två könen: MOG35-55-inducerad experimentell autoimmun encefalomyelit

Published: October 13, 2023 doi: 10.3791/65778
Automatic Translation
1,2, 1,2,3, 1,2, 1,4
1Neuroscience Institute Cavalieri Ottolenghi (NICO), 2Department of Neuroscience “Rita Levi-Montalcini”, University of Turin, 3School of Pharmacy, Pharmacology Unit, University of Camerino, 4Koelliker Hospital

ERRATUM NOTICE

Summary

Experimentell autoimmun encefalomyelit är en av de mest använda murina modellerna av multipel skleros. I det nuvarande protokollet immuniseras C57BL/6J-möss av båda könen med myelinoligodendrocytglykoproteinpeptid, vilket huvudsakligen resulterar i stigande pares av svans och lemmar. Här diskuterar vi protokollet för EAE-induktion och utvärdering.

Abstract

Multipel skleros (MS) är en kronisk autoimmun inflammatorisk sjukdom som påverkar det centrala nervsystemet (CNS). Den kännetecknas av olika prevalens hos könen, som drabbar fler kvinnor än män, och olika resultat, som visar mer aggressiva former hos män än hos kvinnor. Dessutom är MS mycket heterogent när det gäller kliniska aspekter, radiologiska och patologiska egenskaper. Därför är det nödvändigt att dra nytta av experimentella djurmodeller som gör det möjligt att undersöka så många aspekter av patologin som möjligt. Experimentell autoimmun encefalomyelit (EAE) är en av de mest använda modellerna av MS hos möss och modellerar olika sjukdomsegenskaper, från aktivering av immunsystemet till CNS-skador. Här beskriver vi ett protokoll för induktion av EAE hos både han- och honmöss av typen C57BL/6J med myelinoligodendrocytglykoprotein peptid 35-55 (MOG35-55) immunisering, vilket leder till utveckling av en kronisk form av sjukdomen. Vi rapporterar också utvärderingen av den dagliga kliniska poängen och motoriska prestandan hos dessa möss under 28 dagar efter immunisering (28 dpi). Slutligen illustrerar vi några grundläggande histologiska analyser på CNS-nivå, med fokus på ryggmärgen som den primära platsen för sjukdomsinducerad skada.

Introduction

Multipel skleros (MS) är en kronisk autoimmun inflammatorisk sjukdom som påverkar det centrala nervsystemet (CNS). Den visar närvaron av perivaskulär infiltration av inflammatoriska celler, demyelinisering, axonal förlust och glios1. Dess etiologi är fortfarande okänd, och dess kliniska aspekter, röntgenologiska och patologiska egenskaper tyder på anmärkningsvärd heterogenitet i sjukdomen2.

På grund av dess okända etiologi och komplexitet finns det för närvarande ingen djurmodell som rekapitulerar alla de kliniska och radiologiska egenskaper som uppvisas i MS 3,4 hos människa. Olika djurmodeller används dock för att studera olika aspekter av MS 3,4. I dessa modeller är sjukdomsinitieringen vanligtvis extremt artificiell, och tidsramen för uppkomsten av kliniska tecken skiljer sig åt mellan människor och möss. Till exempel hos människor är de patofysiologiska processer som ligger till grund för sjukdomen oupptäckta i åratal innan de kliniska manifestationerna börjar. Omvänt kan försöksledarna upptäcka symtom i djurmodeller inom veckor eller till och med dagar efter MS-induktion4.

Tre grundläggande djurmodeller ger de egenskaper hos demyelinisering som är karakteristiska för MS: de som är virusinducerade (t.ex. Theilers murina encefalomyelitvirus), de som induceras av toxiska ämnen (t.ex. cuprizon, lysolecitin) och de olika varianterna av experimentell autoimmun encefalomyelit (EAE)5. Varje modell hjälper till att studera vissa specifika aspekter av sjukdomen, men ingen replikerar alla egenskaper hos MS6. Därför är det viktigt att välja rätt modell med tanke på de specifika experimentella behoven och de vetenskapliga frågor som ska behandlas.

Tack vare immuniseringsprocedurer mot myelin-härledda antigener induceras EAE genom att utlösa ett autoimmunt svar på CNS-komponenter hos mottagliga möss. Samspelet mellan ett brett spektrum av immunpatologiska och neuropatologiska mekanismer orsakar utvecklingen av de huvudsakliga patologiska dragen hos MS (dvs. inflammation, demyelinisering, axonal förlust och glios) hos de immuniserade mössen 7,8. Möss börjar visa kliniska symtom runt den andra veckan efter immunisering och visar i allmänhet stigande förlamning från svansen till extremiteten och frambenen. Den kliniska poängen (dvs. kvantifiering av ackumuleringen av sjukdomsrelaterade brister) bedöms i allmänhet med hjälp av en 5-gradig skala7.

Aktiv immunisering med protein eller peptid eller passiv överföring av encefalitogena T-celler kan användas för att inducera EAE hos möss med olika genetisk bakgrund (t.ex. SJL/J, C57BL/6 och icke-överviktiga diabetiska (NOD) möss). Myelinproteolipidprotein (PLP), myelinbasprotein (MBP) och myelinoligodendrocytglykoprotein (MOG) är exempel på själv-CNS-proteiner från vilka immunogener vanligtvis produceras. Särskilt SJL/J-möss som immuniserats med den immundominanta epitopen PLP (PLP139−151) utvecklar ett skovvis förlöpande sjukdomsförlopp (RR), medan C57BL/6J-möss immuniserade med den immundominanta MOG35-55-peptiden uppvisar EAE av kronisk natur1. Trots vissa begränsningar, såsom att ge mycket lite information om MS-progression, B-cellernas roll i sjukdomen, inifrån och ut-mekanismerna eller svårigheter att studera remyelinisering, har EAE-modellerna i hög grad bidragit till förståelsen av autoimmuna och neuroinflammatoriska processer, ökat kunskapen inom MS-området och därmed möjliggjort utveckling av nya terapeutiska metoder för denna sjukdom4, 6. veckor

I detta arbete fokuserade vi på en särskild form av aktiv EAE, myelinoligodendrocytglykoproteinpeptid 35-55 (MOG35-55)-inducerad form 9,10,11,12. MOG35-55-inducerad EAE modellerar en kronisk form av MS. Efter immunisering genomgår mössen en asymtomatisk fas inom den första veckan efter immunisering, sedan uppstår sjukdomen vanligtvis under den andra veckan efter immunisering, medan mellan den tredje och fjärde veckan efter immunisering blir sjukdomen kronisk, utan möjlighet till full återhämtning från de ackumulerade underskotten 7,8,13. Intressant nog observeras inga skillnader mellan män och kvinnor i incidens, sjukdomsdebut, förlopp eller progression i de flesta av de studier som finns i litteraturen14, även om färre studier jämför sjukdomen hos män och kvinnor.

