Enregistrement de l’intégrité fonctionnelle de la barrière sur les cellules endothéliales vasculaires bEnd.3 via la détection de résistance électrique transendothéliale
Summary
Ce protocole décrit un modèle in vitro fiable et efficace de la barrière hémato-encéphalique. La méthode utilise des cellules endothéliales vasculaires cérébrales de souris bEnd.3 et mesure la résistance électrique transmembranaire.
Abstract
La barrière hémato-encéphalique (BHE) est une structure physiologique dynamique composée de cellules endothéliales microvasculaires, d’astrocytes et de péricytes. En coordonnant l’interaction entre le transit restreint des substances nocives, l’absorption des nutriments et la clairance des métabolites dans le cerveau, la BHE est essentielle à la préservation de l’homéostasie du système nerveux central. La construction de modèles in vitro de la BHE est un outil précieux pour explorer la physiopathologie des troubles neurologiques et créer des traitements pharmacologiques. Cette étude décrit une procédure de création d’un modèle de cellules monocouches de BHE in vitro en ensemencant des cellules bEnd.3 dans la chambre supérieure d’une plaque à 24 puits. Pour évaluer l’intégrité de la fonction de barrière cellulaire, le voltmètre de cellules épithéliales conventionnel a été utilisé pour enregistrer en temps réel la résistance électrique transmembranaire des cellules normales et des cellules hypoxiques induites par la CoCl2. Nous prévoyons que les expériences ci-dessus fourniront des idées efficaces pour la création de modèles in vitro de BHE et de médicaments pour traiter les troubles des maladies du système nerveux central.
Introduction
La BHE est une interface biologique unique entre la circulation sanguine et le tissu nerveux, qui est composée de cellules endothéliales vasculaires, de péricytes, d’astrocytes, de neurones et d’autres structures cellulaires1. Le flux d’ions, de produits chimiques et de cellules entre le sang et le cerveau est strictement régulé par cette barrière. Cette homéostasie protège les tissus nerveux contre les toxines et les agents pathogènes tout en permettant le bon fonctionnement des nerfs du cerveau 2,3. Le maintien de l’intégrité de la BHE peut prévenir efficacement le développement et la progression de troubles affectant le système nerveux central, tels que le dysfonctionnement neuronal, l’œdème et la neuroinflammation4. Cependant, les propriétés physiologiques uniques de la BHE empêchent plus de 98 % des médicaments à petites molécules et 100 % des produits pharmaceutiques macromoléculaires de pénétrer dans le système nerveux central5. Par conséquent, il est essentiel d’augmenter la pénétration des médicaments à travers la BHE pendant le développement des médicaments pour le système nerveux central afin d’atteindre l’efficacité thérapeutique 6,7. Même si le criblage des substrats par simulation informatique a considérablement augmenté la probabilité que les candidats-médicaments franchissent la BHE, des modèles de BHE in vitro/in vivo fiables et abordables sont encore nécessaires pour répondre aux besoins de la recherche scientifique8.
Une technique rapide et abordable pour le criblage de médicaments à haut débit est le modèle9 in vitro. Pour faire la lumière sur les processus fondamentaux des effets des médicaments sur la fonction de la BHE et leur rôle dans le développement et la progression de la maladie, une série de modèles de BHE in vitro simplifiés a été créée. À l’heure actuelle, les modèles de BHE in vitro courants sont les modèles monocouches, de coculture, dynamiques et microfluidiques 10,11,12, construits par des cellules endothéliales vasculaires et des astrocytes, des péricytes ou des microglies 13,14. Bien que les cultures cellulaires 3D soient plus conformes à la structure physiologique de la BHE15, leur application en tant que moyen de criblage de médicaments pour la BHE est encore limitée par leur conception complexe et leur reproductibilité médiocre. En revanche, le modèle in vitro monocouche est celui qui est le plus fréquemment utilisé pour la recherche sur la BHE et est applicable pour déterminer l’expression des transporteurs membranaires et des protéines à jonction serrée dans des cellules particulières.
La mesure de la résistance électrique transmembranaire (TEER) est une technique permettant d’évaluer et de surveiller la couche de cellules à travers la résistance et d’évaluer l’intégrité cellulaire et la perméabilité de la barrière. En insérant simultanément deux électrodes dans le milieu de culture ou la solution tampon de part et d’autre de la monocouche, il est possible de mesurer le courant alternatif ou l’impédance électrique à travers la couche compacte de la cellule16,17. Afin de déterminer si le modèle de la BHE in vitro a été correctement créé, la mesure de l’ETER sera généralement utilisée comme étalon-or18. D’autre part, la tendance de l’action des médicaments sur la perméabilité de la BHE peut être prédite avec précision en mesurant le changement de résistance électrique de la couche cellulaire après l’implication du médicament19. Par exemple, Feng et al. ont découvert que le catalpol (le principal monomère actif de rehmanniae) pouvait effectivement inverser la régulation négative induite par les lipopolysaccharides des protéines à jonction serrée dans la BHE et augmenter la valeur TEER de la couche20 de cellules endothéliales du cerveau de souris.
