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Sciences du comportement

Drosophila melanogaster를 사용하여 나이 관련 수면 장애를 위한 High-throughput 작은 분자 약 검열

Published: October 20, 2023
doi:
10.3791/65787
, , , , ,
1School of Life Science and Technology, Key Laboratory of Developmental Genes and Human Disease,Southeast University

Summary

제시된 것은 노인 초파리 모델에서 초파리 의 수면 행동을 모니터링하여 수면을 개선하기 위한 고처리량 약물 스크리닝을 위한 프로토콜입니다.

Abstract

건강과 전반적인 웰빙의 필수 구성 요소인 수면은 수면 시간이 짧아지고 패턴이 단편화되는 수면 장애를 자주 경험하는 노인에게 종종 어려움을 초래합니다. 이러한 수면 장애는 또한 당뇨병, 심혈관 질환 및 심리 장애를 포함한 노인의 다양한 질병의 위험 증가와 관련이 있습니다. 안타깝게도 수면 장애에 대한 기존 약물은 인지 장애 및 중독과 같은 심각한 부작용과 관련이 있습니다. 따라서 새롭고 더 안전하며 효과적인 수면 장애 치료제의 개발이 시급합니다. 그러나 현재 약물 스크리닝 방법의 높은 비용과 긴 실험 기간은 여전히 제한 요인으로 남아 있습니다.

이 프로토콜은 포유류에 비해 수면 조절 메커니즘이 고도로 보존된 종인 Drosophila melanogaster를 활용하는 비용 효율적이고 처리량이 높은 스크리닝 방법을 설명하여 노인의 수면 장애 연구에 이상적인 모델입니다. 늙은 파리에게 다양한 작은 화합물을 투여함으로써 수면 장애에 미치는 영향을 평가할 수 있습니다. 이 파리의 수면 행동은 적외선 모니터링 장치를 사용하여 기록되고 오픈 소스 데이터 패키지인 Sleep and Circadian Analysis MATLAB Program 2020(SCAMP2020)으로 분석됩니다. 이 프로토콜은 수면 조절을 위한 저렴하고 재현 가능하며 효율적인 스크리닝 접근 방식을 제공합니다. 초파리는 수명주기가 짧고 사육 비용이 낮으며 취급이 쉽기 때문에이 방법의 훌륭한 주제입니다. 예를 들어, 테스트된 약물 중 하나인 Reserpine은 노령 파리의 수면 시간을 촉진하는 능력을 입증하여 이 프로토콜의 효과를 강조했습니다.

Introduction

인간의 생존에 필요한 필수 행동 중 하나인 수면은 크게 두 가지 상태, 즉 급속 안구 운동(REM) 수면과 비급속 안구 운동(NREM) 수면1로 나뉜다. NREM 수면은 N1(각성과 수면 사이의 전환), N2(얕은 수면), N3(깊은 수면, 서파 수면)의 세 단계로 구성되며, 각성에서 깊은 수면으로의 진행을 나타냅니다1. 수면은 신체적, 정신적 건강에 중요한 역할을 한다2. 그러나 노화는 성인의 총 수면 시간, 수면 효율, 서파 수면 비율, REM 수면 비율을 감소시킨다3. 나이가 많은 사람들은 서파 수면에 비해 얕은 수면에 더 많은 시간을 보내는 경향이 있어 야간 각성에 더 민감합니다. 각성 횟수가 증가함에 따라 평균 수면 시간이 감소하여 노인의 수면 패턴이 단편화되며, 이는 마우스에서 Hcrt 뉴런의 과도한 흥분과 관련될 수 있다4. 또한, 일주기 메커니즘의 노화 관련 감소는 수면 시간의 조기 변화에 기여합니다 5,6. 신체적 질병, 심리적 스트레스, 환경적 요인 및 약물 사용과 함께 이러한 요인은 노인을 불면증, REM 수면 행동 장애, 기면증, 주기적인 다리 움직임, 하지불안증후군, 수면 호흡 장애와 같은 수면 장애에 더 취약하게 만듭니다 7,8.

