Detección de fármacos de moléculas pequeñas de alto rendimiento para trastornos del sueño relacionados con la edad con Drosophila melanogaster
Summary
Se presenta un protocolo para el cribado de fármacos de alto rendimiento para mejorar el sueño mediante el seguimiento del comportamiento del sueño de las moscas de la fruta en un modelo de Drosophila de edad avanzada.
Abstract
El sueño, un componente esencial de la salud y el bienestar general, a menudo presenta desafíos para las personas mayores que experimentan con frecuencia trastornos del sueño caracterizados por una duración del sueño más corta y patrones fragmentados. Estas interrupciones del sueño también se correlacionan con un mayor riesgo de diversas enfermedades en las personas mayores, como diabetes, enfermedades cardiovasculares y trastornos psicológicos. Desafortunadamente, los medicamentos existentes para los trastornos del sueño se asocian con efectos secundarios significativos, como deterioro cognitivo y adicción. En consecuencia, se necesita urgentemente el desarrollo de nuevos medicamentos para los trastornos del sueño, más seguros y más eficaces. Sin embargo, el alto costo y la larga duración experimental de los métodos actuales de detección de drogas siguen siendo factores limitantes.
Este protocolo describe un método de cribado rentable y de alto rendimiento que utiliza Drosophila melanogaster, una especie con un mecanismo de regulación del sueño altamente conservado en comparación con los mamíferos, lo que lo convierte en un modelo ideal para estudiar los trastornos del sueño en los ancianos. Al administrar varios compuestos pequeños a moscas envejecidas, podemos evaluar sus efectos sobre los trastornos del sueño. Los comportamientos de sueño de estas moscas se registran mediante un dispositivo de monitorización infrarroja y se analizan con el paquete de datos de código abierto Sleep and Circadian Analysis MATLAB Program 2020 (SCAMP2020). Este protocolo ofrece un enfoque de detección de bajo costo, reproducible y eficiente para la regulación del sueño. Las moscas de la fruta, debido a su corto ciclo de vida, bajo costo de cría y facilidad de manejo, sirven como excelentes sujetos para este método. A modo de ilustración, la reserpina, uno de los fármacos probados, demostró la capacidad de promover la duración del sueño en moscas ancianas, destacando la eficacia de este protocolo.
Introduction
El sueño, uno de los comportamientos esenciales necesarios para la supervivencia humana, se caracteriza por dos estados principales: el sueño de movimientos oculares rápidos (REM) yel sueño de movimientos oculares no rápidos (NREM). El sueño NREM comprende tres etapas: N1 (la transición entre la vigilia y el sueño), N2 (sueño ligero) y N3 (sueño profundo, sueño de ondas lentas), que representan la progresión de la vigilia al sueño profundo1. El sueño juega un papel crucial tanto en la salud física como en la mental2. Sin embargo, el envejecimiento reduce la duración total del sueño, la eficiencia del sueño, el porcentaje de sueño de ondas lentas y el porcentaje de sueño REM en adultos3. Las personas mayores tienden a pasar más tiempo en sueño ligero en comparación con el sueño de ondas lentas, lo que los hace más sensibles a los despertares nocturnos. A medida que aumenta el número de despertares, el tiempo medio de sueño disminuye, lo que da lugar a un patrón de sueño fragmentado en los ancianos, que puede estar asociado a una excitación excesiva de las neuronas Hcrt en ratones4. Además, las disminuciones relacionadas con la edad en los mecanismos circadianos contribuyen a un cambio más temprano en la duración del sueño 5,6. En combinación con las enfermedades físicas, el estrés psicológico, los factores ambientales y el uso de medicamentos, estos factores hacen que los adultos mayores sean más susceptibles a los trastornos del sueño, como el insomnio, el trastorno del comportamiento del sueño REM, la narcolepsia, los movimientos periódicos de las piernas, el síndrome de piernas inquietas y los trastornos respiratorios del sueño 7,8.
