Extração de DNA de Diatomáceas de Amostras de Água e Tecidos
Summary
Este artigo descreve um protocolo para extração de DNA de diatomáceas usando um kit de extração de DNA comum modificado.
Abstract
O teste de diatomáceas é um meio auxiliar essencial na prática forense para determinar se o cadáver se afogou na água e inferir o local do afogamento. O teste de diatomáceas também é um importante conteúdo de pesquisa no campo do meio ambiente e do plâncton. A tecnologia de teste de biologia molecular de diatomáceas, que se concentra no DNA de diatomáceas como objeto de pesquisa primário, é um novo método de teste de diatomáceas. A extração de DNA de diatomáceas é a base do teste molecular de diatomáceas. Atualmente, os kits comumente usados para extração de DNA de diatomáceas são caros, o que aumenta o custo de realização de pesquisas relacionadas. Nosso laboratório melhorou o kit geral de extração rápida de DNA genômico de sangue total e obteve um efeito satisfatório de extração de DNA de diatomáceas, fornecendo assim uma solução alternativa econômica e acessível de extração de DNA baseada em esferas de vidro para pesquisas relacionadas. O DNA da diatomácea extraído usando este protocolo poderia satisfazer muitas aplicações a jusante, tais como PCR e sequenciamento.
Introduction
Na prática forense, determinar se um cadáver encontrado na água se afogou ou foi jogado na água após a morte é essencial para a resolução adequada do caso1. É também uma das questões difíceis que precisam ser resolvidas urgentemente na prática forense2. Diatomáceas são abundantes no ambiente natural (especialmente na água)3,4. No processo de afogamento, devido à hipóxia e resposta ao estresse, as pessoas terão movimentos respiratórios intensos e inalarão uma grande quantidade de líquido de afogamento. Assim, as diatomáceas presentes na água entram no pulmão com o líquido de afogamento, e algumas diatomáceas podem entrar na circulação sanguínea pela barreira alvéolo-capilar e se espalhar para órgãos internos com o fluxo sanguíneo 5,6. A detecção de diatomáceas em tecidos internos e órgãos como pulmão, fígado e medula óssea é uma forte evidência de afogamento antes da morte 7,8. Atualmente, o teste forense de diatomáceas baseia-se principalmente em métodos de testes morfológicos. Após uma série de pré-digestão do tecido, as estimativas qualitativas e quantitativas morfológicas das diatomáceas não digeridas são realizadas ao microscópio. Durante este período, é necessário utilizar reagentes perigosos e prejudiciais ao ambiente, como o ácido nítrico. Esse processo é demorado e exige dos pesquisadores sólidos conhecimentos taxonômicos e ampla experiência. Tudo isso traz alguns desafios para a equipe forense9. A tecnologia de teste de DNA de diatomáceas é uma nova tecnologia para testes de diatomáceas desenvolvida nos últimos anos 10,11,12. Esta tecnologia realiza a identificação de espécies de diatomáceas através da análise da composição de sequências específicas de DNA de diatomáceas13,14. A tecnologia de PCR e a tecnologia de sequenciamento são métodos técnicos comumente usados, mas sua base é a extração bem-sucedida de DNA de diatomáceas. No entanto, as diatomáceas têm uma estrutura especial diferente de outros organismos, tornando suas técnicas de extração de DNA também diferentes.
A parede celular das diatomáceas apresenta alto grau de silicificação, e seu principal componente é o dióxido de silício 15,16,17. A parede celular siliciosa é muito dura, e deve ser destruída antes de extrair o DNA. Kits comuns de extração de DNA são muitas vezes difíceis de usar diretamente para a extração de DNA de diatomáceas, porque não podem destruir a casca siliciosa das diatomáceas18. Portanto, destruir a casca siliciosa das diatomáceas é um dos principais problemas técnicos a serem resolvidos na extração do DNA das diatomáceas.