La réponse neuro-inflammatoire est généralement la principale cause du déséquilibre de l’homéostasie de la BHE21. Le traitement hypoxique pour induire des lésions neuro-inflammatoires est la principale méthode pour détruire la barrière hémato-encéphalique, comprenant principalement des méthodes physiques et des méthodes de réactifs chimiques. Le premier utilise principalement un incubateur à trois gaz pour faire varier la teneur en oxygène dans l’environnement de croissance cellulaire afin de simuler des conditions hypoxiques22, tandis que le second est obtenu en introduisant artificiellement des réactifs désoxy tels que CoCl2 dans le milieu de culture cellulaire23. Les cellules resteront dans un état désoxygéné si le Fe2+ est substitué au Co2+ dans l’hème. Si le Fe2+ est substitué au Co2+ dans le groupe catalytique, l’activité de la proline hydroxylase et de l’aspartate hydroxylase sera inhibée, ce qui entraînera une accumulation de facteur 1α inductible par l’hypoxie (HIF-1α)24. En cas d’hypoxie persistante, la déphosphorylation de HIF-1α dans le cytoplasme déclenche la mort cellulaire et active le facteur de croissance de l’endothélium vasculaire, ce qui augmente finalement la perméabilité vasculaire. Dans des études antérieures25,26, il a été bien démontré que l’hypoxie peut réduire considérablement l’expression des protéines de jonction serrée endothéliale pour augmenter la perméabilité de la BHE. Dans cette étude, la courbe de résistance temporelle des cellules bEnd.3 ensemencées dans des plaques à 24 puits a été mesurée afin de créer un modèle BHE simple. À l’aide de ce modèle, nous avons caractérisé les changements dans le TEER cellulaire après l’intervention de CoCl2 afin de construire un modèle cellulaire qui peut être utilisé pour cribler les médicaments pour la protection contre la BHE.
Protocol
Representative Results
Discussion
L’un des organes corporels les plus développés, le cerveau contrôle un large éventail de processus physiologiques complexes, notamment la mémoire, la cognition, l’ouïe, l’odorat etle mouvement. Le cerveau est à la fois l’un des organes les plus compliqués et les plus malades du corps humain. L’apparition de nombreux troubles du système nerveux central montre une tendance croissante d’année en année en raison de facteurs tels que la pollution de l’air, les habitudes aliment…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nous apprécions le soutien financier de la Fondation nationale des sciences naturelles de Chine (82274207 et 82104533), du programme clé de recherche et de développement du Ningxia (2023BEG02012) et du projet de promotion de la recherche Xinglin Scholar de l’Université de Chengdu de MTC (XKTD2022013).
Materials
| 24-well transwell plate | Corning (Corning 3470, 0.33 cm2, 0.4 µm) | 10522023 | |
| 75 % ethanol | ChengDu Chron Chemicals Co,.Ltd | 2023052901 | |
| 96-well plate | Guangzhou Jet Bio-Filtration Co., Ltd | 220412-078-B | |
| bEnd.3 cells | Hunan Fenghui Biotechnology Co., Ltd | CL0049 | |
| Cell counting kit-8 (CCK-8) | Boster Biological Technology Co., Ltd | BG0025 | |
| Cell culture dish (100mm) | Zhejiang Sorfa Life Science Research Co., Ltd | 1192022 | |
| Cobalt Chloride (CoCl2) | Sigma | 15862 | |
| DMSO | Boster Biological Technology Co., Ltd | PYG0040 | |
| Dulbecco's modified eagle medium (1x) | Gibco ThermoFisher Scientific | 8121587 | |
| Fetal bovine serum | Gibco ThermoFisher Scientific | 2166090RP | |
| GraphPad Prism software | GraphPad Software | 9.0.0(121) | |
| Matrigel (Contains collagen IV) | MedChemexpress | HY-K6002 | |
| Microplate reader | Molecular Devices | SpectraMax iD5 | |
| OriginPro 8 software | OriginLab Corporation | v8.0724(B724) | |
| Penicillin-Streptomycin (100x) | Boster Biological Technology Co., Ltd | 17C18B16 | |
| Phosphate buffered saline (PBS, 1x) | Gibco ThermoFisher Scientific | 8120485 | |
| Sodium hypochlorite | ChengDu Chron Chemicals Co,.Ltd | 2022091501 | |
| Transmembrane resistance meter | World Precision Instruments LLC | VOM3 (verison 1.6) | |
| Trypsin 0.25% (1x) | HyClone | J210045 |
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