역학 연구에 따르면 수면 장애는 우울증10, 심혈관 질환11, 치매12 등 노인의 만성 질환9과 밀접한 관련이 있는 것으로 나타났다. 수면 장애를 해결하는 것은 만성 질환을 개선 및 치료하고 노인의 삶의 질을 향상시키는 데 중요한 역할을 합니다. 현재 환자들은 수면의 질을 향상시키기 위해 벤조디아제핀, 비벤조디아제핀, 멜라토닌 수용체 작용제와 같은 약물에 주로 의존하고 있다13. 그러나 벤조디아제핀은 장기 복용 후 수용체의 하향 조절과 의존성을 유발할 수 있으며, 복용 중단 시 심각한 금단 증상을 유발할 수 있다14,15. 비벤조디아제핀 약물은 치매16, 골절17, 암18 등의 위험을 수반한다. 일반적으로 사용되는 멜라토닌 수용체 작용제인 라멜테온(ramelteon)은 수면 잠복기를 감소시키지만 수면 시간을 늘리지 않으며 광범위한 1차 통과 제거로 인해 간 기능 관련 문제가 있다19. 멜라토닌 수용체 작용제이자 세로토닌 수용체 길항제인 아고멜라틴은 우울증 관련 불면증을 개선하지만 간 손상의 위험도 있다20. 따라서 수면 장애를 치료하거나 완화하기 위해 더 안전한 약물이 시급히 필요합니다. 그러나 자동화된 시스템 및 컴퓨터 분석과 결합된 분자 및 세포 실험을 기반으로 하는 현재의 약물 스크리닝 전략은 비용과 시간이 많이 소요된다21. 수용체 구조와 특성에 의존하는 구조 기반 약물 설계 전략은 수용체 3차원 구조에 대한 명확한 이해가 필요하며 약물 효과에 대한 예측 능력이 부족하다22.

2000년, 1984년 캠벨(Campbell)과 토블러(Tobler)가 제안한 수면 기준에 기초하여23, 연구자들은 수면과 유사한 상태(25,26)를 나타내는 초파리 멜라노가스터(Drosophila melanogaster)를 포함하여 수면24를 연구하기 위한 간단한 동물 모델을 확립했다. 초파리와 인간의 해부학적 차이에도 불구하고 초파리의 수면을 조절하는 많은 신경화학적 구성 요소와 신호 전달 경로가 포유류의 수면에서 보존되어 인간 신경 질환 연구를 용이하게 합니다27,28. 초파리는 또한 파리와 포유류 사이의 코어 발진기의 차이에도 불구하고 일주기 리듬 연구에서 광범위하게 사용됩니다 29,30,31. 따라서 초파리는 수면 행동을 연구하고 수면 관련 약물 스크리닝을 수행하는 데 귀중한 모델 유기체 역할을 합니다.

이 연구는 늙은 파리를 사용하여 수면 장애를 치료하기 위한 저분자 약물을 스크리닝하기 위한 비용 효율적이고 간단한 표현형 기반 접근 방식을 제안합니다. 초파리 의 수면 조절은 매우 잘 보존되어 있으며25 나이가 들면서 관찰되는 수면 감소는 약물 투여를 통해 되돌릴 수 있다. 따라서, 이러한 수면 표현형 기반 스크리닝 방법은 약물 효능을 직관적으로 반영할 수 있다. 조사 중인 약물과 먹이를 섞어 파리에게 먹이고, DAM(Drosophila Activity Monitor)32을 사용하여 수면 행동을 모니터링 및 기록하고, MATLAB의 오픈 소스 SCAMP2020 데이터 패키지를 사용하여 수집된 데이터를 분석합니다(그림 1). 통계 분석은 통계 및 그래프 소프트웨어를 사용하여 수행됩니다( 자료표 참조). 예를 들어, 수면을 증가시키는 것으로 보고된 소포성 모노아민 수송체의 저분자 억제제인 Reserpine에 대한 실험 데이터를 제시하여 이 프로토콜의 효과를 입증합니다33. 이 프로토콜은 노화 관련 수면 문제를 치료하기 위한 약물을 식별하는 데 유용한 접근 방식을 제공합니다.