Hos människor är dessa parametrar däremot kända för att vara starkt könsdimorfa2. MS drabbar fler kvinnor än män. Män utvecklar dock i allmänhet en mer aggressiv form av sjukdomen2. Dessa bevis har antytt en viktig, såväl som komplex, roll för gonadhormonerna15; Ändå är könshormonernas roll och verkningsmekanism i patologin fortfarande oklar. Dessutom stöder data från djurmodeller idén att både östrogener och androgener utövar positiva effekter på olika delar av patologin på ett könsspecifikt sätt16,17.

Vissa studier tyder också på neuroprotektiva, promyeliniserande och antiinflammatoriska effekter av progesteron18 och, även om bevisen hos MS-patienter är knapphändiga18, kan neuroaktiva steroider (dvs. de novo-syntetiserade steroider av nervsystemet, såsom pregnenolon, tetrahydroprogesteron och dihydroprogesteron) också påverka det patologiska förloppet19. Sammantaget stöder dessa data idén att könshormoner som produceras både perifert och inuti CNS har en viktig och könsspecifik roll i sjukdomsdebut och progression. Därför uppmanar vi i detta arbete till insamling av separata data från både han- och hondjur.

Ur histopatologisk synvinkel fungerar ryggmärgens vita substans som den huvudsakliga platsen för CNS-skada i denna modell, som kännetecknas av multifokala, sammanflytande regioner av mononukleär inflammatorisk infiltration och demyelinisering8. Således, när vi beskriver detta protokoll för induktion av MOG35-55-inducerad EAE i C57BL/6J-möss, kommer vi att ta hänsyn till sjukdomsutfallet hos de två könen och ge några histopatologiska insikter om ryggmärgen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Djurskötseln och hanteringen i detta arbete utfördes i enlighet med Europeiska unionens råds direktiv av den 22september 2010 (2010/63/UE); Alla förfaranden som rapporterats i denna studie har godkänts av det italienska hälsoministeriet (407/2018-PR) och av den etiska kommittén vid universitetet i Turin (projekt nr 360384). Vi föreslår att man anpassar sig till den experimentella designen till ARRIVE-riktlinjerna som ursprungligen publicerades av Kilkenny et al. 201020. Innan du börjar, se till att nödvändigt material finns tillgängligt (se materialförteckning). Sterilisera alla glas och redskap som används för beredning av MOG35-55-emulsionen i en autoklav. En sammanfattning av de experimentella procedurerna visas i figur 1.

1. Beredning av MOG35-55-emulsion

OBS: För att bereda emulsionen krävs MOG35-55, ofullständig Freuds adjuvans (IFA), Mycobacterium Tuberculosis stam H37Ra (MT) och fysiologisk lösning (se materialförteckning).

VARNING: Värmedödad MT kan stimulera det medfödda immunsvaret. Undvik inandning, förtäring och kontakt med hud och ögon genom att använda lämplig personlig skyddsutrustning och väga MT i en täckt precisionsvåg under huven.

Lösning Sammansättning Anteckningar
2 mg/ml MOG35-55 peptidlösning Frystorkad MOG35-55-peptid utspädd i fysiologisk lösning vid 2 mg/ml koncentration Förvara den redan utspädda lösningen vid -80 °C.
5 μg/ml PT-lösning Frystorkad PT utspädd i fysiologisk lösning vid 5 μg/ml koncentration. Förvara den redan utspädda lösningen vid -80 °C.
Emulsion Den totala volymen emulsion som behövs för varje mus som ska immuniseras är 300 μl fördelat enligt följande: För att undvika förändringar eller kontaminering, förbered emulsionen dagen för immuniseringen.
200 μg/mus MOG35-55 , dvs 100 μL MOG35-55 2 mg/ml lösning.
50 μL fysiologisk lösning
150 μL IFA
4 mg/ml MT, dvs 1,2 mg/mus
Fysiologisk lösning Natriumklorid 0,9 % utspädd i destillerat vatten.

Tabell 1: Sammansättning av de lösningar som används för immuniseringsproceduren.

  1. Bered lösningen i en glasbägare, tillsätt först den flytande komponenten och slutligen MT.
    OBS: Den totala volymen emulsion som behövs för varje mus som ska immuniseras är 300 μL, uppdelat enligt tabell 1. Emulsionen är mycket trögflytande och tjock, så under berednings- och injektionsproceduren kan det uppstå en viss förlust, särskilt när lösningen bereds för några möss. Vi föreslår att man beräknar den slutliga volymen emulsion som behövs genom att överskatta antalet möss som ska immuniseras med minst 1,5-2 gånger.
  2. Placera bägaren i is och använd glassprutan med en 18 G nål för att börja emulgera lösningen.
    OBS: Emulsionen kan också beredas med andra strategier, t.ex. genom att ansluta de två luftfria glassprutorna med en trevägskran och blanda lösningen genom att trycka kolvarna fram och tillbaka21,22.
  3. Emulgera lösningen i minst 15 minuter; I allmänhet räcker det med 30 minuters emulgering. För att kontrollera kvaliteten på emulsionen, tillsätt en droppe emulsion i en genomskinlig behållare fylld med vatten: om droppen behåller sin struktur och förblir intakt är emulsionen klar.
  4. Placera emulsionen direkt i de 1 ml sprutor som ska användas för immuniseringen och förvara dessa vid +4 °C tills de används för att bevara emulsionens tjocklek och undvika förändringar eller kontaminering.

