물 샘플 및 조직에서 규조류 DNA 추출
Summary
이 글에서는 수정된 일반 DNA 추출 키트를 사용한 규조류 DNA 추출 프로토콜에 대해 설명합니다.
Abstract
규조류 검사는 법의학 실무에서 시체가 물에 빠졌는지 여부를 결정하고 익사 위치를 추론하는 데 필수적인 보조 수단입니다. 규조류 검사는 환경과 플랑크톤 분야에서도 중요한 연구 내용입니다. 규조류 DNA를 주요 연구 대상으로 하는 규조류 분자 생물학 검사 기술은 규조류 검사의 새로운 방법입니다. 규조류 DNA 추출은 규조류 분자 검사의 기초입니다. 현재 규조류 DNA 추출에 일반적으로 사용되는 키트는 고가이므로 관련 연구 수행 비용이 증가합니다. 우리 연구실은 일반 전혈 유전체 DNA 신속 추출 키트를 개선하여 만족스러운 규조류 DNA 추출 효과를 얻어 관련 연구를 위한 글라스 비드 기반의 경제적이고 저렴한 대안 DNA 추출 솔루션을 제공합니다. 이 프로토콜을 사용하여 추출된 규조류 DNA는 PCR 및 염기서열분석과 같은 많은 다운스트림 응용 분야를 만족시킬 수 있습니다.
Introduction
법의학에서는 물속에서 발견된 시체가 익사했는지 아니면 사망 후 물에 던져졌는지를 판단하는 것이 사건의 적절한 해결을 위해 필수적이다1. 또한 법의학 실무에서 시급히 해결해야 할 어려운 문제 중 하나입니다2. 규조류는 자연 환경(특히 물)에 풍부합니다.3,4. 익사 과정에서 저산소증과 스트레스 반응으로 인해 사람들은 격렬한 호흡 움직임을 보이고 많은 양의 익사 액체를 흡입합니다. 따라서 물 속의 규조류는 익사액과 함께 폐로 들어가고 일부 규조류는 폐포-모세혈관 장벽을 통해 혈액 순환에 들어가 혈류와 함께 내부 장기로 퍼질 수 있습니다 5,6. 폐, 간, 골수와 같은 내부 조직과 장기에서 규조류가 검출되는 것은 사망 전 익사의 강력한 증거입니다 7,8. 현재 법의학 규조류 검사는 주로 형태학적 검사 방법을 기반으로 합니다. 조직의 일련의 사전 소화 후, 소화되지 않은 규조류의 형태학적 정성적 및 정량적 추정이 현미경 하에서 수행됩니다. 이 기간 동안 질산과 같은 위험하고 환경 친화적이지 않은 시약을 사용해야 합니다. 이 프로세스는 시간이 많이 걸리며 연구자는 확실한 분류학 전문 지식과 광범위한 경험을 필요로 합니다. 이 모든 것은 법의학 직원에게 특정 문제를 야기합니다9. 규조류 DNA 검사 기술은 최근 몇 년 동안 개발된 규조류 검사의 새로운 기술입니다 10,11,12. 이 기술은 규조류13,14의 특정 DNA 서열 조성을 분석하여 규조류의 종 식별을 실현합니다. PCR 기술과 시퀀싱 기술은 일반적으로 사용되는 기술적 방법이지만 그 기본은 규조류에서 DNA를 성공적으로 추출하는 것입니다. 그러나 규조류는 다른 유기체와 다른 특별한 구조를 가지고 있어 DNA 추출 기술도 다릅니다.
규조류의 세포벽은 규화도가 높으며 주성분은 이산화규소15,16,17입니다. 규산질 세포벽은 매우 단단하며 DNA를 추출하기 전에 파괴해야 합니다. 통상의 DNA 추출 키트는 규조류18의 규산질 껍질을 파괴할 수 없기 때문에 규조류 DNA의 추출에 직접 사용하기 어려운 경우가 많다. 따라서 규조류의 규산 껍질을 파괴하는 것은 규조류 DNA를 추출할 때 해결해야 할 주요 기술 문제 중 하나입니다.