Los estudios epidemiológicos han demostrado que los trastornos del sueño están estrechamente relacionados con las enfermedades crónicas en los ancianos9, incluyendo la depresión 10, las enfermedades cardiovasculares11 y la demencia12. Abordar los trastornos del sueño desempeña un papel crucial en la mejora y el tratamiento de las enfermedades crónicas y en la mejora de la calidad de vida de los adultos mayores. En la actualidad, los pacientes recurren principalmente a fármacos como las benzodiacepinas, las no benzodiacepinas y los agonistas de los receptores de melatonina para mejorar la calidad del sueño13. Sin embargo, las benzodiacepinas pueden conducir a una regulación negativa de los receptores y a la dependencia después de un uso prolongado, causando síntomas graves de abstinencia tras la interrupción14,15. Los medicamentos no benzodiacepinas también conllevan riesgos, como demencia16, fracturas17 y cáncer18. El agonista del receptor de melatonina de uso común, el ramelteón, reduce la latencia del sueño, pero no aumenta la duración del sueño y tiene problemas relacionados con la función hepática debido a la extensa eliminación del primer paso19. La agomelatina, un agonista de los receptores de melatonina y antagonista de los receptores de serotonina, mejora el insomnio relacionado con la depresión, pero también presenta un riesgo de daño hepático20. En consecuencia, existe una necesidad urgente de medicamentos más seguros para tratar o aliviar los trastornos del sueño. Sin embargo, las estrategias actuales de cribado de fármacos, basadas en experimentos moleculares y celulares combinados con sistemas automatizados y análisis informáticos, son costosas y requieren mucho tiempo21. Las estrategias de diseño de fármacos basadas en la estructura, que se basan en la estructura y las propiedades de los receptores, requieren una comprensión clara de la estructura tridimensional de los receptores y carecen de capacidades predictivas de los efectos de los fármacos22.
En el año 2000, con base en los criterios de sueño propuestos por Campbell y Tobler en 1984 23, los investigadores establecieron modelos animales simples para estudiar el sueño 24, incluyendo Drosophila melanogaster, que exhibía estados similares al sueño25,26. A pesar de las diferencias anatómicas entre Drosophila y los humanos, muchos componentes neuroquímicos y vías de señalización que regulan el sueño en Drosophila se conservan en el sueño de los mamíferos, facilitando el estudio de las enfermedades neurológicas humanas27,28. Drosophila también se utiliza ampliamente en los estudios del ritmo circadiano, a pesar de las diferencias en los osciladores centrales entre moscas y mamíferos 29,30,31. Por lo tanto, Drosophila sirve como un valioso organismo modelo para estudiar el comportamiento del sueño y realizar pruebas de detección de drogas relacionadas con el sueño.
Este estudio propone un enfoque rentable y sencillo basado en el fenotipo para el cribado de fármacos de moléculas pequeñas para tratar los trastornos del sueño utilizando moscas envejecidas. La regulación del sueño en Drosophila está altamente conservada25, y la disminución del sueño observada con la edad puede ser reversible mediante la administración de fármacos. Por lo tanto, este método de detección basado en el fenotipo del sueño puede reflejar intuitivamente la eficacia del fármaco. Alimentamos a las moscas con una mezcla del fármaco investigado y la comida, monitorizamos y registramos el comportamiento del sueño utilizando el Drosophila Activity Monitor (DAM)32 y analizamos los datos adquiridos utilizando el paquete de datos SCAMP2020 de código abierto de MATLAB (Figura 1). El análisis estadístico se realiza mediante estadísticas y software de gráficos (ver Tabla de Materiales). A modo de ejemplo, demostramos la efectividad de este protocolo mediante la presentación de datos experimentales sobre la reserpina, un inhibidor de molécula pequeña del transportador vesicular de monoaminas que se ha reportado que aumenta el sueño33. Este protocolo proporciona un enfoque valioso para identificar medicamentos para tratar los problemas de sueño relacionados con la edad.