2. Djururval och immunisering

  1. Urval av djur
    1. Välj vuxna C57BL/6J-möss av båda könen vid 8-10 veckors ålder med en optimal kroppsvikt på ~20 g. Var noga med att välja ålders- och könsmatchade möss för olika experimentgrupper eftersom mottagligheten för sjukdom kan variera med ålder och kön.
      OBS: Möss bör ha en jämförbar kroppsvikt på dagen för immunisering eftersom den nuvarande proceduren är optimerad för ett visst kroppsviktsintervall (17-25 g).
    2. Förvara djur av samma kön i grupper (n = 4–5 per bur) för att undvika social isolering under standardförhållanden i 45 cm x 25 cm x 15 cm polypropenmusburar vid 22 ± 2 °C, under ljus/mörker kl. 12.12 (lamporna tänds kl. 08.00). Ge mat och vatten ad libitum.
      OBS: Så småningom, för att ytterligare begränsa den potentiella variationen i sjukdomsförloppet hos de immuniserade djuren, föreslår vi också att man bildar tillräckligt många experimentella grupper. Det finns också studier 8,23 som beskriver tidpunkten för immunisering som ett tillstånd som bestämmer variationen i EAE-utfallet. Därför föreslår vi att du utför immuniseringen ungefär vid samma tidpunkt hos alla djur, helst under de ljusa timmarna i den dagliga ljus/mörkercykeln23. För att begränsa stressen är det att föredra att manipulera djuren före vaccinationsdagen och att märka dem för att lätt kunna identifiera dem för daglig utvärdering, till exempel öronklippning eller märkning.
  2. Förfarandet för immunisering
    OBS: Se till att proceduren utförs av en erfaren utredare för att minimera stress för djuren och optimera immuniseringen. Innan vaccinationen påbörjas ska du välja anestesimetod i enlighet med institutionens anvisningar för djurvård och djurförsöksetiska kommittéer. Vårt laboratorium använder kortbedövning med isofluran.
    1. Bedöva musen: 4 % isofluran för anestesiinduktion och 1,5-2 % isofluran för anestesiunderhåll. Vänta tills bedövningen är effektiv och använd en bakre och främre tånypa för att bedöma nivån på anestesi. För att förhindra torrhet i ögonen medan musen är nedsövd, använd en veterinärgodkänd ögonsalva.
    2. PT intravenös injektion i den laterala svansvenen: plugga försiktigt musens svans med en etanollösning, som fungerar som en vasodilaterare, för att visa venerna. Fokusera på en av de två laterala venerna i svansen och injicera 500 ng PT (dvs. 100 μL PT utspädd i fysiologisk lösning med en koncentration av 5 μg/ml) med hjälp av en 0,5 ml spruta utrustad med en 30 G nål (dvs. 100 μL PT utspädd i fysiologisk lösning med en koncentration av 5 μg/ml).
    3. Subkutan injektion av MOG35-55-emulsion : Använd 1 ml sprutan med en 26 G nål och utför tre subkutana injektioner av den tidigare beredda emulsionen: två under den rostrala delen av flankerna och en vid svansroten. Den volym emulsion som injiceras på varje ställe är 100 μl, vilket ger en total volym på 300 μl emulsion som injiceras i varje mus.
      OBS: Dagen för immunisering registreras som dag 0 efter immunisering (dpi); 48 timmar senare (d.v.s. vid 2 dpi) är det nödvändigt att utföra ytterligare en intravenös injektion av PT som är lika med den som tidigare utförts. Det är möjligt att utföra injektionen utan bedövning med hjälp av en musspärr. Proceduren som beskrivs här syftar till att inducera och upprätthålla bedövning av mössen under immuniseringsproceduren för att undvika eventuellt obehag och rörelser hos djuren eller risker för både möss och utredare. Det finns alltså inga kirurgiska ingrepp. För att optimera de experimentella processerna är det dock viktigt att upprätthålla lämpliga sterila förhållanden under dessa steg och att övervaka musens tillstånd efter dessa procedurer.
    4. För att kontrollera att musen har återhämtat sig från injektionerna, placera den i en ren bur efter procedurerna och vänta tills den har återfått tillräckligt medvetande för att bibehålla sternal liggande. När musen har återhämtat sig helt och hållet sätter du tillbaka den i hemburen tillsammans med andra djur.

3. Uppföljning av EAE

  1. Kroppsvikt och födointag
    1. Övervaka dagligen djurens kroppsvikt med hjälp av en elektronisk precisionsvåg, eftersom minskningen av kroppsvikten är en indikator på sjukdomsprogression.
      OBS: Denna minskning bör inte överstiga en viss procentsats, enligt institutionens och djurförsöksetiska nämndens riktlinjer för djurvård. Om ett djur förlorar mer än 20 % av den ursprungliga kroppsvikten (dvs. den vikt som registrerats vid 0 dpi) bör det vanligtvis avlivas som tillämpning av den humana endpointen. Eutanasimetoderna innebär djup irreversibel anestesi för inandning (t.ex. 5 % isofluran) följt av halshuggning.
    2. Övervaka födointaget (FI) - den mat som ett djur äter under en dag (g∙dag-1∙djur-1), väg mängden mat i den specifika behållaren minst en gång i veckan och dividera mängden äten mat för de dagar som gått mellan två sekventiella mätningar och antalet djur som finns i buren.
      OBS: Denna mätning gör det möjligt att uppskatta det genomsnittliga födointaget. På grund av uppkomsten och ackumuleringen av kliniska sjukdomstecken, som involverar förlamning av lemmarna, föreslår vi att du placerar lite vattnad mat på golvet i buren när djuren inte kan stå stadigt på bakbenen och nå matbehållaren eller vattenflaskan. För att bedöma födointaget under uppföljningsperioden så exakt som möjligt mätte vi också torrvikten på detta foder innan vi blötte det för mössen.
  2. Utvärdering av brunstcykler under EAE
    1. Kontrollera brunstcykeln i minst två cykler och utvärdera de vaginala cytologiska utstryken som beskrivs av McLean et al.24. Klassificera fasen i brunstcykeln baserat på närvaron av tre primära celltyper - kärnepitelceller, förhornade skivepitelceller och leukocyter - i vaginalutstryksprover, enligt följande:
      1. Klassificera som proestrus baserat på en nästan uteslutande närvaro av kluster av runda, välformade kärnförsedda epitelceller.
      2. Klassificera som brunst baserat på den dominerande närvaron av tätt packade kluster av förhornade skivepitelceller.
      3. Klassificera som metestrus baserat på den dominerande närvaron av små mörkt färgade leukocyter och den mindre närvaron av förhornade skivepitelceller.
      4. Klassificera som diestrus baserat på den mycket dominerande närvaron av små mörkt färgade leukocyter och sällsynta cornified skivepitelceller tillsammans med det möjliga utseendet på kärnförsedda epitelceller.
        OBS: Vid utvärdering av sjukdomen hos båda könen är det viktigt att kontrollera variabiliteten hos honor på grund av brunstcykeln. Vi föreslår att du fokuserar på utvärderingen av brunstcykeln, särskilt mellan den första och den andra veckan efter immunisering (dvs. under den akuta fasen av EAE). Det har tidigare visats att immuniseringsproceduren orsakar de mest uttalade förändringarna av brunstcykeln inom denna fas25. Dessutom är det viktigt att tänka på att det är svårt att utföra utstryket när djuret når en hög klinisk poäng (särskilt >3) på grund av den bakre paresen och bristen på ton i bakbenen.
  3. Klinisk poäng
    1. Låt en blindad utredare bedöma djurens kliniska poäng dagligen. Tilldela varje djur en poäng från 0 till 5 (se tabell 2) för att utvärdera sjukdomsförloppet26 enligt beskrivningen i Racke7.
      OBS: I likhet med viktminskningen är ett humant effektmått också nödvändigt för att öka de kliniska poängen, enligt den institutionella och etiska kommitténs riktlinjer för djurvård. I allmänhet, om ett djur inte längre kan livnära sig självt autonomt (detta inträffar vanligtvis när ett djur når minst poängen 4, enligt den skala vi använder), bör det offras som tillämpning av den humana slutpunkten.
  4. Utvärdering av motorprestanda genom rotarodtest
    OBS: Utvärdering av EAE-progressionen utförs vanligtvis genom att tilldela den kliniska poängen dagligen, vilket görs av en fullt utbildad blindad prövare. Det kan dock vara lämpligt att komplettera den med en mer kvantitativ och objektiv utvärdering av sjukdomens progression. I en tidigare studie26 användes rotarodtestet för att mäta den motoriska prestandan hos de immuniserade djuren. Som beskrivits av van den Berg et al.27, för att få en mer kvantitativ och exakt klinisk utvärdering av sjukdomsförloppet, kan utvärderingen av den motoriska prestandan med rotarodtestet stödja den kliniska poängbedömningen. För en detaljerad beskrivning, se van den Berg et al.27.
    1. Låt mössen genomgå rotarodsessioner dagligen, från 1 dpi till offret (dvs. 28 dpi). Varje session består av en enda 300 s-session under vilken stånghastigheten måste ökas linjärt från 4 till 40 rpm.
    2. Registrera djurets poäng. När musen inte kan hålla balansen och faller av enheten, faller den på marken och utlöser en sensor, och tiden/tiderna registreras. Därför poängsätts prestandan som svarstid för att falla (s).

