Summary
Ici, nous présentons une méthode pour identifier les composés qui modulent le mécanisme ADCC, un mécanisme important de destruction des cellules cancéreuses des anticorps antitumoraux. L’effet cytotoxique des cellules NK est mesuré dans les sphéroïdes des cellules cancéreuses du sein en présence de trastuzumab. L’analyse d’images permet d’identifier les cellules tueuses et cibles vivantes et mortes dans les sphéroïdes.
Abstract
L’immunothérapie à base d’anticorps monoclonaux ciblant les antigènes tumoraux est désormais un pilier du traitement du cancer. L’un des mécanismes d’action cliniquement pertinents des anticorps est la cytotoxicité cellulaire dépendante des anticorps (ADCC), où l’anticorps se lie aux cellules cancéreuses et engage la composante cellulaire du système immunitaire, par exemple les cellules tueuses naturelles (NK), pour tuer les cellules tumorales. L’efficacité de ces thérapies pourrait être améliorée en identifiant des composés adjuvants qui augmentent la sensibilité des cellules cancéreuses ou la puissance des cellules immunitaires. De plus, des interactions médicamenteuses non découvertes chez des patients cancéreux co-médicamentés pour des affections antérieures ou des symptômes associés au cancer peuvent déterminer le succès du traitement par anticorps ; Par conséquent, ces interactions médicamenteuses indésirables doivent être éliminées. Avec ces objectifs à l’esprit, nous avons créé un modèle d’ADCC contre le cancer et décrivons ici un protocole simple pour trouver des médicaments modulateurs de l’ADCC. Étant donné que les modèles 3D tels que les sphéroïdes de cellules cancéreuses sont supérieurs aux cultures 2D pour prédire les réponses in vivo des tumeurs aux thérapies anticancéreuses, les co-cultures sphéroïdes de cellules cancéreuses du sein HER2+ JIMT-1 exprimant l’EGFP et le NK92 sont supérieures. Des lignées cellulaires CD16 ont été mises en place et induites avec du trastuzumab, un anticorps monoclonal cliniquement approuvé contre le cancer du sein HER2 positif. Les sphéroïdes JIMT-1 ont été autorisés à se former dans des plaques à fond en U à 96 puits. Le jour 3, des cellules NK et du trastuzumab ont été ajoutés. Les sphéroïdes ont ensuite été colorés avec de l’annexine V-Alexa 647 pour mesurer la mort cellulaire apoptotique, qui a été quantifiée dans la zone périphérique des sphéroïdes à l’aide d’un microscope automatisé. L’applicabilité de notre test pour identifier les molécules modulatrices de l’ADCC est démontrée en montrant que le sunitinib, un inhibiteur du récepteur tyrosine kinase approuvé par la FDA contre le cancer métastatique, abolit presque complètement l’ADCC. La génération des sphéroïdes et les pipelines d’acquisition et d’analyse d’images sont compatibles avec le criblage à haut débit des composés modulateurs de l’ADCC dans les sphéroïdes des cellules cancéreuses.
Introduction
Les sphéroïdes tumoraux multicellulaires (SCTM) sont des modèles tridimensionnels (3D) largement utilisés qui se forment en raison de la tendance des cellules adhérentes à s’agréger et représentent un outil important pour obtenir un aperçu mécanistique de la biologie des cellules cancéreuses. Ils peuvent être générés à partir d’un large éventail de types de cellules par de nombreuses techniques, telles que les cultures 3D à base de liquide et d’échafaudage1. Leur principal avantage par rapport aux modèles 2D monocouches est qu’ils récapitulent les principales caractéristiques des tumeurs in vivo , à savoir l’organisation structurale et l’hypoxie, en imitant le comportement biologique des cellules tumorales, en particulier les mécanismes conduisant à l’échappement thérapeutique et à la résistance auxmédicaments2. Ainsi, étant donné que les SCTM peuvent améliorer la prévisibilité de la toxicité et de la sensibilité aux médicaments, ils sont largement utilisés pour étudier les cancers en 3D et pourraient améliorer la mise au point de médicaments efficaces pour différents types de cancer3.
Pour étudier n’importe quelle maladie, il y a un besoin critique de modèles pertinents et pratiques. La mise en place de modèles pour les études d’immunologie du cancer est difficile car le système immunitaire est constitué de plusieurs types de cellules. Chaque type de cellule possède plusieurs sous-types et un large spectre d’états d’activation. Ces différents types de cellules immunitaires interagissent avec les cellules cancéreuses et d’autres composants tumoraux, influençant finalement l’issue de la maladie. Les méthodes de culture cellulaire in vitro 2D ne parviennent pas à récapituler ces interactions cellulaires complexes, car elles manquent de traduisibilité et sont incapables de prédire l’action d’un médicament au niveau du système (par exemple, dans les tissus)4,5. De plus, les modèles murins présentent également de graves limitations en raison des différences fondamentales entre les systèmes immunitaires humain et murin. Les systèmes de culture 3D peuvent donc combler les lacunes actuelles des modèles disponibles, en fournissant une méthode alternative et en améliorant notre compréhension de l’immunologie du cancer6. Plus précisément, les modèles sphéroïdes pourraient être utilisés pour tester les immunothérapies, principalement pour évaluer l’efficacité du criblage de médicaments et des anticorps thérapeutiques pour améliorer l’infiltration des cellules immunitaires et les effets antitumoraux contre les cibles sphéroïdes7. De plus, le potentiel des TCM, composés de cellules dans différents états métaboliques et prolifératifs, pour étudier les interactions entre les cellules du stroma (par exemple, les lymphocytes, les macrophages, les fibroblastes) et les cellules cancéreuses et pour le développement de nouvelles stratégies anticancéreuses a été amplement démontré8. Il est donc essentiel de corroborer les plateformes prédictives et précises afin de stimuler le processus de dépistage des médicaments, en tenant compte de la physiopathologie du microenvironnement tumoral.