Protocol

이 프로토콜은 블루밍턴 초파리 스톡 센터(Bloomington Drosophila Stock Center)에서 채취한 30일 된 w1118 파리를 사용합니다(BDSC_3605, 자료표 참조). 1. 숙성 초파리의 준비 음식 준비콘플레이크 50g/L, 설탕 110g/L, 한천 5g, 효모 25g/L를 섞어 표준 옥수수 전분 배양 배지를 준비합니다. 콘플레이크와 이스트를 물로 가열하여 젤라틴?…

Representative Results

레세르핀(Reserpine)은 수포성 모노아민 수송체(vesicular monoamine transporter, VMAT)의 저분자 억제제로, 모노아민이 시냅스전 소포(presynaptic vesicles)로 재흡수되는 것을 억제하여 수면 증가를 유도한다33. 레세르핀의 수면 촉진 효과는 생후 30일 된 파리를 대상으로 조사되었으며, 대조군에는 용매인 디메틸설폭사이드(DMSO)만 먹였습니다. 레세르핀 그룹에서 나이 든 파리는 DMSO 그룹에 비해 …

Discussion

설명된 방법은 중소 규모의 수면제를 신속하게 스크리닝하는 데 적합합니다. 현재 대부분의 주류 고처리량 약물 스크리닝 방법은 생화학 및 세포 수준을 기반으로 합니다. 예를 들어, 수용체의 구조 및 특성을 검사하여 수용체에 결합할 수 있는 특정 리간드를 검색한다(22). 또 다른 접근법은 질량 분석법(35)과 함께 핵 자기 공명(NMR)을 사용하여 선택된 약물의 ?…

Divulgations

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

토론과 의견을 주신 한준하이 교수님의 연구실 구성원 여러분께 감사드립니다. 이 연구는 Y.T.에 32170970 중국 국립 자연 과학 재단과 Z.C.Z.에 장쑤성의 “시안 블루 프로젝트”의 지원을 받았습니다.

Materials

Ager BIOFROXX 8211KG001
Artificial Climate Box PRANDT PRX-1000A official website:https://www.nbplt17.com/PLTXBS-Products-20643427/
DAM2 Drosophila Activity Monitor TriKineics DAM2 official website:https://www.trikinetics.com/
DAM2system TriKineics version:v3.03 official website:https://www.trikinetics.com/
DAMFileScan TriKineics version:1.0.7.0 official website:https://www.trikinetics.com/
Dimethyl Sulfoxide SIGMA 276855
Drosophila Activity Monitoring Incubator Tritech Research DT2-CIRC-TK official website:https://www.tritechresearch.com/DT2-CIRC-TK.html
Drosophila Bottles Biologix 51-17720 official website:http://biologixgroup.com/goods.php?id=48
Drosophila: w1118 Bloomington Drosophila Stock Center  BDSC_3605
Excel Microsoft version:Excel 2016 official website:https://www.microsoftstore.com.cn/software/office/excel
Glass tubes TriKinetics PPT5x65 official website:https://www.trikinetics.com/
MATLABR2022b MathWorks version:9.13.0.2049777 official website:https://ww2.mathworks.cn/products/matlab.html
Prism GraphPad Version:Prism 8.0.1 official website:https://www.graphpad.com/features
Reserpine MACKLIN R817202-1g
Saccharose SIGMA 1245GR500
SCAMP Vecsey Lab N/A official website:https://academics.skidmore.edu/blogs/cvecsey/
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Keywords: High-throughput ScreeningDrug DiscoveryStructure-based DesignFragment-based DesignDrosophila MelanogasterSleep DisordersInfrared MonitoringSCAMP2020Cost-effectiveAge-related Sleep Disorders
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Citer Cet Article
Zhang, Z., Wang, Y., Zhao, J., Han, S., Zhang, Z. C., Tian, Y. High-Throughput Small Molecule Drug Screening For Age-Related Sleep Disorders Using Drosophila melanogaster. J. Vis. Exp. (200), e65787, doi:10.3791/65787 (2023).
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