Gradera Kliniskt tecken Beskrivning
0 Frisk Inga observerade kliniska tecken. Djuret visar en normal ton och rörelse av svansen. Den går utan att snubbla.
0.5 Nedsatt grind Djuret snubblar när det går på en grill.
1 Slapp svans När djuret plockas upp vid svansens bas hänger svansen (slapp svans).
1.5 Slapp svans och nedsatt grind Djuret har en slapp svans och snubblar när det går på en grill.
2 Ataxi Djuret har svårt att stå upp när det väl har vänts på rygg.
2.5 Ataxi och pares i bakbenen Djuret kan inte stå upp när det har vänts på rygg och det förlorar tonen i ett av sina bakben.
3 Förlamning av bakbenen Djuret förlorar tonen i båda bakbenen.
3.5 Förlamning av bakbenen och/eller förlamning av frambenen Djuret förlorar tonen i båda bakbenen och delvis i frambenen. Faktum är att det visar en förlust av styrka i frambenens grepp.
4 Tetra pares Djuret förlorar helt tonen i sina lemmar.
4.5 Tetra pares och sänkt kroppstemperatur Djuret förlorar helt tonen i sina lemmar och det visar en minskning av kroppstemperaturen (det är kallt).
5 Döende eller död Djuret är döende (det svarar inte på någon stimulans) eller dött.

Tabell 2: Kliniskt poängsystem som används för att bedöma EAE-progression.

4. Utvärdering av EAE-inducerade histopatologiska tecken på ryggmärgsnivå

OBS: Här redogör vi kortfattat för proceduren för att avliva djuren och samla in ryggmärgen för att utföra histopatologisk analys; För en detaljerad beskrivning, se dessa referenser 10,26,28,29.

  1. Fixering och vävnadsprovtagning
    OBS: För en detaljerad beskrivning, se dessa referenser10,26.
    1. Avliva djuren med 28 dpi under den kroniska fasen av sjukdomen.
      1. Bedöva mössen genom djup irreversibel anestesi (intraperitoneal injektion av Zolazepam och Tiletamin 80 mg/kg / Xylazin 10 mg/kg).
      2. Transkardiellt perfusion av mössen med en saltlösning följt av en 4% paraformaldehydlösning (PFA).
        OBS: Var uppmärksam när du använder PFA: eftersom det är giftigt, undvik inandning, förtäring och kontakt med hud och ögon med lämplig personlig skyddsutrustning. Väg pulvret, förbered lösningen och utför perfusionen under huven.
    2. Ta bort ryggmärgen från ryggraden30.
    3. Förvara ryggmärgen i en 4% PFA-lösning i 24 timmar.
    4. Utför flera tvättar i 0.01 M saltfosfatbuffert (PBS).
    5. Bädda in ryggmärgen i paraffinblock30.
  2. Histologiska metoder
    OBS: För en detaljerad beskrivning, se Montarolo et al.10.
    1. Använd en mikrotom för att skära 10 μm tjocka tvärgående ryggmärgssnitt och samla upp dem på gelatindragerade objektglas. Orientera snittplanet så att det stämmer överens med ritningarna som motsvarar de tvärgående sektionerna i musens ryggmärgsatlas31.
    2. Utför avparaffiniseringen av avsnitten32.
    3. Färga sektionen med Hematoxylin och Eosin32.
    4. Torka ut sektionerna32.
    5. Täck sektionerna med ett monteringsmedium och låt dem torka i rumstemperatur under en kemisk huv.
      OBS: Hematoxylin-Eosin-färgning gör det möjligt att detektera förekomsten av de perivaskulära inflammatoriska infiltraten (PvII)26, vilket bedöms som ett tecken på sjukdomen28.
  3. Kvantitativ analys av ryggmärgssnitt
    1. Ta bilder av de färgade sektionerna med ett optiskt mikroskop anslutet till en digitalkamera med ett 20x objektiv29.
    2. Analysera den insamlade bilden för att få fram antalet PvII, uttryckt som antalet infiltrat per mm2.
      OBS: För analys av de insamlade bilderna är det användbart att dra nytta av bildanalysprogram. Neuropatologiska fynd som presenteras i detta arbete kvantifieras i 10 fullständiga tvärsnitt av ryggmärgen per mus (n = 8/grupp) som representerar hela ryggmärgsnivåer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

EAE-uppföljning efter immunisering
Detta bedömdes enligt beskrivningen nedan.

Kroppsvikt och födointag
Tvåvägsanalysen av varians (ANOVA) (kön och tid som oberoende variabler) visar en minskning av BW hos EAE-djur av båda könen, särskilt under den andra veckan efter induktion (F(1,57) = 4,952, p < 0,001; Figur 2A). Den sexuella dimorfismen i BW bibehålls dock alltid (Figur 2A). När det gäller andelen BW (F(1,57) = 23,935, p < 0,001; Figur 2B) uppvisar både män och kvinnor en enorm förlust mellan 12 dpi och 17 dpi (p < 0,001) jämfört med den ursprungliga BW, men överstiger aldrig en total förlust på 20 % (figur 2B). Således, även om BW-förlusten börjar innan sjukdomen bryter ut, når den sitt maximum under den akuta fasen av EAE (Figur 2A,B). Det finns inga skillnader mellan könen när det gäller BW-förlust. Kvinnor tenderar dock att gå ner mer i vikt tidigare och återhämta sig mindre under den kroniska fasen (tredje-fjärde veckan efter induktion) (Figur 2B).

Dessutom visar tvåvägs ANOVA (kön och tid som oberoende variabler) också en signifikant minskning av FI (F(9, 39) = 6,682, p < 0,001; Figur 2C) hos båda könen, särskilt under den andra veckan efter immuniseringen, till följd av ökad svårighetsgrad av EAE, vilket gjorde det svårare för djuret att komma åt fodret som placerades i den övre behållaren i buren. Som vi föreslog placerades maten därefter på burgolvet för att minska ytterligare stress för djuren. Detta gjorde det möjligt för FI att återgå till de ursprungliga nivåerna (figur 2C) och BW att delvis återhämta sig (figur 2A,B).