Le cancer du sein (BC) est le cancer le plus fréquemment diagnostiqué chez la femme dans le monde. La classification clinique de cette maladie hétérogène est basée sur la présence de récepteurs transmembranaires, par exemple les récepteurs de l’œstrogène (RE) et de la progestérone (PR) (collectivement appelés récepteurs hormonaux, HR), ainsi que sur la surexpression ou l’amplification de la protéine/oncogène du récepteur 2 du facteur de croissance épidermique humain (HER2). Sur la base de l’expression immunohistochimique de ces récepteurs, quatre sous-types sont communément reconnus : le cancer du sein luminal A (HR+/HER2-), le luminal B (HR+/HER2+), le cancer du sein HER2-positif (HR-/HER2+) et le cancer du sein triple négatif (HR-/HER2-). Le groupe HER2+ constitue 10 à 15 % des cas de BC et se caractérise par une expression élevée de HER2 en absence de RE et de PR, un pronostic plus sombre que les tumeurs luminales et nécessitant des médicaments spécifiques dirigés contre la protéine HER2/neu9.
Le développement de la BC est un processus en plusieurs étapes, et un diagnostic précoce est essentiel pour un traitement réussi de la maladie10. Cependant, malgré l’émergence récente d’options de traitement personnalisées de la Colombie-Britannique (p. ex., thérapies par anticorps endocriniens et anti-HER2), la Colombie-Britannique continue de poser des défis aux oncologues. Tout comme la chirurgie, la chimiothérapie et la radiothérapie, ces thérapies personnalisées peuvent également avoir des effets indésirables graves et les patients peuvent développer une résistance à ces agents, ce qui en fait un défi à long terme pour déterminer la meilleure stratégie11,12. Par conséquent, une meilleure compréhension de l’interaction entre la tumeur et son microenvironnement est essentielle et devrait fournir de nouvelles orientations pour le développement de nouveaux traitements qui tiennent compte des spécificités des différents sous-types de BC13. Une nouvelle vague d’immunothérapies, telles que les conjugués anticorps-médicaments, les thérapies adoptives à base de lymphocytes T, les vaccins et les nouveaux anticorps monoclonaux (mAb) dirigés contre HER2, sont à l’étude dans une large population de patients atteints de tumeurs exprimant HER214.
Le trastuzumab, par exemple, représente une modalité de traitement efficace pour HER2+ BC. Dans le cadre de son mode d’action, le trastuzumab intervient dans les activités dépendantes des récepteurs gamma cristallisables (FcγR) par fragment. Les FcγR se distinguent par leur affinité pour le fragment Fc et la réponse immunitaire qu’ils initient. L’activation de FcγRIIIa (CD16A) sur les cellules tueuses naturelles (NK) est cruciale pour la médiation de la cytotoxicité cellulaire dépendante des anticorps (ADCC), tandis que le déclenchement de FcγRIIa (CD32A) et FcγRIIIa sur les macrophages induit une phagocytose cellulaire dépendante des anticorps (ADCP)15. Des études sur des modèles animaux ont montré que les souris dépourvues de récepteurs FcγRI (CD64) et FcγRIII (CD16) étaient incapables d’initier des réponses immunitaires protectrices contre les antigènes spécifiques de la tumeur, révélant que l’ADCC est probablement un mécanisme d’action majeur pour le mAb Trastuzumab16.
Étant donné que les cellules NK ont recours aux Abs liés aux cellules tumorales pour tuer les cellules cancéreuses par ADCC, l’expression des récepteurs Fc est essentielle pour un traitement efficace avec le trastuzumab17 (Figure 1). De plus, leur action est efficacement équilibrée par une stimulation des récepteurs activateurs et inhibiteurs, par exemple, les récepteurs de type immunoglobuline des cellules tueuses (KIR)18.
Graphique 1. Mécanisme de l’ADCC dans le cadre d’une réponse antitumorale. Le récepteur Fcγ d’une cellule tueuse naturelle (NK) reconnaît la région Fc d’un anticorps, qui s’était auparavant lié à un antigène de surface sur une cellule cancéreuse. Cette synapse immunologique conduit à la dégranulation de la cellule NK qui libère des médiateurs cytotoxiques tels que les granzymes et la perforine. Ces molécules contribuent à la formation de pores dans la membrane cellulaire et activent les voies apoptotiques provoquant la mort cellulaire programmée de la cellule cible (image créée avec Biorender.com). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Le développement de l’immunothérapie pour HER2+ BC représente un domaine en pleine évolution. Dans ce cas, il faut tenir compte des interactions entre les différents composants du système immunitaire. De plus, des publications antérieures ont largement testé des thérapies combinées impliquant tous les types de thérapies traditionnelles, immunitaires ou cellulaires afin d’identifier des combinaisons synergiques19.
Plusieurs modèles 3D de HER2+ BC ont déjà été utilisés pour la découverte de médicaments. Par exemple, Balalaeva et al. ont utilisé des sphéroïdes SKBR-3 surexprimant HER2 pour évaluer la cytotoxicité de l’immunotoxine 4D5scFv-PE4020 ciblant HER2. Dans une autre étude, un système de culture HER2+ BC 3D à base de Matrigel a été établi pour mesurer la croissance cellulaire en réponse au trastuzumab et aux agents endocriniens21. Ces études soulignent l’importance des modèles sphéroïdes tumoraux de cellules cancéreuses surexprimant HER2 dans la représentation d’une stratégie efficace pour améliorer cliniquement les réponses thérapeutiques22.