Ao mesmo tempo, como o número de diatomáceas contidas em amostras de pesquisa forense, sejam amostras de água ou órgãos e tecidos de corpos afogados, é muitas vezes limitado, é necessário enriquecer diatomáceas. A essência do enriquecimento é a separação das substâncias. Ao tentar reunir diatomáceas, minimize o conteúdo de outros componentes do material (componentes interferentes). Em trabalhos forenses, os laboratórios frequentemente usam métodos de centrifugação ou enriquecimento por filtração de membrana para separar as células das diatomáceas19. No entanto, como o equipamento de bombeamento a vácuo não é amplamente utilizado, o método de enriquecimento de membrana não é frequentemente usado em laboratórios forenses primários comuns. Assim, o método de centrifugação ainda é comumente enriquecido por diatomáceas em laboratóriosforenses 20.
A extração de DNA de diatomáceas é atualmente usada principalmente na prática forense, e há limitações significativas para sua aplicação. Atualmente, existem poucos kits de extração de DNA de diatomáceas utilizados em ciências forenses no mercado e geralmente são caros21. Este artigo fornece um método melhorado de extração de DNA de diatomáceas, tornando a extração de DNA de diatomáceas simples, conveniente e econômica. Isso aumenta a aplicação de testes subsequentes de biologia molecular de diatomáceas e pode resolver melhor problemas relacionados ao afogamento em medicina legal por meio de testes de diatomáceas. Este método quebra as paredes celulares siliciosas das diatomáceas adicionando contas de vidro e definindo um momento apropriado para o vórtice. Desta forma, a proteinase K e a solução de ligação lisam rapidamente as células e inativam várias enzimas nas células. O DNA genômico é absorvido na membrana da matriz na coluna de adsorção e finalmente eluído pelo tampão de eluição. Esse kit de extração de genes de sangue total melhorado melhora o efeito de extração de DNA de diatomáceas do kit de sangue em materiais de exame forense, reduz o custo da extração de DNA de diatomáceas na prática forense e pode ser melhor aplicado à pesquisa forense de base.
Protocol
Representative Results
Discussion
As células das diatomáceas são protegidas por paredes celulares siliciosas duras17, e essa estrutura deve ser destruída para extrair o DNA das diatomáceas. Os kits comuns não destroem facilmente a casca siliciosa das diatomáceas; portanto, é difícil extrair com sucesso o DNA das diatomáceas21. Nosso laboratório aprimorou o kit de extração de DNA sanguíneo mais comumente usado, adicionando esferas de vidro de diferentes diâmetros e diferentes proporções de m…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho é apoiado pela Fundação Nacional de Ciências Naturais da China (82060341,81560304) e pelo Projeto de Pesquisa Científica da Plataforma de Inovação Acadêmica da Província de Hainan (YSPTZX202134).
Materials
| Binding Buffer | BioTeke | B010006022 | rapidly lysing cells |
| ChemoHS qPCR Mix | Monad | 00007547-120506 | qPCR Mix |
| D2000 DNA ladder | Real-Times(Beijing) Biotechnology | RTM415 | Measure the position of electrophoretic bands |
| D512 | Taihe Biotechnology | TW21109196 | forword primer |
| D978 | Taihe Biotechnology | TW21109197 | reverse primer |
| Elution buffer | BioTeke | B010006022 | A low-salt elution buffer washes off the DNA |
| Glass bead | Yingxu Chemical Machinery(Shanghai) | 70181000 | Special glass beads for dispersing and grinding |
| Import adsorption column | BioTeke | B2008006022 | Adsorption column with silica matrix membrane |
| Inhibitor Removal Buffer | BioTeke | B010006022 | Removal of Inhibitors in DNA Extraction |
| Isopropanol | BioTeke | B010006022 | Precipitate or isolate DNA |
| MIX-30S Mini Mixer | Miulab | MUC881206 | oscillatory action |
| Proteinase K | BioTeke | B010006022 | Inactivation of intracellular nucleases and other proteins |
| Rotor-Gene Q 5plex HRM | Qiagen | R1116175 | real-time fluorescence quantification PCR |
| Speed Micro-Centrifuge | Scilogex | 9013001121 | centrifuge |
| Tanon 3500R Gel Imager | Tanon | 16T5553R-455 | gel imaging |
| Taq Mix Pro | Monad | 00007808-140534 | PCR Mix |
| Thermo Cycler | Zhuhai Hema | VRB020A | ordinary PCR |
| Wash Buffer | BioTeke | B010006022 | Remove impurities such as cell metabolites |
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