Utvärdering av eströs cykel hos honorna
Jämförelsen mellan tiden som spenderades i de olika faserna av brunsten utfördes med hjälp av Students t-test. Analysen visar skillnader i den tid som tillbringas i de estrala faserna (dvs. proestrus och estrus) jämfört med den som spenderas i den icke-estrala fasen (dvs. metestrus och diestrus) mellan den asymtomatiska fasen (före uppkomsten av EAE) och den symtomatiska fasen (efter uppkomsten av EAE) (p = 0,042; Figur 2D), främst på grund av en ökning av tiden i diestrus under de symtomatiska faserna (p = 0,017) och en tendens att minska tiden i proestrus (p = 0,08).

Det har redan beskrivits att induktionsproceduren leder till en förändring av brunstcykeln hos kvinnor, vilket särskilt påverkar proestrus25. Under denna fas är ökande nivåer av östrogener kända för att utöva antiinflammatoriska och neuroprotektiva effekter16 och är därför möjligen ansvariga för den skyddande rollen av dessa hormoner under den presymtomatiska fasen. Men när nivån av östrogener sjunker, som vi ser i fasen efter debuten, upphör också deras skyddande effekter.

Klinisk poäng och rotarodprestanda
Tvåvägs ANOVA (kön och tid som oberoende variabler) visar en signifikant ökning av tiden i den kliniska poängen (CS) för både män och kvinnor (F(56-813) = 27,951, p < 0,001; Figur 3A). I synnerhet, från och med 10 dpi, visar båda könen en signifikant ökning av CS (p < 0,001), som bibehålls fram till slutpunkten (28 dpi) (figur 3A). Honor uppvisar, även om de inte är signifikanta (p = 0,156), högre CS än hanar (figur 3A). När det gäller sjukdomsdebut förekommer den i allmänhet runt 10 dpi, med en tendens till tidigare debut hos kvinnor än hos män (Figur 3B). Dessutom uppvisar honor ett signifikant högre kumulativt CS jämfört med hanar (p = 0,017; Figur 3C).

Prestandakursen liknar de kliniska utvärderingarna (Figur 2D). Från och med sjukdomens början minskar den och når den lägsta prestandan under den andra veckan efter immunisering, i den akuta fasen av EAE. Tvåvägs ANOVA (kön och tid som oberoende variabler) visar en signifikant minskning av tiden i rotarodprestanda hos både män och kvinnor (F(46-673) = 5,365, p < 0,001; Figur 3D). Särskilt hanar uppvisar den lägsta prestandan vid 16 dpi (p = 0,022) medan honorna vid 17 dpi (p < 0,001). Män tenderar att prestera bättre än kvinnor, särskilt under den kroniska fasen av sjukdomen (21-28 dpi), möjligen som en följd av lägre CS (Figur 3A,D).

Histopatologisk utvärdering av ryggmärgen
Enkelriktad ANOVA (kön som oberoende variabel) av PvIIs i ryggmärgssnitten belyser en tydlig skillnad mellan män och kvinnor (Figur 4A). Kvinnor uppvisar ett signifikant högre antal PvII än män (F(1,14)= 63,107, p < 0,001; Figur 4B). Dessa data återspeglar möjligen det högre kumulativa kejsarsnittet, den sämre rotarodprestandan och den mer aggressiva sjukdomen som observerats hos honorna, särskilt under den kroniska fasen av EAE.

Dessa data återspeglar också det faktum att honmöss uppvisar högre känslighet för utveckling av mer aggressiv EAE jämfört med hanmöss14, vilket är en av de största skillnaderna mellan denna sjukdomsmodell och den MS som förekommer hos människor. Kvinnor uppvisar en tidigare sjukdomsdebut, har en måttligt lägre prevalens av primära progressiva former och uppvisar totalt sett mindre funktionsnedsättning än män 2,33,34.

Figure 1
Figur 1: Schematisk tidsmässig representation av experimentella procedurer. Skapad med BioRender.com. Förkortningar: i.v. = intravenös; s.c. = subkutant; MOG35-55 = myelinoligodendrocytglykoprotein peptid 35-55; = dpi = dag efter immunisering. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figure 2
Figur 2: Utvärdering av EAE-effekterna på kroppsvikt, födointag hos han- och honmöss och brunstcykel hos honmöss. Från immuniseringsdagen (0 dpi) till slaktdagen (28 dpi) visar graferna (A) daglig kroppsvikt, (B) procentuell andel av kroppsvikten och (C) utvärdering av det veckovisa födointaget hos djur av båda könen (n = 15/grupp). (D) Tid som tillbringats (uttryckt som genomsnittlig procentandel av tiden) i de olika faserna av brunstcykeln, utvärderad med vaginala cytologiska utstryk, under den asymtomatiska fasen (före debut, vänstra kolumnen i diagrammet) eller den symtomatiska fasen (efter debut, högra kolumnen i diagrammet) hos honmöss. Data presenteras som medelvärde ± SEM. Statistisk analys visade en signifikant effekt för p≤ 0,05 (# = män vs. kvinnor; * = jämförelse mellan olika tidpunkter). Förkortningar: EAE = experimentell autoimmun encefalomyelit; BW = kroppsvikt; FI = födointag; DPI = dag efter immunisering. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figure 3
Figur 3: Utvärdering av klinisk poäng och rotarodprestanda hos EAE-drabbade han- och honmöss. A) Bedömning av daglig klinisk poäng (från 0 till 28 dpi) hos djur av båda könen (n = 15/grupp). (B) Sjukdomsdag (medel-dpi) hos EAE-drabbade hanmöss (vänster kolumn) och honmöss (höger kolumn). (C) Genomsnittlig kumulativ klinisk poäng uppnådd av EAE-drabbade hanmöss (vänster kolumn) och honmöss (höger kolumn). D) Bedömning av den dagliga prestandan hos rotarod (mätt som fallfördröjning) från 6 till 28 dpi (värdet 0 motsvarar de utgångsvärden som erhölls under de första 5 dagarna av testet) hos djur av båda könen. Data presenteras som medelvärde ± SEM. Statistisk analys visade en signifikant effekt för p≤ 0,05 (# = män vs. kvinnor; * = jämförelse mellan olika tidpunkter). Förkortningar: EAE = experimentell autoimmun encefalomyelit; CS = klinisk poäng; Cum CS = kumulativ klinisk poäng; DPI = dag efter immunisering. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figure 4
Figur 4: Analys av inflammation i ryggmärgen hos EAE-drabbade möss av båda könen. (A) Representativa bilder av tvärgående ryggmärgssnitt färgade med Hematoxylin-Eosin belyser förekomsten av PvII (pilar) hos hanmöss (övre bilden) och honmöss (nedre bilden). (B) Mått på PvII:s närvaro i ryggmärgen hos EAE-drabbade möss av båda könen (n = 8/grupp). Data presenteras som medelvärde ± SEM. Statistisk analys visade en signifikant effekt för p ≤ 0,05 (# = män vs. kvinnor). Skalstreck = 200 μm (10x förstoring). Förkortningar: EAE = experimentell autoimmun encefalomyelit; * = Centrala kanalen; PvII = perivaskulära inflammatoriska infiltrat. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Det MOG35-55-inducerade EAE-protokollet som vi beskrev ledde till utvecklingen av en kronisk form av MS i C57BL/6J-möss 7,8,13. I dessa representativa resultat rapporterade vi att djuren av båda könen som genomgick immuniseringsproceduren utvecklade en kronisk form av sjukdomen (dvs. de återhämtar sig inte helt efter sjukdomsdebuten, de ackumulerar underskott och bibehåller ett CS på minst 1,5 i den kroniska fasen).