Notre groupe a précédemment identifié Sunitinib, un inhibiteur multiciblé de la tyrosine kinase, comme un inhibiteur de l’ADCC dépendant du trastuzumab dans les cellules JIMT-1 HER2+ BC dans un test de culture 2D. L’étude a révélé que le sunitinib induit l’autophagie et altère la fonction de destruction des cellules NK, régulant à la baisse l’expression de HER2 et améliorant la fixation de surface des cellules JIMT-117.
Ici, nous avons établi un nouveau modèle 3D d’ADCC sphéroïde (cellules cancéreuses NK.92.CD16+Trastuzumab+JIMT-1-EGFP) à utiliser pour des applications de criblage à haut débit et, afin de valider les résultats mentionnés ci-dessus, le sunitinib a été utilisé comme composé modèle. Tout d’abord, nous avons généré de l’EGFP exprimant les cellules JIMT-117 et cultivé des sphéroïdes à partir de ces cellules. L’ADCC a été induit par les cellules NK en association avec le trastuzumab, et les sphéroïdes ont été maintenus en culture en présence ou en l’absence de composés d’essai pendant 24 h (Figure 2). La quantification de l’ADCC est basée sur la détection de la mort apoptotique des cellules cancéreuses (coloration à l’annexine V) à l’aide d’un système d’analyse à haut contenu.
Graphique 2. ADCC dans un système de co-culture sphéroïde 3D. Nos paramètres expérimentaux sont basés sur un système sphéroïde 3D qui permet de modéliser plus précisément le microenvironnement in vivo par rapport aux modèles 2D. Les cellules cancéreuses du sein JIMT-1 EGFP ont été ensemencées sur un fond répulsif concave pour former un amas cellulaire de forme ronde, appelé sphéroïde. L’ADCC a ensuite été initié par l’ajout de NK92. cellules tueuses naturelles CD16 (rapport E :T = 20 :1) et un anticorps monoclonal anti-HER2, le trastuzumab. Le modèle expérimental s’est avéré efficace et facilement applicable pour l’identification des composés d’essai modifiant l’ADCC (image créée avec Biorender.com). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Nous avons démontré que l’acquisition de données de cette manière peut se faire en temps réel et qu’elle est statistiquement robuste pour une utilisation dans le criblage à haut contenu dans la découverte de médicaments anticancéreux. Il est important de noter que ce modèle permet une validation étendue d’un ensemble plus large de composés et qu’il peut être appliqué à plusieurs essais d’intérêt.
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Protocol
1. Mise en place du modèle sphéroïde de protéine fluorescente améliorée par JIMT-1 (EGFP)
- Pour former un fond acellulaire en forme de U, enduisez la plaque à 96 puits d’une solution d’agarose-PBS à 0,5 % (30 μL/puits). Incubez l’assiette à température ambiante pendant environ 30 à 45 minutes.
- Laver les cellules JIMT-1-EGFP deux fois avec 2 mL de PBS stérile (la génération de la lignée cellulaire JIMT1-EGFP a été rapportée dans une publication précédente17). Utiliser des flacons de culture tissulaire T25 et un milieu JIMT-1 (milieu DMEM/F-12 complété par 20 % de sérum de veau fœtal (FBS), 0,3 U/mL d’insuline (100 UI/mL, Humulin R) et 1 % de pénicilline-streptomycine) pour la culture cellulaire.
- Ajouter 2 mL de trypsine-EDTA dans le flacon et l’incuber pendant 10 min dans un incubateur de CO2 .
- Appuyez sur la fiole pour vérifier si les cellules JIMT-1 se sont détachées après le temps d’incubation.
- Utilisez 2 mL de milieu JIMT-1 pour arrêter la digestion et recueillir la suspension cellulaire dans un tube de 15 mL.
- Comptez les cellules dans une chambre de Bürker avec 0,4 % de bleu de trypan (80 μL de colorant + 20 μL de suspension cellulaire) et ajustez le nombre de cellules à 20 000 cellules/mL.
- Pipeter 100 μL de la suspension cellulaire (2000 cellules/puits) dans chaque puits de la plaque à 96 puits (pré-enrobée d’une solution d’agarose-PBS à 0,5 %, comme indiqué au point 1.1).
- Laisser les cellules s’agglutiner pendant une période d’incubation de 3 jours à 37 °C dans un incubateur de CO2 .
- Vérifiez régulièrement la taille et la forme des sphéroïdes à l’aide d’un microscope inversé.
2. Revêtement de la plaque HCS
REMARQUE : Pour empêcher la fixation des sphéroïdes JIMT-1-EGFP à la surface du verre de la plaque, il est crucial de recouvrir la plaque de criblage à haut contenu (HCS) (sinon l’analyse à haute teneur ne serait pas possible).
- Le jour 3 après l’induction des sphéroïdes, enduire la plaque de criblage à haute teneur en 96 puits de Pluronic-F127 (0,5 % dans le DMSO, 50 μL/puits) et incuber la plaque pendant 45 min à température ambiante.
- Aspirer la solution de revêtement et laver les puits deux fois avec un milieu libre de sérum DMEM/F-12 (100 μL/puits).
3. Transfert des sphéroïdes sur la plaque HCS
- À l’aide d’une pipette de 1 ml, transférer les sphéroïdes en trois exemplaires dans la plaque HCS à 96 puits à fond de verre.
4. Prétraitement des sphéroïdes JIMT-1 EGFP avec des composés d’essai
- Ajouter le composé d’essai (p. ex., le sunitinib dilué dans du DMSO à une concentration de 40 μM) en pipetant 10 μL/puits et ajouter 10 μL de milieu JIMT-1 frais dans les puits témoins (CTL).
- Incuber la plaque pendant 1 h dans un incubateur de CO2 à 37 °C.
5. Induction de l’ADCC par l’ajout des cellules effectrices
NOTA : Les cellules CD16.176V.NK92 (ci-après dénommées cellules NK) ont été cultivées dans du α-MEM additionné de 20 % de FBS, 1 % de MEM-NEAA, 1 % de Na-pyruvate, 1 % de glutamine, 1 % de pénicilline-streptomycine et 100 UI/mL d’IL-2.
- Prélever les cellules NK dans le flacon dans un tube de 15 ml. Comptez les cellules avec du bleu de trypan (80 μL du colorant + 20 μL de la suspension cellulaire) et ajustez la densité cellulaire à un rapport effecteur/cible (E :T) de 20 :1 (40 000 cellules NK/puits).
- Colorer les cellules NK avec 10 μM Cell Tracker Blue (CTB, 1 μL dans 1 mL de milieu α-MEM NK) et les placer dans un incubateur de CO2 à 37 °C pendant 1 h.
- Centrifuger les cellules NK à 150 x g pendant 3 min à température ambiante deux fois pour laver l’excédent de colorant avec 1 mL de milieu α-MEM.
- Remettre en suspension la pastille de cellules NK dans 1 mL de milieu JIMT-1 frais.
- Ajouter les cellules NK colorées ainsi que l’anticorps anti-HER2 (Ab) (trastuzumab, dissous dans du H2O distillé stérile) aux sphéroïdes JIMT-1 cibles en pipetant 55 μL/puits de cellules NK colorées par CTB et 55 μL/puits de 10 μg/mL Ab dans le milieu JIMT-1 (le volume total de traitement ajouté pour l’ADCC est de 110 μL/puits et la concentration finale de Sunitinib est de 20 μM).
NOTE : Pour le choix de la concentration Ab et du rapport E :T, nous nous sommes appuyés sur notre publication précédente17. Des expériences préliminaires ont été réalisées avec différents rapports E :T et concentrations de trastuzumab afin d’évaluer lequel était le plus efficace pour induire l’ADCC dans les sphéroïdes (figure supplémentaire S1). - Ajouter 110 μL/puits de milieu JIMT-1 frais dans les puits témoins (CTL).
- Incuber la plaque pendant 24 h dans un incubateur de CO2 à 37 °C.
NOTE : Comme les cellules NK92 sont connues pour exercer des fonctions cytotoxiques non spécifiques, pour le contrôle, utiliser des cellules JIMT-1 co-incubées avec des cellules NK seules et avec un témoin isotype ou un F(ab')2 Ab. Dans ce cas, le F(ab')2-trastuzumab (TR-F(ab')2) a été utilisé comme CTL négatif. Le fragment TR-F(ab')2 a été préparé comme indiqué par Tóth et al.19 et ajouté dans le même volume que le trastuzumab avec les cellules NK comme décrit en 5.5. La concentration a été ajustée à 6,6 μg/mL, ce qui correspond à une concentration équimolaire avec le trastuzumab23.
6. Coloration des sphéroïdes par l’annexine V-647
- Pour mesurer la mort cellulaire apoptotique, colorer les sphéroïdes avec le conjugué Annexin V-Alexa Fluor 647 pendant 1 h dans un milieu JIMT-1 (1 :100) en pipetant 50 μL/puits.
7. Imagerie
REMARQUE : La plaque est imagée 24 h après l’ajout des cellules effectrices NK aux cellules cibles. Pour l’imagerie, un analyseur à haut contenu et un logiciel d’analyse d’images sont utilisés.
- Sélectionnez le type de microplaque dans la liste des plaques à l’aide de l’option Type de plaque . Utilisez une plaque de criblage à haut contenu (HCS) à 96 puits.
- Sélectionnez l’autofocus à deux pics car le test est effectué sur des plaques avec un objectif 10x avec une ouverture numérique (NA) de 0,3, en utilisant les options Autofocus et Objectif , respectivement. Choisissez le mode confocal avec l’option Mode opt. et appliquez Binning 2 à l’aide de l’option Binning .
- Pour l’imagerie des sphéroïdes, sélectionnez les canaux appropriés à l’aide de l’option Sélection des canaux . Pour détecter les cellules JIMT-1 transduites par EGFP, choisissez EGFP (temps d’intégration 200 ms, puissance laser 50%, hauteur d’empilement 2,0 μm ; ex : 488 nm em : 500-550 nm), et pour détecter les cellules apoptotiques, utilisez Alexa 647 (temps d’intégration 100 ms, puissance laser 50%, hauteur de pile 10,0 μm ; ex : 640 nm em : 650-760 nm). Pour visualiser les cellules NK au sein des sphéroïdes, choisissez le canal suivant : DAPI (temps d’intégration 100 ms, puissance laser 50%, hauteur d’empilement 2,0 μm ; ex : 405 nm em : 435-480 nm).
- Dans l’option Sélection de la mise en page , sélectionnez les empilements Z, car les cellules des sphéroïdes ont tendance à se trouver sur des plans focaux différents du microscope. 10 plans (avec une distance de 10 μm) suffisent pour couvrir toute la région sphéroïdale. Définissez les valeurs du premier plan et du dernier plan sur 0 μm et 90 μm, respectivement.
REMARQUE : Avant de commencer la mesure, des échantillons d’images peuvent être pris avec la fonction d’instantané afin de vérifier les paramètres corrects. - Définissez le nombre de puits et de champs pour l’imagerie à l’aide de l’option Définir la mise en page .
8. Analyse à haut contenu (HCA)
REMARQUE : Analysez les images à l’aide du logiciel Harmony ou exportez les images à des fins d’analyse à l’aide d’un logiciel tiers de votre choix. Pour l’analyse de l’efficacité de l’ADCC, l’intensité de fluorescence de l’annexine V 647 est mesurée. Les cellules cibles tuées par l’ADCC apparaissent dans la zone périphérique des sphéroïdes. Par conséquent, les cellules positives de l’annexine V sont mesurées dans cet « anneau » sphéroïde. Afin de valider cette méthode, des analyses ont été effectuées avec différents paramètres afin d’évaluer lequel était le plus fiable et produisait les meilleurs résultats (figure supplémentaire S2). Un puits ADCC est montré dans la vidéo afin de démontrer étape par étape le processus d’analyse d’image.
- Identifiez les sphéroïdes par fluorescence EGFP des cellules JIMT-1 à l’aide de l’option Rechercher des régions de texture et filtrez-les par taille (> 25 000 μm2).
- Supprimez les objets de bordure à l’aide de l’option Sélectionner une population .
- Étant donné que les cellules positives à l’annexine V (apoptotiques) apparaissent à la périphérie des sphéroïdes, mesurez l’intensité de l’annexine dans cet « anneau » apoptotique, sélectionné par l’option Sélectionner une région (bordure extérieure -90 %) pour déterminer la mort cellulaire apoptotique.
- Exprimez les valeurs d’intensité de l’annexe V en tant qu’intensité moyenne.
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Representative Results
Des cellules exprimant l’EGFP JIMT-1 ont été générées et des sphéroïdes ont été cultivés à partir de ces cellules. Le sunitinib a été utilisé comme composé d’essai, car il a déjà été démontré qu’il influençait l’évolution de l’ADCC17. Les sphéroïdes ont été autorisés à s’agglutiner pendant 72 h. Au jour 3, 10 μg/mL de trastuzumab (ou 6,6 μg/mL de TR-F(ab')219) et des cellules NK (20 :1) ont été ajoutés aux sphéroïdes en présence ou en l’absence de 20 μM de Sunitinib (1 h de prétraitement), pendant une durée totale de 24 h. JIMT-1 seul et JIMT-1 co-incubé avec des cellules NK (20 :1) ont été utilisés comme CTL. Les sphéroïdes ont été colorés avec de l’annexine V 647 pendant 1 h pour détecter la mort cellulaire apoptotique et ont ensuite été imagés à l’aide d’un analyseur à haut contenu.
Comme l’indique la coloration à l’annexine V, l’ajout de cellules NK avec le trastuzumab aux cellules JIMT-1 a provoqué la mort cellulaire dans les sphéroïdes tumoraux. Des cellules positives à l’annexine (apoptotiques) ont émergé dans la zone périphérique des sphéroïdes, comme le montre la figure 3A. D’autre part, l’ajout de cellules NK seul n’a pas entraîné l’apoptose des cellules tumorales. Pour faire la distinction entre la capacité du trastuzumab à recruter de l’ADCC et son effet biologique direct, le TR-F(ab')2 dépourvu de capacité fonctionnelle de liaison au FcR a été utilisé comme témoin négatif du trastuzumab. Étant donné que le TR-F(ab')2 s’est avéré inefficace dans ce modèle (Figure 3B), l’effet est susceptible d’être médié par l’ADCC. De plus, le prétraitement par le sunitinib a réduit la coloration de l’annexine V dans les sphéroïdes, confirmant la résistance à l’ADCC induite par le sunitinib et révélant la prévention de la mort cellulaire apoptotique dans les sphéroïdes JIMT-1 co-incubés avec des cellules NK et du trastuzumab.
Graphique 3. Détection de composés effecteurs ADCC dans un modèle sphéroïde 3D. Des sphéroïdes tumoraux ont été générés avec des cellules JIMT-1-EGFP. Après un temps d’incubation de 3 jours, les sphéroïdes ont été transférés sur une plaque HCS, préalablement recouverte de Pluronic F-127 pour empêcher la fixation des cellules. Le lendemain, 10 μg/mL de trastuzumab (TR) (ou 6,6 μg/mL de TR-F(ab')2 sous forme de CTL négatif) et NK92. Des cellules CD16 (pré-colorées avec Cell Tracker Blue) ont été ajoutées aux puits (rapport E :T de 20 :1), en l’absence ou en présence de 20 μM de Sunitinib (SUN). Les sphéroïdes JIMT-1 seuls et les sphéroïdes JIMT-1 co-incubés avec des cellules NK (20 :1) ont été utilisés comme CTL. (A) Après un temps d’incubation de 24 h, l’annexine V 647 (couleur rouge) a été utilisée pour colorer les sphéroïdes pendant 1 h afin de visualiser les cellules apoptotiques. (B) Des images de 3 sphéroïdes/condition ont été prises et analysées pour l’intensité de fluorescence de l’annexine V 647 dans la zone périphérique des sphéroïdes (région de l’anneau). L’histogramme montre 4 expériences indépendantes (moyennes±MEB). Les données ont été analysées à l’aide du test de Kruskal-Wallis suivi du test post-hoc de Dunn (*p < 0,05, #p < 0,05, ns : non significatif). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Ces données confirment que le sunitinib inhibe l’ADCC. On s’attend à ce que les composés améliorant l’ADCC soient identifiés de la même manière. En résumé, notre test HCS peut convenir à l’identification de composés affectant l’ADCC.
Figure supplémentaire S1. Optimisation du rapport E :T et de la concentration en trastuzumab. Des cellules JIMT-1-EGFP ont été utilisées pour générer des sphéroïdes. Le jour 3, les sphéroïdes ont été transférés sur une plaque HCS et des cellules NK ont été ajoutées à différents rapports E :T (20 :1, 40 :1 et 60 :1) avec 10, 20 et 50 μg/mL de trastuzumab (TR) pour voir quel était le traitement le plus efficace qui pourrait induire la mort cellulaire dans les sphéroïdes. Le témoin (JIMT-1-EGFP) a été traité avec des milieux de culture cellulaire JIMT-1. (A) Après 24 h, les cellules ont été colorées avec de l’annexine V 647 (couleur rouge) pendant 1 h et la mort cellulaire apoptotique a été mesurée avec du HCA. Les histogrammes montrent 3 expériences indépendantes (moyennes±MEB). Les colonnes représentent l’intensité de l’annexine V 647 autour des sphéroïdes JIMT-1. (B) Des images de 3 sphéroïdes/condition ont été analysées pour l’intensité de l’annexine V 647 de la région de l’anneau. Les données ont été analysées à l’aide d’une ANOVA à un facteur suivie du test post-hoc de Tukey (*p < 0,05, **p < 0,01, ns : non significatif). Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.
Figure supplémentaire S2. Évaluation de l’apoptose des cellules JIMT-1 dans les sphéroïdes. Des cellules JIMT-1-EGFP ont été utilisées pour générer des sphéroïdes. Le jour 3, les sphéroïdes ont été transférés sur une plaque HCS et ont été prétraités avec 20 μM de sunitinib (SUN) pendant 1 h, puis des cellules NK ont été ajoutées à un rapport E :T de 20 :1 avec 10 μg/mL de trastuzumab. Après 24 h, les cellules ont été colorées avec de l’annexine V 647 pendant 1 h et la mort cellulaire apoptotique a été mesurée avec de l’HCA. Des images de 3 sphéroïdes/condition ont été analysées pour l’intensité de l’annexine V 647 (contrôle : JIMT-1-EGFP, ADCC : 20 :1 cellules NK + 10 μg/mL de trastuzumab, ADCC+SUN : 20 μM Sunitinib + 20 :1 cellules NK + 10 μg/mL de trastuzumab). Les colonnes représentent l’intensité de l’annexine V 647 autour des sphéroïdes JIMT-1 (anneau) (A), dans l’ensemble du sphéroïde (B) et dans l’ensemble du puits (C). Les histogrammes montrent 3 expériences indépendantes (moyennes±MEB). Les données ont été analysées à l’aide d’une ANOVA à un facteur suivie du test post-hoc de Tukey (*p < 0,05, **p < 0,01, ns : non significatif). Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.
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Discussion
Malgré des améliorations significatives dans le traitement de la Colombie-Britannique au cours des dernières décennies, les patients développent encore régulièrement une résistance aux médicaments ou éprouvent des effets secondaires négatifs24. La morbidité et la mortalité élevées liées à la BC exigent une recherche continue sur les mécanismes moléculaires sous-jacents, tout comme des plateformes de criblage robustes pour identifier de nouvelles molécules exploitables pour le développement thérapeutique25. Ces stratégies nécessitent des tests translationnels basés sur la culture cellulaire. Les systèmes de culture tumorale 3D, tels que les sphéroïdes et les organoïdes tumoraux, sont récemment apparus comme des modèles peu coûteux et faciles à mettre en œuvre qui représentent des aspects clés de la physiopathologie tumorale plus étroitement que les cultures monocouches conventionnelles. L’une de ces caractéristiques est l’interaction spatialement coordonnée entre diverses cellules immunitaires associées à la tumeur et les cellules cancéreuses. Cela fait des modèles de co-culture 3D des outils supérieurs pour le criblage de médicaments axés sur les modulateurs agissant sur les cellules immunitaires pour traiter les tumeurs malignes26.
Dans ce travail, nous avons introduit un nouveau modèle sphéroïde pour l’ADCC dépendant du trastuzumab médié par les cellules NK contre les cellules de carcinome mammaire JIMT-1 et décrit un flux de travail d’imagerie et d’analyse automatisé pour l’évaluation de la destruction des cellules cancéreuses médiée par les cellules NK. La procédure a été mise en œuvre pour un imageur à haut contenu et un logiciel d’analyse d’images permettant de surveiller la capacité des cellules NK à induire l’apoptose des cellules cancéreuses. L’inhibiteur multicible de la tyrosine kinase Sunitinib en tant que composé induisant une résistance à l’ADCC dépendant du trastuzumab dans les cellules JIMT-1 dans les tests de culture cellulaire 2D a déjà été identifié. Le sunitinib altère la fonction de destruction des cellules NK et induit l’autophagie, la régulation négative de l’expression de HER2 et améliore l’adhérence des cellules JIMT-117. Afin de valider notre pipeline d’analyse sphéroïde pour l’identification des composés, nous avons testé le sunitinib en tant que composé modèle et nous montrons qu’il peut entraver considérablement la capacité des cellules NK à tuer les sphéroïdes des cellules cancéreuses en reproduisant l’effet qu’il a démontré en monocouche.
Notre méthode est simple, comprenant la croissance de sphéroïdes dans des plaques de culture tissulaire à 96 puits recouvertes d’agarose, un transfert unique des sphéroïdes formés dans une microplaque à fond de verre adaptée aux applications HCS et HCA, l’ajout de composés d’essai et les cellules NK colorées séparément activées pour tuer par l’administration de Trastuzumab, une coloration de la mort cellulaire en une seule étape et l’analyse microscopique. Aucune manipulation sévère n’est appliquée aux puits après le début de la co-culture des deux types cellulaires et du traitement médicamenteux pour éviter de compromettre l’intégrité des sphéroïdes. Le test ne prend que 4 jours à réaliser. Le revêtement du fond des plaques de culture tissulaire à 96 puits avec 1% d’agarose à faible point de fusion dans le cadre de la procédure est une alternative peu coûteuse à l’utilisation de plaques de fixation ultra-basses afin d’empêcher les cellules JIMT-1 d’adhérer à la surface de la plaque et de favoriser l’organisation spontanée des cellules tumorales en sphéroïdes. Étant donné qu’il n’est pas possible de capturer l’image à travers le coussin d’agarose et la surface en plastique en forme de U, les sphéroïdes devaient être transférés dans la plaque d’imagerie. La passivation de la surface vitrée de la plaque HCS avec le tensioactif bio-inerte, Pluronic-F127, avant le transfert sphéroïde, a été cruciale. Sans cette étape, les sphéroïdes se répandent au fond des puits, ce qui rend l’imagerie et l’analyse difficiles.
Une lignée de cellules tumorales humaines exprimant de manière stable l’EGFP a été utilisée pour former des sphéroïdes17. Le marqueur génétiquement codé offre une fluorescence soutenue tout au long du protocole au lieu de colorer les cellules. L’analyse non supervisée de la texture du signal EGFP fournit la base pour reconnaître le noyau compact des sphéroïdes, qui comprend l’ensemble du sphéroïde sans induction de mort cellulaire. Lorsque des cellules NK ont été ajoutées et que l’ADCC a été induit, la désintégration marquée des contours a parfois posé un défi à l’algorithme d’analyse d’images pour délimiter le contour du sphéroïde. Étant donné que les cellules positives à l’annexine V se trouvaient principalement à la périphérie des sphéroïdes, ce problème a été contourné en évaluant la mort cellulaire dans une région annulaire périphérique générée par le module de segmentation d’image intégré du logiciel en étendant le noyau sphéroïde bien défini. Le facteur d’expansion définissant la limite extérieure de cette zone a été choisi pour englober la pénombre de cellules mourantes, déchiquetées et dispersées dans tous les cas après avoir organisé visuellement des centaines d’images sphéroïdales. La détermination de la fluorescence totale de l’aire de l’anneau apoptotique dans les projections maximales des images de la pile Z a donné des erreurs expérimentales plus faibles et un effet ADCC plus prononcé que la mesure de l’ensemble de la zone sphéroïde ou de toute la zone du puits (Figure supplémentaire S2). Des étiquettes fluorescentes ont été choisies pour marquer les cellules BC (EGFP) et détecter la mort cellulaire (Alexa 647) afin d’éviter un besoin de séparation des canaux. On a opté pour une lecture du point final basée sur le marquage fluorescent de la phosphatidylsérine exposée, un marqueur apoptotique, plutôt que sur la surveillance de la diminution de la fluorescence de l’EGFP pour déterminer la viabilité des sphéroïdes au fil du temps, ce qui pourrait être une autre option. La coloration à l’annexine a permis une identification plus précise et plus sensible de la mort cellulaire. En principe, il est possible d’améliorer l’approche actuelle de coloration unidimensionnelle en la complétant par des marqueurs de mort cellulaire supplémentaires plus précis qui peuvent identifier la modalité de mort cellulaire (par exemple, les substrats de caspase fluorescents) et le type de cellule périe.
Cette méthode peut être modifiée avec des modifications minimales pour étudier d’autres types de cellules immunitaires effectrices (macrophages, lymphocytes T et cellules immunitaires exprimant le récepteur antigénique chimérique [CAR]) et des molécules activatrices (par exemple, cytokines, interleukines). Dans un souci de simplicité, de robustesse et de temps de traitement court, nous n’avons pas épuisé les possibilités que HCA peut offrir pour ce test. Les protocoles d’imagerie et d’analyse peuvent être ajoutés à d’autres marqueurs fluorescents. Ce test est adaptable pour étudier des sphéroïdes plus complexes en ajoutant différents types de cellules et en utilisant des sondes fluorescentes multiplexées pour distinguer ces types de cellules et des marqueurs fluorescents spécifiques pour les relier aux événements cellulaires en cours 4,5. Le protocole peut être adapté à n’importe quel imageur HC et les images peuvent être analysées avec n’importe quel logiciel d’analyse d’images intégrant un module d’analyse de texture.
L’aspect clé de l’importance de ce protocole est l’utilisation de sphéroïdes. Par conséquent, un certain nombre de paramètres doivent être pris en compte. On sait que les cellules en culture 3D présentent une réponse atténuée aux composés par rapport aux cellules cultivées en monocouches21,22. L’utilisation de cultures cellulaires 2D ne permet pas de prédire la plage efficace des concentrations d’un agent testé dans l’ensemble de l’organisme. Lors de la mise en place de notre modèle 3D, nous avons testé des concentrations de composés et des rapports E :T plus élevés que ceux rapportés en 2D. Par exemple, le protocole a été optimisé en augmentant le rapport E :T de 2 :1 utilisé dans notre test ADCC2D 17, à 20 :1 pour les sphéroïdes cancéreux. La raison derrière cela pourrait être que les médicaments étaient incapables de pénétrer efficacement dans le noyau des sphéroïdes et affectaient principalement les cellules des couches externes. D’autre part, l’augmentation de la concentration de trastuzumab n’a pas amélioré davantage la réponse de l’ADCC (figure supplémentaire S1). Cette sélection peut différer selon les lignées cellulaires et la cible. Ainsi, il serait intéressant de tester ce protocole sur d’autres lignées cellulaires, par exemple une lignée cellulaire non-HER2 BC, en tenant compte du fait que le niveau d’expression de HER2 est un déterminant important de la réponse ADCC20.