Protocol
Representative Results
Discussion
El método descrito es adecuado para la detección rápida de medicamentos para dormir pequeños y medianos. En la actualidad, la mayoría de los métodos convencionales de detección de fármacos de alto rendimiento se basan en los niveles bioquímicos y celulares. Por ejemplo, se examina la estructura y las propiedades del receptor para buscar ligandos específicos que puedan unirse a él22. Otro enfoque consiste en analizar el modo de unión y la fuerza de los fragmentos moleculares de fármaco…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos a los miembros del laboratorio del Prof. Junhai Han por su discusión y comentarios. Este trabajo fue apoyado por la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China 32170970 a Y.T y el “Proyecto Azul de Cianina” de la provincia de Jiangsu a Z.C.Z.
Materials
| Ager | BIOFROXX | 8211KG001 | |
| Artificial Climate Box | PRANDT | PRX-1000A | official website:https://www.nbplt17.com/PLTXBS-Products-20643427/ |
| DAM2 Drosophila Activity Monitor | TriKineics | DAM2 | official website:https://www.trikinetics.com/ |
| DAM2system | TriKineics | version:v3.03 | official website:https://www.trikinetics.com/ |
| DAMFileScan | TriKineics | version:1.0.7.0 | official website:https://www.trikinetics.com/ |
| Dimethyl Sulfoxide | SIGMA | 276855 | |
| Drosophila Activity Monitoring Incubator | Tritech Research | DT2-CIRC-TK | official website:https://www.tritechresearch.com/DT2-CIRC-TK.html |
| Drosophila Bottles | Biologix | 51-17720 | official website:http://biologixgroup.com/goods.php?id=48 |
| Drosophila: w1118 | Bloomington Drosophila Stock Center | BDSC_3605 | |
| Excel | Microsoft | version:Excel 2016 | official website:https://www.microsoftstore.com.cn/software/office/excel |
| Glass tubes | TriKinetics | PPT5x65 | official website:https://www.trikinetics.com/ |
| MATLABR2022b | MathWorks | version:9.13.0.2049777 | official website:https://ww2.mathworks.cn/products/matlab.html |
| Prism | GraphPad | Version:Prism 8.0.1 | official website:https://www.graphpad.com/features |
| Reserpine | MACKLIN | R817202-1g | |
| Saccharose | SIGMA | 1245GR500 | |
| SCAMP | Vecsey Lab | N/A | official website:https://academics.skidmore.edu/blogs/cvecsey/ |
References
- Le Bon, O. Relationships between REM and NREM in the NREM-REM sleep cycle: a review on competing concepts. Sleep Medicine. 70, 6-16 (2020).
- Krueger, J. M., Frank, M. G., Wisor, J. P., Roy, S. Sleep function: Toward elucidating an enigma. Sleep Medicine Reviews. 28, 46-54 (2016).
- Ohayon, M. M., Carskadon, M. A., Guilleminault, C., Vitiello, M. V. Meta-analysis of quantitative sleep parameters from childhood to old age in healthy individuals: developing normative sleep values across the human lifespan. Sleep. 27 (7), 1255-1273 (2004).
- Li, S. B., et al. Hyperexcitable arousal circuits drive sleep instability during aging. Science. 375 (6583), eabh3021 (2022).
- Rodriguez, J. C., Dzierzewski, J. M., Alessi, C. A. Sleep problems in the elderly. Medical Clinics of North America. 99 (2), 431-439 (2015).
- Gulia, K. K., Kumar, V. M. Sleep disorders in the elderly: a growing challenge. Psychogeriatrics. 18 (3), 155-165 (2018).
- Wolkove, N., Elkholy, O., Baltzan, M., Palayew, M. Sleep and aging: 1. Sleep disorders commonly found in older people. Canadian Medical Association Journal. 176 (9), 1299-1304 (2007).