Även om många studier inte rapporterar några skillnader mellan män och kvinnor i denna modell14, är det bara ett fåtal studier som tar hänsyn till båda könen. Med tanke på de betydande könsdimorfismer som uppvisas vid MS2 bör det dock vara av primär relevans att studera sjukdomsutfallet hos de två könen. Tack vare nyare studier som inkluderar båda könen har förekomsten av viss sexuell dimorfism också beskrivits i den MOG35-55-inducerade EAE35. Vi märkte främst att hos honor är MOG35-55-inducerad EAE i allmänhet mer aggressiv (med tanke på den högre känsligheten hos honmöss med denna modell)36, eftersom de tenderar att ha tidigare debut och högre kumulativa kliniska poäng, vilket återspeglar ökad inflammation på ryggmärgsnivå än den som observerats hos hanar. En viktig slutsats är att detta protokoll kan inducera EAE hos både han- och honmöss, men forskarna måste komma ihåg att vissa aspekter av sjukdomen kan skilja sig åt mellan de två könen. Därför är det viktigt att korrekt överväga den huvudsakliga experimentella frågan som ska behandlas, att välja den mest gynnsamma djurmodellen och att utvärdera nödvändigheten av att inkludera antingen ett eller båda könen.

Kritiska steg och eventuell felsökning
Eftersom olika modeller av MS ger upphov till vissa specifika aspekter av sjukdomen, men inte alla6, är det första grundläggande steget att välja rätt modell med hänsyn till de specifika experimentella behoven och de vetenskapliga frågor som ska behandlas. För det andra bör immuniseringsproceduren utföras av en expert för att säkerställa att den görs korrekt och undvika fel eller variabilitet på grund av oprecisa procedurer. Dessutom måste utredaren känna till de djurskyddsbestämmelser som antagits av värdinstitutionen.

För det tredje bör emulsionen standardiseras i experimentet. Det bör noteras att varje mus uppvisar en typisk känslighet för induktionen, och därför kan vissa djur utveckla en mindre aggressiv sjukdom eller inte utveckla den alls. I så fall kan sjukdomens förekomst och svårighetsgrad optimeras genom att justera mängden MOG35-55 som administreras till mössen. För det fjärde, även om PT-injektion används i stor utsträckning för att underlätta induktion av EAE hos möss35,36, är det inte nödvändigt för varje protokoll 37,38. I frånvaro av PT utvecklar möss vanligtvis en mindre allvarlig och mer variabel form av EAE39. Dessutom kan ytterligare variabilitet orsakas av olika sätt att administrera PT (t.ex. intravenös kontra intraperitoneal) och eftersom styrkan av PT har beskrivits variera mellan batcher. För att övervinna detta problem är det viktigt att justera volymen efter styrkan hos varje sats som används och att förbereda PT-lösningen ordentligt40,41. Med tanke på de experimentella målen, utredarnas tekniska färdigheter och optimeringen av djurförsök är det grundläggande att välja det mest lämpliga induktionsprotokollet.

För det femte, för att samla in data på ett mer objektivt sätt, rekommenderas starkt blindad poängsättning av sjukdomssymtom. Dessutom föreslår vi klinisk poängsättning med en mer kvantitativ och objektiv utvärdering av sjukdomsförloppet, såsom utvärdering av rotarod-prestandan. Slutligen är det av grundläggande betydelse att ett korrekt urval av tillräckligt många försöksgrupper görs för att få fram tillförlitliga och jämförbara data (se avsnitt 2 i protokollet). Beräkningar av stickprovsstorlek bör utföras för att erhålla de nödvändiga gruppstorlekarna, beroende på den förväntade effektstorleken.

Huvudsakliga begränsningar
För det första kan detta induktionsprotokoll leda till mycket varierande resultat hos de immuniserade djuren, särskilt om gruppstorlekarna inte är tillräckligt stora eller om proceduren inte utförs korrekt. Därefter har MOG35-55-inducerad EAE, liksom alla andra tillgängliga modeller av MS, vissa begränsningar (dvs. den ger mycket lite information om MS-progression, B-cellernas roll i sjukdomen, inifrån och ut-mekanismerna eller svårigheter att studera remyelinisering)4,6. Därför är det återigen grundläggande att välja den medlemsstatsmodell som behövs för att ta itu med den specifika vetenskapliga frågan. Slutligen representeras den primära platsen för skadan av ryggmärgen, och patologin leder till uppkomsten av histopatologiska tecken på ett kaudalt-kraniellt sätt (dvs. som börjar från ryggmärgen och går upp till hjärnan). Detta är motsatsen till vad som sker hos människor och kan utgöra en betydande begränsning av modellen. Det är dock möjligt att också uppskatta vissa förändringar i hjärnan, med tanke på specifika mål.

Fördelar
För det första kan denna modell avsevärt bidra till förståelsen av perifera immunmedierade mekanismer och för att utvärdera de neuroinflammatoriska och, delvis, demyeliniserande processerna i CNS. Därefter skulle denna modell kunna tillämpas på några specifika transgena musstammar för att studera MS-utfall relaterade till specifika genetiska förändringar.

En annan fördel är att ha en klinisk utvärdering baserad på två metoder: den kliniska poängbedömningen och rotarodtestet. Detta leder till en mer kvantitativ, mindre subjektiv och mer exakt klinisk utvärdering av sjukdomsförloppet. Dessutom, som van den Berg et al. påpekade, är den rotarodbaserade utvärderingen starkt korrelerad till ytan av inflammatoriska lesioner i ryggmärgens motoriska system27.

Som vi diskuterade tidigare, även om denna modell inte helt reproducerar den sexuella dimorfismen vid MS, tror vi att detta är en fördel. Kombinationen av induktion med andra möjliga riskfaktorer, särskilt miljöfaktorerna, kan hjälpa till att förstå de specifika effekterna av sådana faktorer och identifiera deras specifika roll i förekomsten av vissa sexuellt dimorfa aspekter av MS. Slutligen har denna modell använts i stor utsträckning för att utveckla och testa ett brett spektrum av terapeutiska läkemedel och har därför potential att bidra till att utveckla nya terapeutiska metoder för denna sjukdom 4,6.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Ingen av författarna har några intressekonflikter att deklarera med avseende på forskning, författarskap och/eller publicering av denna artikel.