En résumé, notre nouvelle méthode représente une plate-forme rapide et robuste pour analyser l’effet des composés dans un modèle 3D de cancer immunitaire avec le potentiel d’être utilisé pour le criblage de médicaments à haut débit. Cela souligne la pertinence de l’utilisation des sphéroïdes HER2+ BC et NK92. CD16 dans l’amélioration de la compréhension des mécanismes moléculaires du trastuzumab, offrant ainsi l’opportunité d’anticiper l’efficacité de l’ADCC dépendant du trastuzumab dans le potentiel thérapeutique in vivo27. La recherche de nouveaux modulateurs immunitaires anti-tumoraux peut grandement bénéficier de ce test. La méthode peut être étendue à des tests de chimiosensibilité personnalisés de cultures de cellules tumorales dérivées de patients. Nous avons démontré que les co-cultures 2D traditionnelles utilisées dans les tests de destruction des cellules immunitaires et d’ADCC peuvent être converties en tests sphéroïdes 3D, ce qui augmente potentiellement leur pertinence translationnelle.
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Disclosures
Les auteurs n’ont déclaré aucun conflit d’intérêts.
Acknowledgments
LV a reçu un financement de l’Office national de la recherche, du développement et de l’innovation des subventions GINOP-2.3.2-15-2016-00010 TUMORDNS", GINOP-2.3.2-15-2016-00048-STAYALIVE, OTKA K132193 et K147482. Ce projet a reçu un financement du réseau de recherche hongrois HUN-REN. Les cellules CD16.176V.NK-92 ont été obtenues auprès du Dr Kerry S. Campbell (Fox Chase Center, Philadelphie, Pennsylvanie, pour le compte de Brink Biologics, lnc. San Diego, CA), sont protégés par des brevets dans le monde entier et ont été licenciés par Nantkwest, lnc. (www.nantkwest.com). Les auteurs remercient György Vereb et Árpád Szöőr pour leur aide dans l’utilisation de la lignée cellulaire NK-92 et de la lignée TR-F(ab')2, ainsi que pour leurs conseils techniques.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 96-well glass bottom Cell Carrier Ultra microplates | PerkinElmer, Waltham, MA, USA | LLC 6055302 | for spheroids measurements |
| 96-well tissue culture plates | TPP | 92096 | for cell seeding |
| α-MEM medium | Sigma | M8042 | in NK medium |
| Agarose | Sigma | A9539 | for spheroids seeding |
| Annexin V-Alexa Fluo 647 conjugate | Invitrogen-ThermoFisher Scientific | A23204 | for apoptosis measurement with HCS |
| CD16.176 V.NK-92 cells | Dr. Kerry S. Campbell (the Fox Chase Cancer Center, Philadelphia, PA on behalf of Brink Biologics, Inc. San Diego, CA) | ATCC CRL-2407 | for cell culture |
| Cell Tracker Blue | Invitrogen-Thermo Scientific, Waltham, MA, USA) | C2110 | for staining of NK cells |
| DMEM/F-12 medium | Sigma | D8437 | in JIMT1-EGFP medium |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma | D8418 | for coating HCS plate before transfering the spheroids |
| Fetal bovine serum (FBS) | Biosera | FB-1090/500 | JIMT-1-EGFP and NK medium |
| Glutamine | Gibco | 35,050–061 | in NK medium |
| GraphPad Prism 8.0.1 | GraphPad Software Inc., San Diego, CA, USA | for statistical analysis | |
| Harmony software | PerkinElmer, Waltham, MA, USA | for HCA | |
| IL-2 | Proleukin, Novartis Hungária Kft., Budapest, Hungary | PHC0026 | in NK medium |
| Insulin (Humulin R) | Eli Lilly | HI0219 | JIMT-1-EGFP medium |
| JIMT-1 breast cancer cells | for cell culture | ||
| MEM Non-essential Amino Acids (MEM-NEAA) | Gibco | 11,140–050 | in NK medium |
| Na-pyruvate | Lonza | BE13-115E | in NK medium |
| Opera Phenix High-Content Analysis equipment | PerkinElmer, Waltham, MA, USA | HH14001000 | for HCA |
| PBS (Posphate buffered saline) | Lonza | BE17-517Q | for washing the cells |
| Penicillin-Streptomycin | Biosera | LM-A4118 | JIMT-1-EGFP and NK medium |
| pLP-1, pLP-2, pLP-VSV-G, pWOXEGFP | Invitrogen, (Prof. József T zsér, University of Debrecen) |
for JIMT-1-EGFP cell line | |
| Pluronic-F127 | Sigma | P2443 | for coating HCS plate before transfering the spheroids |
| Sunitinib malate | SigmaAldrich | PZ0012 | for treatments |
| Trastuzumab Ab (humanized anti-HER2 monoclonal antibody) | Herzuma®, EGIS Pharmaceuticals, Budapest, Hungary | NDC-63459-303-43 | for treatments |
| Trastuzumab-F(ab')2 | Gift from Prof. György Vereb and Árpád Ször |
Department of Biophysics and Cell Biology, University of Debrecen | for treatments |
| Trypan blue 0.4% solution | Sigma | T8154 | for cell counting |
| Trypsin-EDTA 1X in PBS | Biosera | LM-T1706 | for cells detachment |
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