- Suzuki, K., Miyamoto, M., Hirata, K. Sleep disorders in the elderly: Diagnosis and management. Journal of General and Family Medicine. 18 (2), 61-71 (2017).
- Foley, D. J., et al. Sleep complaints among elderly persons – an epidemiologic-study of 3 communities. Sleep. 18 (6), 425-432 (1995).
- Yu, D. S. Insomnia Severity Index: psychometric properties with Chinese community-dwelling older people. Journal of Advanced Nursing. 66 (10), 2350-2359 (2010).
- Hoevenaar-Blom, M. P., Spijkerman, A. M., Kromhout, D., van den Berg, J. F., Verschuren, W. M. Sleep duration and sleep quality in relation to 12-year cardiovascular disease incidence: the MORGEN study. Sleep. 34 (11), 1487-1492 (2011).
- Rebok, G. W., Rovner, B. W., Folstein, M. F. Sleep disturbance and Alzheimer’s disease: relationship to behavioral problems. Aging (Milano). 3 (2), 193-196 (1991).
- Schroeck, J. L., et al. Review of safety and efficacy of sleep medicines in older adults. Clinical Therapeutics. 38 (11), 2340-2372 (2016).
- Pericic, D., Strac, D. S., Jembrek, M. J., Vlainic, J. Allosteric uncoupling and up-regulation of benzodiazepine and GABA recognition sites following chronic diazepam treatment of HEK 293 cells stably transfected with alpha1beta2gamma2S subunits of GABA (A) receptors. Naunyn-Schmiedeberg’s Archives of Pharmacology. 375 (3), 177-187 (2007).
- Lader, M. History of benzodiazepine dependence. Journal of Substance Abuse Treatment. 8 (1-2), 53-59 (1991).
- Chen, P. L., Lee, W. J., Sun, W. Z., Oyang, Y. J., Fuh, J. L. Risk of dementia in patients with insomnia and long-term use of hypnotics: a population-based retrospective cohort study. Plos One. 7 (11), e49113 (2012).
- Kang, D. Y., et al. Zolpidem use and risk of fracture in elderly insomnia patients. Journal of Preventive Medicine and Public Health. 45 (4), 219-226 (2012).
- Kao, C. H., et al. Relationship of zolpidem and cancer risk: a Taiwanese population-based cohort study. Mayo Clinic Protocols. 87 (5), 430-436 (2012).
- Sateia, M. J., Kirby-Long, P., Taylor, J. L. Efficacy and clinical safety of ramelteon: an evidence-based review. Sleep Medicine Reviews. 12 (4), 319-332 (2008).
- Friedrich, M. E., et al. Drug-induced liver injury during antidepressant treatment: results of amsp, a drug surveillance program. The International Journal of Neuropsychopharmacology. 19 (4), pyv126 (2016).
- Entzeroth, M., Flotow, H., Condron, P. Overview of high-throughput screening. Current Protocols in Pharmacology. Chapter 9, (2009).
- Ferreira, L. G., Dos Santos, R. N., Oliva, G., Andricopulo, A. D. Molecular docking and structure-based drug design strategies. Molecules. 20 (7), 13384-13421 (2015).
- Campbell, S. S., Tobler, I. Animal sleep – a review of sleep duration across phylogeny. Neuroscience and Biobehavioral Reviews. 8 (3), 269-300 (1984).
- Hendricks, J. C., Sehgal, A., Pack, A. I. The need for a simple animal model to understand sleep. Progress in Neurobiology. 61 (4), 339-351 (2000).
- Hendricks, J. C., et al. Rest in Drosophila is a sleep-like state. Neuron. 25 (1), 129-138 (2000).
- Shaw, P. J., Cirelli, C., Greenspan, R. J., Tononi, G. Correlates of sleep and waking in Drosophila melanogaster. Science. 287 (5459), 1834-1837 (2000).
- Ly, S., Pack, A. I., Naidoo, N. The neurobiological basis of sleep: Insights from Drosophila. Neuroscience & Biobehavioral Reviews. 87, 67-86 (2018).
- Jeibmann, A., Paulus, W. Drosophila melanogaster as a model organism of brain diseases. International Journal of Molecular Sciences. 10 (2), 407-440 (2009).
- Morse, D., Sassone-Corsi, P. Time after time: inputs to and outputs from the mammalian circadian oscillators. Trends in Neuroscience. 25 (12), 632-637 (2002).
- De Nobrega, A. K., Lyons, L. C. Drosophila: an emergent model for delineating interactions between the circadian clock and drugs of abuse. Neural Plasticity. 2017, 4723836 (2017).
- Reppert, S. M., Weaver, D. R. Coordination of circadian timing in mammals. Nature. 418 (6901), 935-941 (2002).
- Koudounas, S., Green, E. W., Clancy, D. Reliability and variability of sleep and activity as biomarkers of ageing in Drosophila. Biogerontology. 13 (5), 489-499 (2012).
- Nall, A. H., Sehgal, A. Small-molecule screen in adult Drosophila identifies VMAT as a regulator of sleep. Journal of Neuroscience. 33 (19), 8534-8464 (2013).
- Jin, X., Gu, P., Han, J. Protocol for Drosophila sleep deprivation using single-chip board. STAR Protocols. 2 (4), 100827 (2021).
- Kashyap, A., Singh, P. K., Silakari, O. Counting on fragment based drug design approach for drug discovery. Current Topics in Medicinal Chemistry. 18 (27), 2284-2293 (2018).
- Qi, W., Ding, D., Salvi, R. J. Cytotoxic effects of dimethyl sulphoxide (DMSO) on cochlear organotypic cultures. Hearing Research. 236 (1-2), 52-60 (2008).
- Nishimura, M., Ueda, N., Naito, S. Effects of dimethyl sulfoxide on the gene induction of cytochrome P450 isoforms, UGT-dependent glucuronosyl transferase isoforms, and ABCB1 in primary culture of human hepatocytes. Biological and Pharmaceutical Bulletin. 26 (7), 1052-1056 (2003).
- Solovev, I. A., Shaposhnikov, M. V., Moskalev, A. A. Chronobiotics KL001 and KS15 extend lifespan and modify circadian rhythms of Drosophila melanogaster. Clocks Sleep. 3 (3), 429-441 (2021).
- Cavas, M., Beltran, D., Navarro, J. F. Behavioural effects of dimethyl sulfoxide (DMSO): changes in sleep architecture in rats. Toxicology Letters. 157 (3), 221-232 (2005).
- Pfeiffenberger, C., Lear, B. C., Keegan, K. P., Allada, R. Locomotor activity level monitoring using the Drosophila Activity Monitoring (DAM) System. Cold Spring Harbor Protocols. 2010 (11), 5518 (2010).
- Gilestro, G. F. Video tracking and analysis of sleep in Drosophila melanogaster. Nature Protocols. 7 (5), 995-1007 (2012).
- Branson, K., Robie, A. A., Bender, J., Perona, P., Dickinson, M. H. High-throughput ethomics in large groups of Drosophila. Nature Methods. 6 (6), 451-457 (2009).
- Kabra, M., Robie, A. A., Rivera-Alba, M., Branson, S., Branson, K. JAABA: interactive machine learning for automatic annotation of animal behavior. Nature Methods. 10 (1), 64-67 (2013).
- Donelson, N. C., et al. High-resolution positional tracking for long-term analysis of Drosophila sleep and locomotion using the "tracker" program. Plos One. 7 (5), e37250 (2012).
- Cichewicz, K., Hirsh, J. ShinyR-DAM: a program analyzing Drosophila activity, sleep and circadian rhythms. Communications Biology. 1, 25 (2018).