Acknowledgments

Detta arbete har fått stöd av Ministero dell'Istruzione, dell'Università e della Ricerca - MIUR-projektet Dipartimenti di Eccellenza 2018-2022 och 2023-2027 till Institutionen för neurovetenskap Rita Levi Montalcini; Cavalieri-Ottolenghi-stiftelsen, Orbassano, Italien. BB var stipendiat vid INFRA-P, Piemonte-regionen (n.378-35) (2022-2023) och PRIN 2020-20203AMKTW. Vi tackar Fondazione per la Ricerca Biomedica Onlus (FORB) för stödet. Utgivningsavgifterna har finansierats av en donation från Distretto Rotaract 2031, och i synnerhet Rotaract Club Torino Nord-Est. Vi tackar Elaine Miller för korrekturläsningen av vårt manus.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
18 G x 1 ½“ 1.2 x 40 mm needle for the glass syringe  Terumo TER-HYP-18G-112-PIN
Digital camera connected to the optical microscope NIKON DS-U1 digital camera
Electronic precision balance Merck Mod. Kern-440-47N, resolution 0.1 g
Eosin Y Sigma-Aldrich HT110216
Glass syringe pipet “ultra asept” 10 ml Sacco System  L003465
Glassware (i.e., becker to prepare the emulsion) VWR 213-1170, 213-1172
Hematoxylin (Mayer’s) Sigma-Aldrich MHS32 Filter before using it. 
Image analysis Software Fiji
Incomplete Freund’s adjuvant (IFA) Sigma-Aldrich F5506 Store at +4 °C. 
Isoflurane Wellona Pharma This drug is used as inhalational anaesthetic.
Male and female C57BL/6J mice Jackson Laboratory, Envigo Age 8-10 weeks, optimal body weight of ~20 g. 
Microtome Leica HistoCore BIOCUT R
Mounting Medium  Merck 107961
Mouse Rotarod Ugo Basile  #47600
Mycobacterium tuberculosis (MT), strain H37Ra  Difco Laboratories Inc.  231141 Store at +4 °C.
Myelin oligodendrocyte glycoprotein peptide 35-55 (MOG35-55) Espikem EPK1 Store at -80 °C diluted (2 mg/mL) in physiological solution; prepare it on the day of the immunization to avoid, as much as possible, alterations or contaminations. 
Optical microscope NIKON eclipse 90i
Paraformaldehyde (PFA) Sigma-Aldrich 158127 Store at +4 °C once diluted (4%) in phosphate buffer. 
Pertussis toxin (PT) Duotech  PT.181 Store at -80°C diluted (concentration 5 µg/mL) in physiological solution 
Physiological solution (sodium chloride 0.9% solution) B. Eurospital A 032182038 Store at +4 °C once opened.
Saline phosphate buffer (PBS) Thermo Scientific J61196.AP
Software for image acquisition  NIS-Element AR 2.10
Syringes U-100 0.5 mL with 30 G x 5/16” (0.30 x 8 mm) in fixed needle  Nipro SYMS-0.5U100-3008B-EC
Syringes U-100 1 mL with 26G x ½” (0.45 x 12.7 mm) in needle PIC 20,71,26,03,00,354
Vet ointment for eyes Lacrilube, Lacrigel Europhta
Xylazine Rompun This mixture of drug is used as injectable anaesthetic and sedative. 
Zolazepam and Tiletamine Zoletil  100 This drug is used as injectable anaesthetic, sedative, muscle relaxer, and analgesic

