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Sciences du comportement

ショウジョウバエによる加齢性睡眠障害のハイスループット低分子薬物スクリーニング(英語)

Published: October 20, 2023
doi:
10.3791/65787
, , , , ,
1School of Life Science and Technology, Key Laboratory of Developmental Genes and Human Disease,Southeast University

Summary

提示されているのは、高齢のショウジョウバエモデルにおける ショウジョウバエ の睡眠行動をモニタリングすることにより、睡眠を改善するためのハイスループット薬物スクリーニングのプロトコルです。

Abstract

睡眠は、健康と全体的な幸福に不可欠な要素であり、睡眠時間の短縮と断片的なパターンを特徴とする睡眠障害を頻繁に経験する高齢者にとって、しばしば課題となります。これらの睡眠障害は、糖尿病、心血管疾患、精神障害など、高齢者のさまざまな病気のリスクの増加とも相関しています。残念ながら、睡眠障害に対する既存の薬は、認知障害や依存症などの重大な副作用と関連しています。そのため、より安全で効果的な睡眠障害治療薬の開発が急務となっています。しかし、現在の薬物スクリーニング法では、コストが高く、実験期間が長いため、依然として制限要因となっています。

このプロトコルは、哺乳類と比較して高度に保存された睡眠調節メカニズムを持つ種である ショウジョウバエのメラノガスターを利用する費用対効果の高いハイスループットスクリーニング方法を記述しており、高齢者の睡眠障害を研究するための理想的なモデルとなっています。老化したハエに様々な微量化合物を投与することで、睡眠障害に対する効果を評価することができます。これらのハエの睡眠行動は、赤外線モニタリングデバイスを使用して記録され、オープンソースのデータパッケージであるSleep and Circadian Analysis MATLAB Program 2020(SCAMP2020)で分析されます。このプロトコルは、睡眠調節のための低コストで再現性のある効率的なスクリーニングアプローチを提供します。ショウジョウバエは、ライフサイクルが短く、飼育コストが低く、取り扱いが容易なため、この方法の優れた被験者として機能します。一例として、試験薬の1つであるレセルピンは、高齢のハエの睡眠時間を促進する能力を実証し、このプロトコルの有効性を強調しています。

Introduction

睡眠は、人間の生存に必要な必須行動の1つであり、急速眼球運動(REM)睡眠と非急速眼球運動(ノンレム)睡眠の2つの主要な状態によって特徴付けられます1。ノンレム睡眠は、N1(覚醒から睡眠への移行)、N2(浅い睡眠)、N3(深い睡眠、徐波睡眠)の3段階からなり、覚醒から深い睡眠への進行を表しています1。睡眠は心身の健康に重要な役割を果たします2.しかし、加齢により、成人の総睡眠時間、睡眠効率、徐波睡眠率、レム睡眠率が低下します3。高齢者は、徐波睡眠に比べて浅い睡眠により多くの時間を費やす傾向があり、夜間の覚醒に敏感になります。覚醒回数が増えると、平均睡眠時間が短くなり、その結果、高齢者の睡眠パターンが断片化され、マウスのHcrtニューロンの過度の興奮と関連している可能性があります4。さらに、加齢に伴う概日リズムのメカニズムの低下は、睡眠時間の早期シフトに寄与します5,6。これらの要因は、身体的疾患、心理的ストレス、環境要因、および薬物使用と組み合わさって、不眠症、レム睡眠行動障害、ナルコレプシー、周期的な脚の動き、むずむず脚症候群、睡眠呼吸障害などの睡眠障害の影響を受けやすくなります7,8。

疫学研究により、睡眠障害は、うつ病10、心血管疾患11、認知症12などの高齢者の慢性疾患9と密接に関連していることが示されています。睡眠障害への対処は、慢性疾患の改善と治療、および高齢者の生活の質の向上において重要な役割を果たします。現在、患者は主にベンゾジアゼピン、非ベンゾジアゼピン、メラトニン受容体作動薬などの薬剤に頼って睡眠の質を高めています13。しかし、ベンゾジアゼピンは、長期使用後に受容体のダウンレギュレーションと依存を引き起こし、中止時に重度の離脱症状を引き起こす可能性があります14,15。非ベンゾジアゼピン系薬剤は、認知症16、骨折17、がん18などのリスクも伴います。一般的に使用されるメラトニン受容体作動薬であるラメルテオンは、睡眠潜伏期間を短縮しますが、睡眠時間を増加させず、広範な初回通過排泄のために肝機能関連の懸念があります19。メラトニン受容体作動薬およびセロトニン受容体拮抗薬であるアゴメラチンは、うつ病関連の不眠症を改善するが、肝障害のリスクももたらす20。そのため、睡眠障害の治療や緩和のために、より安全な薬剤が急務となっています。しかし、分子実験や細胞実験、自動システム、コンピューター解析を組み合わせた現在の薬物スクリーニング戦略は、高価で時間がかかります21。受容体の構造と特性に依存する構造ベースの創薬戦略は、受容体の3次元構造を明確に理解する必要があり、薬物効果の予測能力に欠けています22。

2000年、1984年にキャンベルとトブラーが提唱した睡眠基準に基づいて23、研究者は睡眠24を研究するための単純な動物モデルを確立し、その中には睡眠のような状態を示すショウジョウバエ25,26も含まれていた。ショウジョウバエとヒトの解剖学的違いにもかかわらず、ショウジョウバエの睡眠を調節する多くの神経化学的要素とシグナル伝達経路は哺乳類の睡眠に保存されており、ヒトの神経疾患の研究を容易にしています27,28。ショウジョウバエは、ハエと哺乳類のコア振動子の違いにもかかわらず、概日リズムの研究にも広く使用されています29,30,31。したがって、ショウジョウバエは、睡眠行動の研究や睡眠関連の薬物スクリーニングを行うための貴重なモデル生物として機能します。

この研究は、高齢のハエを使用して睡眠障害を治療するための低分子薬をスクリーニングするための費用対効果の高いシンプルな表現型ベースのアプローチを提案しています。 ショウジョウバエ の睡眠調節は高度に保存されており25、加齢とともに観察される睡眠の減少は、薬物投与によって可逆的である可能性がある。したがって、この睡眠表現型に基づくスクリーニング法は、薬効を直感的に反映することができます。ハエに調査中の薬剤と餌の混合物を与え、ショウ ジョウバエ 活動モニター(DAM)32を使用して睡眠行動を監視および記録し、取得したデータをMATLABのオープンソースSCAMP2020データパッケージを使用して解析します(図1)。統計解析は、統計およびグラフ作成ソフトウェアを使用して実行されます( 材料表を参照)。一例として、睡眠を増加させると報告された小胞モノアミントランスポーターの低分子阻害剤であるレセルピンに関する実験データを提示することにより、このプロトコルの有効性を実証します33。このプロトコルは、加齢に伴う睡眠障害を治療するための薬剤を特定するための貴重なアプローチを提供します。

Protocol

このプロトコルは、ブルーミントンショウジョウバエストックセンター(BDSC_3605、材料表を参照)から30日齢のw1118ハエを使用します。 1.熟成したショウジョウバエの準備 食品の準備50 g/Lのコーンフレーク、110 g/Lの砂糖、5 g/Lの寒天、および25 g/Lの酵母を混合して、標準的なコーンスターチ培地を調製します。コ?…

Representative Results

レセルピンは小胞性モノアミントランスポーター(VMAT)の低分子阻害剤であり、シナプス前小胞へのモノアミンの再取り込みを阻害し、睡眠時間の増加をもたらす33。レセルピンの睡眠促進効果は、30日齢のハエで調べられ、対照群には溶媒ジメチルスルホキシド(DMSO)のみが与えられました。レセルピン群では、高齢のハエはDMSO群と比較して、昼夜ともに有意に増加した睡眠?…

Discussion

記載された方法は、中小規模の睡眠薬を迅速にスクリーニングするのに適している。現在、主流のハイスループット薬物スクリーニング法のほとんどは、生化学的および細胞レベルに基づいています。例えば、受容体の構造および特性は、それに結合することができる特異的リガンドを探索するために検査される22。別のアプローチでは、質量分析による核磁気共鳴(NMR)を用…

Divulgations

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Junhai Han教授の研究室メンバーの議論とコメントに感謝します。この研究は、Y.T.32170970の中国国家自然科学基金会と、江蘇省のZ.C.Z.の「シアニンブループロジェクト」の支援を受けました。

Materials

Ager BIOFROXX 8211KG001
Artificial Climate Box PRANDT PRX-1000A official website:https://www.nbplt17.com/PLTXBS-Products-20643427/
DAM2 Drosophila Activity Monitor TriKineics DAM2 official website:https://www.trikinetics.com/
DAM2system TriKineics version:v3.03 official website:https://www.trikinetics.com/
DAMFileScan TriKineics version:1.0.7.0 official website:https://www.trikinetics.com/
Dimethyl Sulfoxide SIGMA 276855
Drosophila Activity Monitoring Incubator Tritech Research DT2-CIRC-TK official website:https://www.tritechresearch.com/DT2-CIRC-TK.html
Drosophila Bottles Biologix 51-17720 official website:http://biologixgroup.com/goods.php?id=48
Drosophila: w1118 Bloomington Drosophila Stock Center  BDSC_3605
Excel Microsoft version:Excel 2016 official website:https://www.microsoftstore.com.cn/software/office/excel
Glass tubes TriKinetics PPT5x65 official website:https://www.trikinetics.com/
MATLABR2022b MathWorks version:9.13.0.2049777 official website:https://ww2.mathworks.cn/products/matlab.html
Prism GraphPad Version:Prism 8.0.1 official website:https://www.graphpad.com/features
Reserpine MACKLIN R817202-1g
Saccharose SIGMA 1245GR500
SCAMP Vecsey Lab N/A official website:https://academics.skidmore.edu/blogs/cvecsey/
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References

  1. Le Bon, O. Relationships between REM and NREM in the NREM-REM sleep cycle: a review on competing concepts. Sleep Medicine. 70, 6-16 (2020).
  2. Krueger, J. M., Frank, M. G., Wisor, J. P., Roy, S. Sleep function: Toward elucidating an enigma. Sleep Medicine Reviews. 28, 46-54 (2016).
  3. Ohayon, M. M., Carskadon, M. A., Guilleminault, C., Vitiello, M. V. Meta-analysis of quantitative sleep parameters from childhood to old age in healthy individuals: developing normative sleep values across the human lifespan. Sleep. 27 (7), 1255-1273 (2004).
  4. Li, S. B., et al. Hyperexcitable arousal circuits drive sleep instability during aging. Science. 375 (6583), eabh3021 (2022).
  5. Rodriguez, J. C., Dzierzewski, J. M., Alessi, C. A. Sleep problems in the elderly. Medical Clinics of North America. 99 (2), 431-439 (2015).
  6. Gulia, K. K., Kumar, V. M. Sleep disorders in the elderly: a growing challenge. Psychogeriatrics. 18 (3), 155-165 (2018).
  7. Wolkove, N., Elkholy, O., Baltzan, M., Palayew, M. Sleep and aging: 1. Sleep disorders commonly found in older people. Canadian Medical Association Journal. 176 (9), 1299-1304 (2007).
  8. Suzuki, K., Miyamoto, M., Hirata, K. Sleep disorders in the elderly: Diagnosis and management. Journal of General and Family Medicine. 18 (2), 61-71 (2017).
  9. Foley, D. J., et al. Sleep complaints among elderly persons – an epidemiologic-study of 3 communities. Sleep. 18 (6), 425-432 (1995).
  10. Yu, D. S. Insomnia Severity Index: psychometric properties with Chinese community-dwelling older people. Journal of Advanced Nursing. 66 (10), 2350-2359 (2010).
  11. Hoevenaar-Blom, M. P., Spijkerman, A. M., Kromhout, D., van den Berg, J. F., Verschuren, W. M. Sleep duration and sleep quality in relation to 12-year cardiovascular disease incidence: the MORGEN study. Sleep. 34 (11), 1487-1492 (2011).
  12. Rebok, G. W., Rovner, B. W., Folstein, M. F. Sleep disturbance and Alzheimer’s disease: relationship to behavioral problems. Aging (Milano). 3 (2), 193-196 (1991).
  13. Schroeck, J. L., et al. Review of safety and efficacy of sleep medicines in older adults. Clinical Therapeutics. 38 (11), 2340-2372 (2016).
  14. Pericic, D., Strac, D. S., Jembrek, M. J., Vlainic, J. Allosteric uncoupling and up-regulation of benzodiazepine and GABA recognition sites following chronic diazepam treatment of HEK 293 cells stably transfected with alpha1beta2gamma2S subunits of GABA (A) receptors. Naunyn-Schmiedeberg’s Archives of Pharmacology. 375 (3), 177-187 (2007).
  15. Lader, M. History of benzodiazepine dependence. Journal of Substance Abuse Treatment. 8 (1-2), 53-59 (1991).
  16. Chen, P. L., Lee, W. J., Sun, W. Z., Oyang, Y. J., Fuh, J. L. Risk of dementia in patients with insomnia and long-term use of hypnotics: a population-based retrospective cohort study. Plos One. 7 (11), e49113 (2012).
  17. Kang, D. Y., et al. Zolpidem use and risk of fracture in elderly insomnia patients. Journal of Preventive Medicine and Public Health. 45 (4), 219-226 (2012).
  18. Kao, C. H., et al. Relationship of zolpidem and cancer risk: a Taiwanese population-based cohort study. Mayo Clinic Protocols. 87 (5), 430-436 (2012).
  19. Sateia, M. J., Kirby-Long, P., Taylor, J. L. Efficacy and clinical safety of ramelteon: an evidence-based review. Sleep Medicine Reviews. 12 (4), 319-332 (2008).
  20. Friedrich, M. E., et al. Drug-induced liver injury during antidepressant treatment: results of amsp, a drug surveillance program. The International Journal of Neuropsychopharmacology. 19 (4), pyv126 (2016).
  21. Entzeroth, M., Flotow, H., Condron, P. Overview of high-throughput screening. Current Protocols in Pharmacology. Chapter 9, (2009).
  22. Ferreira, L. G., Dos Santos, R. N., Oliva, G., Andricopulo, A. D. Molecular docking and structure-based drug design strategies. Molecules. 20 (7), 13384-13421 (2015).
  23. Campbell, S. S., Tobler, I. Animal sleep – a review of sleep duration across phylogeny. Neuroscience and Biobehavioral Reviews. 8 (3), 269-300 (1984).
  24. Hendricks, J. C., Sehgal, A., Pack, A. I. The need for a simple animal model to understand sleep. Progress in Neurobiology. 61 (4), 339-351 (2000).
  25. Hendricks, J. C., et al. Rest in Drosophila is a sleep-like state. Neuron. 25 (1), 129-138 (2000).
  26. Shaw, P. J., Cirelli, C., Greenspan, R. J., Tononi, G. Correlates of sleep and waking in Drosophila melanogaster. Science. 287 (5459), 1834-1837 (2000).
  27. Ly, S., Pack, A. I., Naidoo, N. The neurobiological basis of sleep: Insights from Drosophila. Neuroscience & Biobehavioral Reviews. 87, 67-86 (2018).
  28. Jeibmann, A., Paulus, W. Drosophila melanogaster as a model organism of brain diseases. International Journal of Molecular Sciences. 10 (2), 407-440 (2009).
  29. Morse, D., Sassone-Corsi, P. Time after time: inputs to and outputs from the mammalian circadian oscillators. Trends in Neuroscience. 25 (12), 632-637 (2002).
  30. De Nobrega, A. K., Lyons, L. C. Drosophila: an emergent model for delineating interactions between the circadian clock and drugs of abuse. Neural Plasticity. 2017, 4723836 (2017).
  31. Reppert, S. M., Weaver, D. R. Coordination of circadian timing in mammals. Nature. 418 (6901), 935-941 (2002).
  32. Koudounas, S., Green, E. W., Clancy, D. Reliability and variability of sleep and activity as biomarkers of ageing in Drosophila. Biogerontology. 13 (5), 489-499 (2012).
  33. Nall, A. H., Sehgal, A. Small-molecule screen in adult Drosophila identifies VMAT as a regulator of sleep. Journal of Neuroscience. 33 (19), 8534-8464 (2013).
  34. Jin, X., Gu, P., Han, J. Protocol for Drosophila sleep deprivation using single-chip board. STAR Protocols. 2 (4), 100827 (2021).
  35. Kashyap, A., Singh, P. K., Silakari, O. Counting on fragment based drug design approach for drug discovery. Current Topics in Medicinal Chemistry. 18 (27), 2284-2293 (2018).
  36. Qi, W., Ding, D., Salvi, R. J. Cytotoxic effects of dimethyl sulphoxide (DMSO) on cochlear organotypic cultures. Hearing Research. 236 (1-2), 52-60 (2008).
  37. Nishimura, M., Ueda, N., Naito, S. Effects of dimethyl sulfoxide on the gene induction of cytochrome P450 isoforms, UGT-dependent glucuronosyl transferase isoforms, and ABCB1 in primary culture of human hepatocytes. Biological and Pharmaceutical Bulletin. 26 (7), 1052-1056 (2003).
  38. Solovev, I. A., Shaposhnikov, M. V., Moskalev, A. A. Chronobiotics KL001 and KS15 extend lifespan and modify circadian rhythms of Drosophila melanogaster. Clocks Sleep. 3 (3), 429-441 (2021).
  39. Cavas, M., Beltran, D., Navarro, J. F. Behavioural effects of dimethyl sulfoxide (DMSO): changes in sleep architecture in rats. Toxicology Letters. 157 (3), 221-232 (2005).
  40. Pfeiffenberger, C., Lear, B. C., Keegan, K. P., Allada, R. Locomotor activity level monitoring using the Drosophila Activity Monitoring (DAM) System. Cold Spring Harbor Protocols. 2010 (11), 5518 (2010).
  41. Gilestro, G. F. Video tracking and analysis of sleep in Drosophila melanogaster. Nature Protocols. 7 (5), 995-1007 (2012).
  42. Branson, K., Robie, A. A., Bender, J., Perona, P., Dickinson, M. H. High-throughput ethomics in large groups of Drosophila. Nature Methods. 6 (6), 451-457 (2009).
  43. Kabra, M., Robie, A. A., Rivera-Alba, M., Branson, S., Branson, K. JAABA: interactive machine learning for automatic annotation of animal behavior. Nature Methods. 10 (1), 64-67 (2013).
  44. Donelson, N. C., et al. High-resolution positional tracking for long-term analysis of Drosophila sleep and locomotion using the "tracker" program. Plos One. 7 (5), e37250 (2012).
  45. Cichewicz, K., Hirsh, J. ShinyR-DAM: a program analyzing Drosophila activity, sleep and circadian rhythms. Communications Biology. 1, 25 (2018).

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Keywords: High-throughput ScreeningDrug DiscoveryStructure-based DesignFragment-based DesignDrosophila MelanogasterSleep DisordersInfrared MonitoringSCAMP2020Cost-effectiveAge-related Sleep Disorders
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Citer Cet Article
Zhang, Z., Wang, Y., Zhao, J., Han, S., Zhang, Z. C., Tian, Y. High-Throughput Small Molecule Drug Screening For Age-Related Sleep Disorders Using Drosophila melanogaster. J. Vis. Exp. (200), e65787, doi:10.3791/65787 (2023).
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