동시에 법의학 연구 샘플에 포함된 규조류의 수는 물 샘플이든 익사한 시체의 장기 및 조직이든 종종 제한되어 있기 때문에 규조류를 농축할 필요가 있습니다. 농축의 본질은 물질의 분리입니다. 규조류를 함께 모으려고 할 때 다른 재료 구성 요소(간섭 구성 요소)의 함량을 최소화합니다. 법의학 작업에서, 실험실은 규조류 세포를 분리하기 위해 종종 원심분리 또는 막 여과 농축 방법을 사용한다19. 그러나 진공 펌핑 장비가 널리 사용되지 않기 때문에 멤브레인 농축 방법은 일반 1차 법의학 실험실에서 자주 사용되지 않습니다. 따라서, 원심분리 방법은 여전히 법의학 실험실(20)에서 규조류 농축이다.
규조류에서 DNA를 추출하는 것은 현재 법의학 분야에서 주로 사용되며 그 적용에는 상당한 한계가 있습니다. 현재 시중에 법의학에 사용되는 규조류 DNA 추출 키트는 거의 없으며 일반적으로 고가입니다21. 이 기사는 규조류 DNA 추출을 간단하고 편리하며 비용 효율적으로 만드는 개선된 규조류 DNA 추출 방법을 제공합니다. 이는 규조류의 후속 분자 생물학 테스트의 적용을 증가시키고 규조류 테스트를 통해 법의학에서 익사와 관련된 문제를 더 잘 해결할 수 있습니다. 이 방법은 유리 구슬을 첨가하고 소용돌이에 적절한 시간을 설정하여 규조류의 규산 세포벽을 파괴합니다. 이러한 방식으로 단백질 분해 효소 K와 결합 용액은 세포를 빠르게 용해시키고 세포 내의 다양한 효소를 비활성화합니다. 게놈 DNA는 흡착 컬럼의 매트릭스 막에 흡수되고 최종적으로 용출 완충액에 의해 용출됩니다. 이러한 개선된 전혈 유전자 추출 키트는 법의학 검사 재료에서 혈액 키트의 규조류 DNA 추출 효과를 향상시키고, 법의학 실무에서 규조류 DNA 추출 비용을 절감하며, 풀뿌리 법의학 연구에 더 잘 적용될 수 있습니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
규조류 세포는 단단한 규산질 세포벽(17)에 의해 보호되며, 규조류 DNA를 추출하기 위해서는 이 구조를 파괴해야 한다. 일반 키트는 규조류의 규산 껍질을 쉽게 파괴하지 않습니다. 따라서 규조류 DNA21을 성공적으로 추출하는 것은 어렵다. 우리 연구실은 규조류 추출 과정에서 직경과 질량비가 다른 유리 구슬을 추가하여 가장 일반적으로 사용되는 혈액 DNA 추출 ?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 연구는 중국 국립 자연 과학 재단 (82060341,81560304)과 하이난성 학술 혁신 플랫폼 과학 연구 프로젝트 (YSPTZX202134)의 지원을 받았습니다.
Materials
| Binding Buffer | BioTeke | B010006022 | rapidly lysing cells |
| ChemoHS qPCR Mix | Monad | 00007547-120506 | qPCR Mix |
| D2000 DNA ladder | Real-Times(Beijing) Biotechnology | RTM415 | Measure the position of electrophoretic bands |
| D512 | Taihe Biotechnology | TW21109196 | forword primer |
| D978 | Taihe Biotechnology | TW21109197 | reverse primer |
| Elution buffer | BioTeke | B010006022 | A low-salt elution buffer washes off the DNA |
| Glass bead | Yingxu Chemical Machinery(Shanghai) | 70181000 | Special glass beads for dispersing and grinding |
| Import adsorption column | BioTeke | B2008006022 | Adsorption column with silica matrix membrane |
| Inhibitor Removal Buffer | BioTeke | B010006022 | Removal of Inhibitors in DNA Extraction |
| Isopropanol | BioTeke | B010006022 | Precipitate or isolate DNA |
| MIX-30S Mini Mixer | Miulab | MUC881206 | oscillatory action |
| Proteinase K | BioTeke | B010006022 | Inactivation of intracellular nucleases and other proteins |
| Rotor-Gene Q 5plex HRM | Qiagen | R1116175 | real-time fluorescence quantification PCR |
| Speed Micro-Centrifuge | Scilogex | 9013001121 | centrifuge |
| Tanon 3500R Gel Imager | Tanon | 16T5553R-455 | gel imaging |
| Taq Mix Pro | Monad | 00007808-140534 | PCR Mix |
| Thermo Cycler | Zhuhai Hema | VRB020A | ordinary PCR |
| Wash Buffer | BioTeke | B010006022 | Remove impurities such as cell metabolites |
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