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Thompson, A. J., Baranzini, S. E., Geurts, J., Hemmer, B., Ciccarelli, O. Multiple sclerosis. Lancet. 391 (10130), 1622-1636 (2018).
  2. Gold, S. M., Willing, A., Leypoldt, F., Paul, F., Friese, M. A. Sex differences in autoimmune disorders of the central nervous system. Semin immunopathol. 41 (2), 177-188 (2019).
  3. Smith, P. Animal models of multiple sclerosis. Curr Protoc. 1 (6), 185 (2021).
  4. Procaccini, C., De Rosa, V., Pucino, V., Formisano, L., Matarese, G. Animal models of Multiple Sclerosis. Eur J Pharmacol. 759, 182-191 (2015).
  5. Torre-Fuentes, L., et al. Experimental models of demyelination and remyelination. Neurologia. 35 (1), 32-39 (2020).
  6. Kipp, M., Nyamoya, S., Hochstrasser, T., Amor, S. Multiple sclerosis animal models: a clinical and histopathological perspective. Brain Pathol. 27 (2), Zurich, Switzerland. 123-137 (2017).
  7. Racke, M. K. Experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE). Curr Protoc Neurosci. , Chapter 9, Unit 9.7 (2001).
  8. Constantinescu, C. S., Farooqi, N., O'Brien, K., Gran, B. Experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) as a model for multiple sclerosis (MS). Br J Pharmacol. 164 (4), 1079-1106 (2011).
  9. Montarolo, F., Perga, S., Martire, S., Bertolotto, A. Nurr1 reduction influences the onset of chronic EAE in mice. Inflamm Res. 64 (11), 841-844 (2015).
  10. Montarolo, F., et al. Effects of isoxazolo-pyridinone 7e, a potent activator of the Nurr1 signaling pathway, on experimental autoimmune encephalomyelitis in mice. PLoS One. 9 (9), 108791 (2014).
  11. Furlan, C., et al. Analysis of the gadolinium retention in the experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) murine model of multiple sclerosis. J Trace Elem Med Biol. 68, 126831 (2021).
  12. Desole, C., et al. Engineering, characterization, and biological evaluation of an antibody targeting the HGF receptor. Front Immunol. 12, 775151 (2021).
  13. Voskuhl, R. R., MacKenzie-Graham, A. Chronic experimental autoimmune encephalomyelitis is an excellent model to study neuroaxonal degeneration in multiple sclerosis. Front Mol Neurosci. 15, 1024058 (2022).
  14. McCombe, P. A., Greer, J. M. Effects of biological sex and pregnancy in experimental autoimmune encephalomyelitis: It's complicated. Front Immunol. 13, 1059833 (2022).
  15. Ascherio, A., Munger, K. L. Epidemiology of multiple sclerosis: from risk factors to prevention-an update. Semin Neurol. 36 (2), 103-114 (2016).
  16. Spence, R. D., Voskuhl, R. R. Neuroprotective effects of estrogens and androgens in CNS inflammation and neurodegeneration. Front Neuroendocrinol. 33 (1), 105-115 (2012).
  17. Laffont, S., Garnier, L., Lélu, K., Guéry, J. -C. Estrogen-mediated protection of experimental autoimmune encephalomyelitis: Lessons from the dissection of estrogen receptor-signaling in vivo. Biomed J. 38 (3), 194-205 (2015).
  18. Avila, M., Bansal, A., Culberson, J., Peiris, A. N. The role of sex hormones in multiple sclerosis. Eur Neurol. 80 (1-2), 93-99 (2018).
  19. Collongues, N., Patte-Mensah, C., De Seze, J., Mensah-Nyagan, A. -G., Derfuss, T. Testosterone and estrogen in multiple sclerosis: from pathophysiology to therapeutics. Expert Rev Neurother. 18 (6), 515-522 (2018).
  20. Kilkenny, C., Browne, W. J., Cuthill, I. C., Emerson, M., Altman, D. G. Improving bioscience research reporting: the ARRIVE guidelines for reporting animal research. PLoS Biol. 8 (6), 1000412 (2010).
  21. Shaw, M. K., Zhao, X., Tse, H. Y. Overcoming unresponsiveness in experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) resistant mouse strains by adoptive transfer and antigenic challenge. J Vis Exp. (62), e3778 (2012).
  22. Bittner, S., Afzali, A. M., Wiendl, H., Meuth, S. G. Myelin oligodendrocyte glycoprotein (MOG35-55) induced experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) in C57BL/6 mice. J Vis Exp. (86), (2014).
  23. Downton, P., Early, J. O., Gibbs, J. E. Circadian rhythms in adaptive immunity. Immunology. 161 (4), 268-277 (2020).
  24. McLean, A. C., Valenzuela, N., Fai, S., Bennett, S. A. L. Performing vaginal lavage, crystal violet staining, and vaginal cytological evaluation for mouse estrous cycle staging identification. J Vis Exp. (67), e4389 (2012).
  25. Rahn, E. J., Iannitti, T., Donahue, R. R., Taylor, B. K. Sex differences in a mouse model of multiple sclerosis: neuropathic pain behavior in females but not males and protection from neurological deficits during proestrus. Biol Sex Differ. 5 (1), 4 (2014).
  26. Bonaldo, B., et al. Effects of perinatal exposure to bisphenol A or S in EAE model of multiple sclerosis. Cell Tissue Res. 392 (2), 467-480 (2023).
  27. vanden Berg, R., Laman, J. D., van Meurs, M., Hintzen, R. Q., Hoogenraad, C. C. Rotarod motor performance and advanced spinal cord lesion image analysis refine assessment of neurodegeneration in experimental autoimmune encephalomyelitis. J Neurosci Methods. 262, 66-76 (2016).
  28. Bolton, C., Smith, P. Defining and regulating acute inflammatory lesion formation during the pathogenesis of multiple sclerosis and experimental autoimmune encephalomyelitis. CNS Neurol Disord Drug Targets. 14 (7), 915-935 (2015).
  29. Glaser, J. R., Glaser, E. M. Neuron imaging with Neurolucida--a PC-based system for image combining microscopy. Comput Med Imaging Graph. 14 (5), 307-317 (1990).
  30. Kennedy, H. S., Puth, F., Van Hoy, M., Le Pichon, C. A method for removing the brain and spinal cord as one unit from adult mice and rats. Lab Anim (NY). 40 (2), 53-57 (2011).
  31. Watson, C., Paxinos, G., Kayalioglu, G., Heise, C. Chapter 16 - Atlas of the mouse spinal cord. The Spinal. Watson, C., Paxinos, G., Kayalioglu, G. , Academic Press. 308-379 (2009).
  32. Khan, A., et al. Suppression of TRPV1/TRPM8/P2Y nociceptors by withametelin via downregulating MAPK signaling in mouse model of vincristine-induced neuropathic pain. Int J Mol Sci. 22 (11), 6084 (2021).
  33. Bergamaschi, R. Prognostic factors in multiple sclerosis. Int Rev Neurobiol. 79, 423-447 (2007).
  34. Harbo, H. F., et al. Genes in the HLA class I region may contribute to the HLA class II-associated genetic susceptibility to multiple sclerosis. Tissue Antigens. 63 (3), 237-247 (2004).
  35. Ryan, L., Mills, K. H. G. Sex differences regulate immune responses in experimental autoimmune encephalomyelitis and multiple sclerosis. Eur J Immunol. 52 (1), 24-33 (2022).
  36. Lasrado, N., et al. Mechanisms of sex hormones in autoimmunity: focus on EAE. Biol Sex Differ. 11 (1), 50 (2020).
  37. Hofstetter, H. H., Shive, C. L., Forsthuber, T. G. Pertussis toxin modulates the immune response to neuroantigens injected in incomplete Freund's adjuvant: induction of Th1 cells and experimental autoimmune encephalomyelitis in the presence of high frequencies of Th2 cells. J Immunol. 169 (1), 117-125 (2002).
  38. Maria, Z., Turner, E., Agasing, A., Kumar, G., Axtell, R. C. Pertussis toxin inhibits encephalitogenic T-cell infiltration and promotes a B-cell-driven disease during Th17-EAE. Int J Mol Sci. 22 (6), 2924 (2021).
  39. Krementsov, D. N., et al. Studies in experimental autoimmune encephalomyelitis do not support developmental bisphenol a exposure as an environmental factor in increasing multiple sclerosis risk. Toxicol Sci. 135 (1), 91-102 (2013).
  40. Kummari, E., Nichols, J. M., Yang, E. -J., Kaplan, B. L. F. Neuroinflammation and B-cell phenotypes in cervical and lumbosacral regions of the spinal cord in experimental autoimmune encephalomyelitis in the absence of pertussis toxin. Neuroimmunomodulation. 26 (4), 198-207 (2019).
  41. Huntemann, N., et al. An optimized and validated protocol for inducing chronic experimental autoimmune encephalomyelitis in C57BL/6J mice. J Neurosci Methods. 367, 109443 (2022).

Tags

Neurovetenskap utgåva 200 MOG35-55-inducerad experimentell autoimmun encefalomyelit kronisk autoimmun inflammatorisk sjukdom centrala nervsystemet (CNS) prevalens hos kön aggressiva former kliniska aspekter radiologiska egenskaper patologiska egenskaper experimentella djurmodeller experimentell autoimmun encefalomyelit (EAE) manlig och kvinnlig C57BL/6J-möss myelinoligodendrocytglykoprotein peptid 35-55 (MOG35-55) Immunisering kronisk form av sjukdomen daglig klinisk poäng motorisk Prestation histologisk analys ryggmärg

Erratum

Formal Correction: Erratum: Modeling Multiple Sclerosis in the Two Sexes: MOG35-55-Induced Experimental Autoimmune Encephalomyelitis
Posted by JoVE Editors on 02/16/2024. Citeable Link.

An erratum was issued for: Modeling Multiple Sclerosis in the Two Sexes: MOG35-55-Induced Experimental Autoimmune Encephalomyelitis. The Authors section was updated. An additional affiliation (School of Pharmacy, Pharmacology Unit, University of Camerino) was added for author Antonino Casile.

Modellering av multipel skleros hos de två könen: MOG<sub>35-55-inducerad</sub> experimentell autoimmun encefalomyelit
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Bonaldo, B., Casile, A., Montarolo,… More

Bonaldo, B., Casile, A., Montarolo, F., Bertolotto, A. Modeling Multiple Sclerosis in the Two Sexes: MOG35-55-Induced Experimental Autoimmune Encephalomyelitis. J. Vis. Exp. (200), e65778, doi:10.3791/65778 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter